Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), con un numero di sovvenzione IT200819. Gli autori riconoscono a Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, di aver controllato la grammatica inglese di questo manoscritto; e l'assistenza tecnica di Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) e Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Ringraziamo anche il Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) per aver ottenuto sangue di pecora. Ringraziamo in particolare il Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, per le strutture nel suo laboratorio per la registrazione video.

Gli anemoni di mare sono stati raccolti secondo le linee guida della Commissione nazionale per l'acquacoltura, la pesca e l'alimentazione del governo federale del Messico (numero di permesso PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Il Comitato di Bioetica dell'Istituto di Biotecnologia, Università Nazionale Autonoma del Messico ha approvato tutti gli esperimenti con gli anemoni di mare. Il campione di sangue di pecora è stato acquistato presso il Centro per l'insegnamento pratico e la ricerca nella produzione e la salute anima...

<ol>
	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. 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L'elevata domanda di nuovi composti con applicazioni in diversi campi della scienza e dell'industria ha portato allo studio del veleno. Il veleno rappresenta una ricca fonte di molecole che funge da modello per la generazione di nuovi strumenti molecolari. Tuttavia, la complessità di questi veleni richiede l'implementazione e la combinazione di vari metodi per ottenerli e studiarli.
Qui, mostriamo un metodo per ottenere e analizzare il veleno dell'anemone di mare Anthopleura dowii, V...

Gli animali marini sono una ricca fonte di composti biologicamente attivi. Negli ultimi decenni, la composizione del veleno di anemone di mare ha attirato l'attenzione scientifica poiché comprende una varietà di polipeptidi con attività emolitica, citotossica, enzimatica (fosfolipasi, proteasi, chitinasi) e neurotossica ed effetti inibitori sull'attività proteolitica1. Inoltre, questi polipeptidi sono potenziali fonti per lo sviluppo di strumenti molecolari nell'uso biotecnologico e terapeutico 2,3.
Ci sono poche segnalazioni sul veleno di anemone di mare e sui suoi componenti molecolari a causa della complessità di ottenere il veleno, persino l'isolamento e la caratterizzazione delle tossine. I metodi di estrazione utilizzati nei rapporti prevedevano la lisi e lo svuotamento del contenuto delle cellule che sono correlate e non correlate alla produzione di veleno1.
Una caratteristica particolare in tutti gli cnidari è l'assenza di un sistema per la produzione e il rilascio del veleno centralizzato in un'unica regione anatomica. Invece, le nematocisti sono strutture che mantengono il veleno 4,5. Altri tipi di cellule, chiamate cellule della ghiandola epidermica, secernono anche tossine e sono anche distribuite in tutto il corpo degli anemoni di mare6.
La prima e più cruciale sfida nell'ottenere il veleno è la generazione di un estratto con sufficiente manipolazione nei processi successivi, senza l'inattivazione o la degradazione delle proteine labili. Successivamente, le cellule devono essere lisate e i componenti, in questo caso, i polipeptidi devono essere estratti in modo efficiente e rapido, evitando la proteolisi e l'idrolisi mentre si eliminano altri componenti cellulari7.
Diversi metodi sono utilizzati per ottenere l'estratto grezzo di un anemone di mare; alcuni implicano il sacrificio dell'organismo mentre altri permettono che sia mantenuto in vita. I metodi che implicano l'uso di tutto il corpo dell'organismo consentono il rilascio della maggior parte delle tossine dal veleno8, rispetto ai metodi che mantengono in vita gli organismi, che estraggono solo alcuni componenti del veleno9. La preparazione di un estratto richiede la valutazione della presenza e della potenza di una sostanza di interesse attraverso uno specifico biodosaggio, che include strategie per osservare gli effetti farmacologici con metodi in vivo o in vitro 10.
Il veleno di anemoni di mare contiene polipeptidi citolitici, tossine che formano pori (PFT)11 e fosfolipasi12; queste molecole sono modelli nello studio dell'interazione proteina-lipidi, strumenti molecolari nella terapia del cancro e biosensori basati su nanopori3. La classificazione dei PFT di anemoni di mare viene effettuata in base alle loro dimensioni o peso molecolare, da 5 kDa a 80 kDa. Il PFT da 20 kDa, il più studiato e conosciuto come actinoporine11, è di particolare interesse per il suo potenziale biomedico nello sviluppo di strumenti molecolari per possibili applicazioni come biosensori antitumorali, antimicrobici e basati su nanopori. Un'altra citolisina, comprese le fosfolipasi, in particolare la fosfolipasi A2 (PLA2)13, rilascia un acido grasso dovuto e idrolizza i fosfolipidi, destabilizzando la membrana cellulare. Grazie a questo meccanismo d'azione, PLA2 promette di essere un modello essenziale per lo studio e le applicazioni nelle malattie infiammatorie. Potrebbe servire come modello per gli studi sul comportamento lipidico nella membrana cellulare14.
Qui, descriviamo un protocollo efficiente per ottenere l'estratto grezzo dall'anemone di mare Anthopleura dowii Verrill, 1869, e rilevare emolisine e fosfolipasi. Entrambe sono tossine rilevanti che potrebbero essere utilizzate come modello per progettare nuovi strumenti molecolari.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

La composizione del veleno di anemone di mare comprende molecole polipeptidiche e non proteiche. I componenti citolitici hanno un elevato potenziale biotecnologico e biomedico per la progettazione di nuovi strumenti molecolari. Il veleno di anemoni di mare si trova nelle cellule ghiandolari dell'ectoderma e delle strutture subcellulari chiamate nematocisti, entrambe distribuite in tutto il corpo dell'anemone marino. Questa caratteristica implica sfide perché le cellule e la nematocisti devono essere lisate per rilasciare i componenti del veleno con altre molecole non tossiche. Pertanto, in primo luogo, il veleno è derivato da un estratto grezzo (miscela di molecole diverse e diverse e detriti tissutali). Il prossimo passo è rilevare polipeptidi con bioattività specifiche. Qui, descriviamo una strategia efficiente per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare e il biotest per identificare la presenza di citolisine. Il primo passo prevede tecniche economiche e semplici (ciclo agitato e congelamento-disgelo) per rilasciare citolisine. Abbiamo ottenuto la più alta attività citolitica e proteina (~ 500 mg di proteine da 20 g di peso secco). Successivamente, la complessità polipeptidica dell'estratto è stata analizzata dal gel SDS-PAGE rilevando proteine con pesi molecolari compresi tra 10 kDa e 250 kDa. Nel test emolitico, abbiamo utilizzato globuli rossi di pecora e determinato HU50 (11,1 ± 0,3 μg / mL). Al contrario, la presenza di fosfolipasi nell'estratto grezzo è stata determinata utilizzando il tuorlo d'uovo come substrato in un mezzo solido con agarosio. Nel complesso, questo studio utilizza un protocollo efficiente ed economico per preparare l'estratto grezzo e applica biotest replicabili per identificare citolisine, molecole con interessi biotecnologici e biomedici.

I risultati rappresentativi del protocollo utilizzato per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare hanno mostrato che la combinazione di due tecniche (agitazione e cicli di congelamento e scongelamento) produceva uno scarico efficiente di nematocisti e la quantità totale di proteine era di 500 mg (8 mg / mL) (Figura 3).
La complessità proteica dell'estratto grezzo potrebbe essere osservata da 10 kDa e superiore a 250 kDa attraverso l'elettroforesi SDS-PAGE....

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Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Qui, descriviamo un protocollo per ottenere l'estratto di veleno grezzo dall'anemone di mare e rilevare la sua attività emolitica e fosfolipasi.

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

L'interazione della tossina anemone di mare deve utilizzare il minor numero di organismi e protocolli efficienti per ottenere una grande diversità e abbondanza delle tossine e una rapida identificazione di una tossina specifica. Abbiamo combinato due tecniche efficienti per preparare l'estratto grezzo con un'elevata quantità di proteine e descrivere saggi riproducibili, specifici, veloci e poco costosi per identificare l'emolisi e le basi fostoliche nel veleno di anemone di mare. Il metodo può essere utilizzato in quasi tutti gli esempi che si decide di identificare uno o entrambi i tipi di citolisine.L'efficienza del metodo si ottiene curando i tempi in ogni fase durante la preparazione dell'estratto grezzo. La chiave per l'emolisi è un'attenta manipolazione dell'eritrocita per evitare la lisi meccanica e, nel test di fosfolisi, prendendosi cura della temperatura nella preparazione della piastra. A dimostrare la procedura saranno il Dr.Santos Ramirez-Carreto, la biologa Sandra Salazar Garcia e il biologo Giovanni Macias Martinez del mio laboratorio.Inizia pulendo l'anemone di mare raccolto A.doi con acqua distillata a mano per rimuovere le grandi particelle di substrato che aderiscono al corpo. Congelare immediatamente gli organismi a meno 80 gradi Celsius in un ultragelatore per 72 ore. Quindi, posizionare gli organismi in bicchieri speciali per la liofilizzazione con condizioni di liofilizzazione per 48 ore.Per l'idratazione dei tessuti, ricostituire 20 grammi di peso secco di organismi liofilizzati con 60 millilitri di tampone fosfato di sodio 50 millimolare e una compressa di cocktail inibitore. In un agitatore magnetico, mescolare continuamente il campione a circa 800 RPM e quattro gradi Celsius per 12 ore. Dopo aver congelato il campione a meno 20 gradi Celsius per 12 ore per indurre la lisi cellulare e lo scarico di nematocisti, posizionare il contenitore in acqua a temperatura ambiente fino a quando non si scongela fino al 90%Ripetere questa procedura tre volte.Per chiarire l'estratto, centrifugare il campione a 25, 400 volte G per 40 minuti a quattro gradi Celsius. Recuperare il surnatante e centrifugarlo di nuovo. Ripeti il passaggio tre o quattro volte e recupera finalmente il surnatante.Il surnatante recuperato o estratto grezzo contiene i componenti del veleno e altre molecole cellulari come lipidi, carboidrati e acidi nucleici. Determinare la concentrazione proteica dell'estratto grezzo utilizzando un kit di analisi colorimetrica Bradford commerciale. Incubare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente senza agitare.Quindi, misurare l'assorbanza a 595 nanometri. Traccia le medie delle assorbanze BSA del campione e determina l'equazione del grafico dove y è l'assorbanza, m è la pendenza della linea, x è la concentrazione proteica e b è l'ordinata all'origine. Per analizzare l'estratto grezzo, aggiungere 30 microgrammi di estratto grezzo a cinque microlitri del tampone di carico proteico per denaturare le proteine.Il volume finale deve essere inferiore a 50 microlitri. Eseguire l'elettroforesi a 25 milliampere costanti per un'ora e 30 minuti. Per evitare la diffusione delle proteine del gel, aggiungere la soluzione di fissazione alle proteine e incubare a temperatura ambiente per 40 minuti con agitazione a 80 RPM.Quindi, decantare la soluzione e aggiungere la soluzione di reticolazione proteica. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente con agitazione a 80 RPM. Rimuovere la soluzione e lavare il gel con 100 millilitri di acqua distillata per cinque minuti.Successivamente, rimuovere l'acqua e ripetere questa procedura quattro volte. Effettuare la colorazione proteica con 50 millilitri di soluzione filtrata Coomassie Brilliant Blue R-250 mescolando a 60 RPM in un oscillatore rotativo da laboratorio a temperatura ambiente per 15 minuti. Estrarre un millilitro di sangue dalla vena giugulare di una pecora e rimuovere l'ago dalla siringa.Scaricare immediatamente il sangue in un tubo con 50 millilitri di soluzione di Alsever e centrifugare a 804 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e aggiungere 30 millilitri di soluzione Alsever facendolo scorrere lungo le pareti interne del tubo. Risospese lentamente il pellet utilizzando una pipetta di plastica Pasteur e centrifugare nuovamente la soluzione a 804 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Ripetere questa procedura fino a quando il surnatante non è chiarito. Mantenere il volume finale della soluzione Alsever per raggiungere una concentrazione di circa 2 milioni di cellule per millilitro. Quindi, utilizzare una camera Neubauer o un emocitometro per contare le cellule.Incubare le miscele di soluzioni per un'ora a 37 gradi Celsius senza agitare e quindi centrifugare la piastra a 804 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Recuperare il surnatante in un'altra piastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Se l'estratto grezzo contiene citolisine, gli eritrociti lisi e rilasciano emoglobina.Leggi l'assorbanza a 415 nanometri e calcola la quantità di estratto che produce l'emolisi nel 50% degli eritrociti. Aumentare la quantità di estratto grezzo di anemone di mare e progettare la trama con regolazioni sigmoidali utilizzando un software appropriato. Lavare un uovo di gallina con l'1% di SDS in acqua distillata e separare il tuorlo d'uovo dall'albume in condizioni sterili.Preparare le soluzioni A, B, C e D.Aggiungere 500 microlitri di soluzioni A e C alla soluzione B e 100 microlitri di soluzione D.Mescolarli e versare 25 millilitri in ogni capsula di Petri. Attendere che la soluzione si solidifichi in condizioni sterili e realizzare pozzetti di circa due o tre millimetri di diametro con un tubo sottile. Aggiungere un totale di 20 microlitri di tampone fosfato come controllo negativo in un pozzetto e 20 microlitri di una determinata fosfolipasi come controllo positivo in un altro pozzo.Posizionare diverse quantità di proteine dell'estratto grezzo 5, 15, 25, 35 e 45 microgrammi nei pozzetti rimanenti, ciascuno in un volume finale di 20 microlitri. Incubare a 37 gradi Celsius per 20 ore. I risultati rappresentativi del protocollo utilizzato per ottenere l'estratto grezzo di anemone di mare hanno dimostrato che la combinazione di due tecniche, agitazione e cicli di congelamento e scongelamento, ha prodotto uno scarico efficiente di nematocisti.I nematociti prima e dopo gli stimoli sono mostrati qui. Il tubulo di nematocisti è esposto in questa immagine, indicando il rilascio di tossine. Il profilo elettroforetico dell'estratto grezzo di anemone di mare è mostrato qui.L'estratto grezzo di anemone di mare è stato analizzato da SDS-PAGE 15% poliacrilammide gel e ha mostrato proteine da 10 kilodalton a 250 kilodalton di peso molecolare. Qui, la corsia 1 è la scala proteica e la corsia 2 è il veleno di anemoni di mare. Le citolisine sono state rilevate nella zona di peso molecolare di 15 kilodalton e 20 kilodalton.Qui è mostrato il test di emolisi negli eritrociti delle pecore. L'attività emolitica dell'estratto prima e durante i cicli di congelamento e scongelamento è aumentata fino a raggiungere l'emolisi al 100% con 50 microgrammi della proteina totale dell'estratto grezzo negli ultimi due cicli. La quantità necessaria per lisare il 50% degli eritrociti di pecora è di 11,1 0,3 microgrammi per millilitro.L'attività della fosfolipasi è stata rilevata dalla formazione di aloni chiari nelle aree della piastra di agar in cui è stato applicato il campione di estratto grezzo. I risultati mostrano la presenza di attività fosfolipasi da 15 microgrammi di proteine totali. Il diametro dell'alone è aumentato in modo dose-dipendente;cioè, se la quantità di estratto grezzo è aumentata, il diametro dell'alone è aumentato.Durante il tentativo di procedura, assicurarsi di indurre lo scarico di nematocisti, quantificare la proteina totale, analizzare l'estratto grezzo mediante elettroforesi SDS-PAGE, calcolare la quantità di proteine dell'estratto grezzo per produrre il 50% di emolisi e utilizzare diverse quantità di proteine nel saggio della fosfolipasi. Possiamo analizzare l'estratto grezzo con tecnica proteomica per identificare polipeptidi di grande rilevanza in biotecnologia e biomedicina, anche profilare e caratterizzare una molecola unica per poi produrla in laboratorio per un'applicazione. Abbiamo ottenuto parte della sequenza di una proteina performante con attività antitumorale nelle cellule epiteliali del carcinoma polmonare ostinato umano.Allo stesso modo, identifichiamo la sequenza di fosfolipasi di interesse biotecnologico.

Research

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Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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