Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

이 작품은 Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT)에 의해 지원되었으며, 보조금 번호 IT200819가 있습니다. 저자는이 원고의 영어 문법을 확인하기 위해 Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC에게 인정합니다. Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada)와 Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM)의 기술 지원. 우리는 또한 양의 피를 얻은 Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) 박사에게 감사드립니다. 우리는 특히 ICAT-UNAM의 José Saniger Blesa박사에게 비디오 녹화를 위한 실험실의 시설에 대해 감사드립니다.

바다 말미잘은 멕시코 연방 정부의 양식, 수산 및 식품에 대한 국가위원회의 지침에 따라 수집되었습니다 (허가 번호 PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). 멕시코 국립 자치 대학 생명 공학 연구소의 생명 윤리위원회는 바다 말미잘을 이용한 모든 실험을 승인했습니다. 양 혈액 샘플은 동물 생산 및 건강 실무 교육 및 연구 센터 (CEPIPSA, 멕시코 국립 자치 대학)에서 구입했습니다.
1. 유...

<ol>
	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+toxins:+recent+evidences+for+potential+therapeutic+uses.">Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses.</a> The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodr&#237;guez-Almaz&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinoporins:+From+the+structure+and+function+to+the+generation+of+biotechnological+and+therapeutic+tools.">Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools.</a> Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).</li><li>Fautin, D. 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Toxicon.</a> Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+soluble+protein+contents+from+the+nematocysts+of+a+model+sea+anemone+sheds+light+on+venom+evolution.">Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution.</a> Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxin+localization+to+ectodermal+gland+cells+uncovers+an+alternative+mechanism+of+venom+delivery+in+sea+anemones.">Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).</li><li>Grabski, A. 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C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+a+venom+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+cavernata.">Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).</li><li>Morales-Landa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+antiprotozoal,+and+toxic+activities+of+Cnidarian+extracts+from+the+Mexican+Caribbean+Sea.">Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea.</a> Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).</li><li>S&#225;nchez-Rodr&#237;guez, J., Cruz-Vazquez, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+biological+characterization+of+neurotoxic+compounds+from+the+sea+anemone+Lebrunia+danae+(Duchassaing+and+Michelotti,+1860).">Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860).</a> Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).</li><li>de Oliveira, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caissarolysin+I+(Bcs+I),+a+new+hemolytic+toxin+from+the+Brazilian+sea+anemone+Bunodosoma+caissarum:+purification+and+biological+characterization.">Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).</li><li>Norton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crude+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+caissarum+elicits+convulsions+in+mice:+possible+involvement+of+the+glutamatergic+system.">The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).</li><li>Dion, A. S., Pomenti, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+lipids+of+sheep+red+blood+cells.+I.+Lipid+composition+in+low+and+high+potassium+red+cells.">Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells.</a> Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+and+proteomic+analysis+of+the+tentacles+and+mucus+of+Anthopleura+dowii+Verrill,+1869.">Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869.</a> Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).</li></ol>

과학 및 산업의 다른 분야에서 응용 프로그램과 새로운 화합물에 대한 높은 수요는 독의 연구로 이어졌다. Venom은 새로운 분자 도구를 생성하기위한 주형 역할을하는 풍부한 분자 공급원을 나타냅니다. 그러나 이러한 독의 복잡성은 그것들을 얻고 연구하기 위해 다양한 방법의 구현과 조합을 필요로합니다.
여기에서, 우리는 동결건조된 표본으로 시작하여 다른 바다 말미잘?...

해양 동물은 생물학적 활성 화합물의 풍부한 공급원입니다. 최근 수십 년 동안, 바다 말미잘독의 조성은 용혈성, 세포독성, 효소적(포스포리파제, 프로테아제, 키티나제) 및 단백질 분해 활성에 대한 신경독성 활성 및 억제 효과를 갖는 다양한 폴리펩티드를 포함하기 때문에 과학적인 관심을 끌었다1. 또한, 이들 폴리펩티드는 생명공학 및 치료적 용도2,3에서 분자 도구의 개발을 위한 잠재적 공급원이다.
바다 말미잘독과 그 분자 성분에 대한 보고는 거의 없는데, 이는 독을 얻는 복잡성, 심지어 독소의 분리 및 특성화로 인한 것이다. 보고서에 사용 된 추출 방법은 독 생산과 관련이 있고 관련이없는 세포의 내용물을 용해시키고 비우는 것을 포함했습니다1.
모든 cnidarians의 특별한 특징은 단일 해부학 적 영역에 집중 된 독의 생산 및 방출을위한 시스템이 없다는 것입니다. 대신, 선충류는 독 4,5를 유지하는 구조입니다. 표피선 세포라고 불리는 다른 유형의 세포도 독소를 분비하며 바다 말미잘6의 몸 전체에 분포합니다.
독을 얻는 데있어 첫 번째이자 가장 중요한 도전은 불안정한 단백질의 불활성화 또는 분해없이 후속 과정에서 충분한 조작을 가진 추출물을 생성하는 것입니다. 다음에, 세포는 용해되어야 하고, 성분-이 경우, 폴리펩티드는 효율적이고 신속하게 추출되어야 하며, 단백질 분해 및 가수분해를 피하면서 다른 세포 성분(7)을 제거해야 한다.
바다 말미잘의 조추출물을 얻기 위해 상이한 방법이 사용된다; 일부는 유기체를 희생시키는 것을 포함하고 다른 일부는 유기체가 살아 있도록 허용합니다. 유기체의 전신의 사용을 암시하는 방법은 독9의 일부 구성 요소 만 추출하는 유기체를 살아 있게 유지하는 방법과 비교하여 독8에서 대부분의 독소를 방출 할 수 있습니다. 추출물의 제조는 생체내 또는 시험관내 방법(10)에 의해 약리학적 효과를 관찰하기 위한 전략을 포함하는 특정 생물검정을 통해 관심있는 물질의 존재 및 효능을 평가하는 것을 필요로 한다.
바다 말미네 독은 세포용해성 폴리펩티드, 기공형성 독소(PFTs)11, 및 포스포리파아제12를 함유하고; 이들 분자는 단백질-지질 상호작용, 암 치료의 분자 도구 및 나노기공3에 기초한 바이오센서 연구의 모델이다. 바다 말미네 PFTs의 분류는 5 kDa 내지 80 kDa의 크기 또는 분자량에 따라 수행된다. 가장 많이 연구되고 악티노포린11로 알려진 20kDa PFT는 항암, 항균 및 나노 기공 기반 바이오 센서와 같은 가능한 응용을위한 분자 도구 개발에서 생물 의학적 잠재력에 특히 관심이 있습니다. 포스포리파아제, 구체적으로는 포스포리파제 A2(PLA2)13을 포함하는 또 다른 시톨리신은 지방산을 방출하고 인지질을 가수분해하여 세포막을 불안정하게 만든다. 이러한 작용 메카니즘으로 인해, PLA2는 염증성 질환에서의 연구 및 응용을 위한 필수적인 모델이 될 것을 약속한다. 이는 세포막(14)에서의 지질 거동을 연구하기 위한 모델로서 작용할 수 있다.
여기에서, 우리는 바다 말미잘로부터 조추출물을 수득하기 위한 효율적인 프로토콜을 기술한다 Anthopleura dowii Verrill, 1869, 및 검출 용혈 및 포스포리파아제. 둘 다 새로운 분자 도구를 설계하기위한 주형으로 사용될 수있는 관련 독소입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

바다 말미네 독 조성물은 폴리펩티드 및 비단백질 분자를 포함한다. 세포 용해 성분은 새로운 분자 도구를 설계하기위한 높은 생명 공학 및 생물 의학적 잠재력을 가지고 있습니다. 바다 말미잘독은 선충류라고 불리는 외배엽 및 하위 세포 구조의 선 세포에 위치하며, 둘 다 바다 말미잘의 몸 전체에 분포합니다. 이 특성은 세포와 선충류가 다른 독성이없는 분자와 함께 독 성분을 방출하기 위해 용해되어야하기 때문에 도전을 의미합니다. 따라서, 먼저, 독은 조추출물(다양하고 다양한 분자와 조직 파편들의 혼합물)로부터 유래된다. 다음 단계는 특정 생체활성을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 것이다. 여기에서, 우리는 시탈리신의 존재를 확인하기 위해 바다 말미네 조추출물 및 생물검정을 수득하기 위한 효율적인 전략을 기술한다. 첫 번째 단계는 시세포 분해신을 방출하는 저렴하고 간단한 기술 (교반 및 동결 해동 사이클)을 포함합니다. 우리는 가장 높은 세포 용해 활성과 단백질 (건조 중량 20g에서 단백질 ~ 500mg)을 얻었습니다. 다음으로, 추출물의 폴리펩티드 복잡성을 SDS-PAGE 겔 검출에 의해 분석하였고, 10 kDa 내지 250 kDa 사이의 분자량을 갖는 단백질을 검출하였다. 용혈성 분석에서 우리는 양 적혈구를 사용하고 HU50 (11.1 ± 0.3 μg / mL)을 측정했습니다. 대조적으로, 조 추출물에서 포스포리파아제의 존재는 아가로스를 갖는 고체 배지에서 기질로서 달걀 노른자를 사용하여 결정되었다. 전반적으로,이 연구는 효율적이고 저렴한 프로토콜을 사용하여 조 추출물을 준비하고 복제 가능한 생물 분석을 적용하여 세포 분해물, 생명 공학 및 생물 의학 관심사를 가진 분자를 확인합니다.

바다 말미잘의 조추출물을 얻기 위해 사용된 프로토콜의 대표적인 결과는 두 가지 기술(동결 및 해동의 교반 및 순환)을 결합하면 선충종을 효율적으로 배출할 수 있었으며 총 단백질 양은 500mg(8mg/mL)이었다(그림 3).
조 추출물의 단백질 복잡성은 SDS-PAGE 전기영동을 통해 10 kDa 및 250 kDa 초과로부터 관찰될 수 있었다. 또한, 시톨리신은 15 kDa 및 20 kDa의 분자?...

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Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

여기에서, 우리는 바다 말미잘에서 조독 추출물을 얻고 용혈성 및 포스포리파제 활성을 검출하는 프로토콜을 기술한다.

간단한 생물 분석법에 의한 바다 아네몬의 조추출물에서 용혈성 및 포스포리파아제 활성의 확인

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

바다 말미암 독소 상호 작용은 독소의 큰 다양성과 풍부함을 얻고 특정 독소의 빠른 동정을 얻기 위해 최소한의 유기체와 효율적인 프로토콜을 사용해야합니다. 우리는 다량의 단백질로 조 추출물을 제조하고 재현 가능하고 구체적이며 빠르며 저렴한 분석을 설명하여 바다 말미잘독에서 용혈 및 포스포릭 염기를 확인하는 두 가지 효율적인 기술을 결합했습니다. 상기 방법은 하나 또는 두 가지 유형의 시세포분해신을 동정하기로 결정되는 거의 모든 예에서 사용될 수 있다.이 방법의 효율성은 조 추출물을 준비하는 동안 각 단계에서 시간을 관리함으로써 달성됩니다. 용혈의 핵심은 기계적 용해를 피하기 위해 적혈구를주의 깊게 취급하고 인두 분해 분석에서 플레이트 준비 온도를 관리하는 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 Santos Ramirez-Carreto 박사, 생물 학자 Sandra Salazar Garcia, 생물 학자 Giovanni Macias Martinez가 될 것입니다.먼저 수집된 바다 말미잘인 A.doi를 증류수로 손으로 세척하여 신체에 부착되는 큰 기질 입자를 제거한다. 즉시 72 시간 동안 울트라 냉동고에서 영하 80도에서 유기체를 동결시킵니다. 그런 다음 유기체를 48 시간 동안 동결 건조 조건으로 동결 건조를위한 특수 안경에 넣으십시오.조직 수분 공급을 위해, 동결건조된 유기체의 건조 중량 20그램을 50밀리몰 인산나트륨 완충액 60밀리리터와 하나의 억제제 칵테일 정제로 재구성한다. 마그네틱 교반기에서, 샘플을 약 800RPM과 네 °C에서 12시간 동안 연속적으로 교반한다. 세포 용해 및 선충류 배출을 유도하기 위해 샘플을 영하 20도에서 12 시간 동안 동결시킨 후, 용기를 90 %까지 해동 될 때까지 실온에서 물에 넣고이 과정을 세 번 반복하십시오.추출물을 명확히 하기 위해, 샘플을 섭씨 4도에서 40분 동안 25, 400배 G에서 원심분리한다. 상층액을 회수하고 다시 원심분리한다. 이 단계를 서너 번 반복하고 마침내 상청액을 회수하십시오.회수된 상청액 또는 조추출물은 독 성분 및 지질, 탄수화물 및 핵산과 같은 다른 세포 분자를 함유한다. 상용 브래드포드 비색 분석 키트를 사용하여 조 추출물의 단백질 농도를 결정한다. 샘플을 진탕 없이 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다.이어서, 595 나노미터에서 흡광도를 측정하였다. 샘플 BSA 흡광도의 평균을 플롯하고 그래프의 방정식을 결정하며, 여기서 y는 흡광도, m은 선의 기울기, x는 단백질 농도, b는 원점에 대한 누진이다. 조 추출물을 분석하기 위해, 단백질을 변성시키기 위해 단백질 로딩 버퍼의 다섯 마이크로리터에 조 추출물의 30 마이크로그램을 첨가한다.최종 부피는 50 마이크로리터 미만이어야 한다. 한 시간 30분 동안 25밀리암페어에서 일정하게 전기영동을 실행합니다. 겔 단백질의 확산을 피하기 위해, 단백질에 고정 용액을 첨가하고, 80RPM에서 진탕하면서 실온에서 40분 동안 인큐베이션한다.이어서, 용액을 데칸트하고 단백질 가교 용액을 첨가한다. 실온에서 30분 동안 진탕하면서 80 RPM에서 인큐베이션한다. 용액을 제거하고 5 분 동안 100 밀리리터의 증류수로 겔을 세척하십시오.그런 다음 물을 제거하고 이 절차를 네 번 반복하십시오. 실온에서 실험실 회전 발진기에서 60RPM으로 교반하는 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 여과 용액 50 밀리리터로 단백질 염색을 15분 동안 수행하십시오. 양의 경정맥에서 한 밀리리터의 혈액을 추출하고 주사기에서 바늘을 제거하십시오.즉시 50 밀리리터의 Alsever 용액이있는 튜브에 혈액을 배출하고 섭씨 4도에서 5 분 동안 804 배 G에서 원심 분리하십시오. 상청액을 버리고 튜브의 내벽을 따라 밀어 30 밀리리터의 Alsever 용액을 첨가하십시오. 파스퇴르 플라스틱 피펫을 사용하여 펠렛을 천천히 재현탁시키고 용액을 섭씨 4도에서 5분 동안 804배 G에서 다시 원심분리한다.상청액이 명확해질 때까지이 과정을 반복하십시오. Alsever 용액의 최종 부피를 유지하여 밀리리터 당 약 2 백만 세포의 농도를 달성하십시오. 그런 다음 Neubauer 챔버 또는 혈구 측정기를 사용하여 세포를 계수하십시오.용액 혼합물을 흔들지 않고 섭씨 37도에서 한 시간 동안 인큐베이션한 다음, 플레이트를 섭씨 4도에서 5분 동안 804배 G에서 원심분리한다. 평평한 바닥을 가진 다른 96-웰 플레이트에서 상청액을 회수하십시오. 조 추출물에 세포 분해신이 포함되어 있으면 적혈구가 용해되어 헤모글로빈을 방출합니다.415 나노 미터에서 흡광도를 읽고 적혈구의 50 %에서 용혈을 일으키는 추출물의 양을 계산하십시오. 바다 말미잘의 조 추출물의 양을 늘리고 적절한 소프트웨어를 사용하여 시그모이드 조정으로 플롯을 설계하십시오. 닭고기 달걀 1개를 증류수에 1%SDS로 씻고 멸균 상태에서 달걀 흰자위와 달걀 노른자를 분리합니다.용액 A, B, C 및 D를 준비합니다.용액 B에 500 마이크로리터의 용액 A와 C를 추가하고 100 마이크로리터의 용액 D.Mix를 넣고 25 밀리리터를 각 페트리 접시에 붓습니다. 용액이 멸균 조건에서 응고 될 때까지 기다렸다가 얇은 튜브로 직경이 약 두 ~ 세 밀리미터 인 우물을 만드십시오. 한 웰에 음성 대조군으로서 총 20 마이크로리터의 인산염 완충액을 첨가하고, 다른 웰에 양성 대조군으로서 결정된 포스포리파아제의 20 마이크로리터를 첨가한다.상이한 양의 조추출물 단백질 5, 15, 25, 35, 및 45 마이크로그램을 나머지 웰에 놓고, 각각 20 마이크로리터의 최종 부피로 놓는다. 섭씨 37도에서 20 시간 동안 배양하십시오. 바다 말미잘의 조 추출물을 얻기 위해 사용 된 프로토콜의 대표적인 결과는 동결과 해동의 교반과 사이클이라는 두 가지 기술을 결합하여 선충류의 효율적인 배출을 일으킨다는 것을 보여주었습니다.자극 전후의 선충세포가 여기에 표시됩니다. 선충 낭종 세뇨관은이 이미지에 노출되어 독소 방출을 나타냅니다. 바다 말미암 조추출물의 전기영동 프로파일이 여기에 도시되어 있다.바다 말미암 조 추출물은 SDS-PAGE 15% 폴리아크릴아미드 겔로 분석하였고, 10 킬로달톤에서 250 킬로달톤의 분자량까지 단백질을 나타내었다. 여기서, 레인 1은 단백질 사다리이고 레인 2는 바다 말미잘독이다. 시토리신은 15킬로달톤 및 20킬로달톤의 분자량 영역에서 검출되었다.여기에 표시된 것은 양으로부터의 적혈구에서의 용혈 분석이다. 동결 및 해동 주기 전과 동안 추출물의 용혈 활성은 마지막 두 사이클에서 총 조 추출물 단백질의 50 마이크로그램으로 100% 용혈까지 증가하였다. 50 % 양 적혈구를 용해시키는 데 필요한 양은 밀리리터 당 11.1 0.3 마이크로 그램입니다.포스포리파아제 활성은 조추출물 샘플이 적용된 한천 플레이트의 영역에서 투명한 후광의 형성에 의해 검출되었다. 결과는 총 단백질의 15 마이크로그램으로부터 포스포리파아제 활성의 존재를 보여준다. 할로의 직경이 용량 의존적 방식으로 증가하였다; The diameter of the halo increased in a dose-dependent manner; 즉, 조 추출물의 양이 증가하면, 할로의 직경이 증가하였다.절차를 시도하는 동안 선충류 배출을 유도하고, 총 단백질을 정량하고, SDS-PAGE 전기영동으로 조 추출물을 분석하고, 용혈의 50 %를 생산하는 조 추출물 단백질의 양을 계산하고, 포스포리파아제 분석에서 다른 양의 단백질을 사용하십시오. 우리는 프로테오믹 기술로 조 추출물을 분석하여 생명 공학 및 생물 의학에서 큰 관련성을 가진 폴리펩티드를 확인하고 고유 한 분자를 프로파일 링하고 특성화 한 다음 실험실에서 생산하여 적용 할 수 있습니다. 우리는 인간 완결한 폐 암종 상피 세포에서 항종양 활성을 갖는 수행 단백질의 서열의 일부를 수득하였다.마찬가지로, 우리는 생명 공학 관심의 포스포리파아제의 서열을 확인합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

연구

생화학

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

리파제 및 포스 후보자에 대한 기질 특이성을 정의

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

각 질의 닭 깃털 및 화장품에의 응용에서의 준비

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

마우스 조직에서 효소 특이성 결정 TOF MALDI 질량 분석에 의해 추출: PH 특이성 변경를 조작

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

생물 검정 기반 분류를 사용 하 여 바다 심고 페로몬의 식별

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...