Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), med et tilskuddsnummer IT200819. Forfatterne erkjenner til Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, for å sjekke den engelske grammatikken i dette manuskriptet; og den tekniske hjelpen til Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) og Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Vi takker også dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) for å ha skaffet saueblod. Vi takker spesielt Dr José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, for fasilitetene i laboratoriet hans for videoopptaket.

Sjøemonene ble samlet inn i henhold til retningslinjene fra Den nasjonale kommisjonen for akvakultur, fiskeri og mat fra den føderale regjeringen i Mexico (tillatelsesnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Bioetikkkomiteen ved Institutt for bioteknologi, National Autonomous University of Mexico godkjente alle forsøkene med sjøanemoner. Saueblodprøven ble kjøpt ved Center for Practical Teaching and Research in Animal Production and Health (CEPIPSA, National Autonomous University of Mexico).
<p class="jove_title...

<ol>
	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+toxins:+recent+evidences+for+potential+therapeutic+uses.">Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses.</a> The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodr&#237;guez-Almaz&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinoporins:+From+the+structure+and+function+to+the+generation+of+biotechnological+and+therapeutic+tools.">Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools.</a> Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).</li><li>Fautin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity,+systematics,+and+evolution+of+cnidae.+Toxicon.">Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon.</a> Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+soluble+protein+contents+from+the+nematocysts+of+a+model+sea+anemone+sheds+light+on+venom+evolution.">Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution.</a> Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxin+localization+to+ectodermal+gland+cells+uncovers+an+alternative+mechanism+of+venom+delivery+in+sea+anemones.">Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).</li><li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification.">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).</li><li>Bulati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+purified+extracts+of+sea+anemone+Anemonia+viridis+affect+the+growth+and+viability+of+selected+tumour+cell+lines.">Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines.</a> BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).</li><li>Orts, D. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+electrophysiological+characterization+of+two+sea+anemone+type+1+potassium+toxins+from+a+geographically+distant+population+of+Bunodosoma+caissarum.">Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum.</a> Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).</li><li>Hader, D., Erzinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).</li><li>Anderluh, G., Macek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytolytic+peptide+and+protein+toxins+from+sea+anemones+(Anthozoa:+Actiniaria).">Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria).</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).</li><li>Nevalainen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+in+cnidaria.">Phospholipase A2 in cnidaria.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).</li><li>Razpotnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+phospholipase+A2+isolated+from+the+sea+anemone+Urticina+crassicornis+-+its+primary+structure+and+phylogenetic+classification.">A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification.</a> The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).</li><li>Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+enzymes:+Physical+structure,+biological+function,+disease+implication,+chemical+inhibition,+and+therapeutic+intervention.">Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention.</a> Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+a+venom+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+cavernata.">Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).</li><li>Morales-Landa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+antiprotozoal,+and+toxic+activities+of+Cnidarian+extracts+from+the+Mexican+Caribbean+Sea.">Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea.</a> Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).</li><li>S&#225;nchez-Rodr&#237;guez, J., Cruz-Vazquez, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+biological+characterization+of+neurotoxic+compounds+from+the+sea+anemone+Lebrunia+danae+(Duchassaing+and+Michelotti,+1860).">Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860).</a> Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).</li><li>de Oliveira, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caissarolysin+I+(Bcs+I),+a+new+hemolytic+toxin+from+the+Brazilian+sea+anemone+Bunodosoma+caissarum:+purification+and+biological+characterization.">Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).</li><li>Norton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crude+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+caissarum+elicits+convulsions+in+mice:+possible+involvement+of+the+glutamatergic+system.">The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).</li><li>Dion, A. S., Pomenti, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+lipids+of+sheep+red+blood+cells.+I.+Lipid+composition+in+low+and+high+potassium+red+cells.">Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells.</a> Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+and+proteomic+analysis+of+the+tentacles+and+mucus+of+Anthopleura+dowii+Verrill,+1869.">Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869.</a> Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).</li></ol>

Den høye etterspørselen etter nye forbindelser med anvendelser innen ulike fagområder og industri har ført til studiet av gift. Gift representerer en rik kilde til molekyler som fungerer som en mal for å generere nye molekylære verktøy. Imidlertid krever kompleksiteten til disse giftene implementering og kombinasjon av ulike metoder for å skaffe og studere dem.
Her viser vi en metode for å skaffe og analysere giftet til sjøemonen Anthopleura dowii, Verrill 1869, som kan bruk...

Marine dyr er en rik kilde til biologisk aktive forbindelser. I de siste tiårene har sammensetningen av sjøemone gift tiltrukket seg vitenskapelig oppmerksomhet siden den består av et mangfold av polypeptider med hemolytisk, cytotoksisk, enzymatisk (fosfolipase, protease, chitinase) og nevrotoksisk aktivitet og hemmende effekter på proteolytisk aktivitet1. I tillegg er disse polypeptider potensielle kilder for utvikling av molekylære verktøy i bioteknologisk og terapeutisk bruk 2,3.
Det er få rapporter om sjøemongift og dens molekylære komponenter på grunn av kompleksiteten ved å skaffe giftet, til og med isolasjon og karakterisering av giftstoffer. Utvinningsmetodene som brukes i rapportene involverte lysis og tømming av innholdet i celler som er relatert og ikke relatert til giftproduksjonen1.
En spesiell egenskap i alle cnidarians er fraværet av et system for produksjon og frigjøring av giftet sentralisert i en enkelt anatomisk region. I stedet er nematocystene strukturer som holder giften 4,5. Andre typer celler, kalt epidermale kjertelceller, skiller også ut giftstoffer og fordeles også over hele kroppen av sjømoner6.
Den første og mest avgjørende utfordringen med å skaffe giftet er genereringen av et ekstrakt med tilstrekkelig manipulasjon i etterfølgende prosesser, uten inaktivering eller nedbrytning av labile proteiner. Deretter må cellene lyses, og komponentene - i dette tilfellet må polypeptider effektivt og raskt ekstraheres, unngå proteolyse og hydrolyse mens du eliminerer andre cellulære komponenter7.
Ulike metoder brukes for å oppnå rå ekstrakt av en sjøemone; noen innebærer å ofre organismen mens andre tillater det å bli holdt i live. Metoder som innebærer bruk av organismens hele kropp tillater frigjøring av de fleste giftstoffer fragiften 8, sammenlignet med metoder som holder organismer i live, som bare trekker ut noen komponenter i giftet9. Utarbeidelsen av et ekstrakt krever evaluering av tilstedeværelse og styrke av et stoff av interesse gjennom en bestemt bioassay, som inkluderer strategier for å observere de farmakologiske effektene ved in vivo eller in vitro metoder10.
Sjøemone gift inneholder cytolytiske polypeptider, poredannende toksiner (PFTs)11 og fosfolipaser12; Disse molekylene er modeller i studiet av protein-lipid interaksjon, molekylære verktøy i kreftterapi og biosensorer basert på nanopore3. Klassifiseringen av sjøemone PFTer utføres i henhold til deres størrelse eller molekylvekt, fra 5 kDa til 80 kDa. Den 20 kDa PFT, den mest studerte og kjent som actinoporins11, er av spesiell interesse for sitt biomedisinske potensial i utviklingen av molekylære verktøy for mulige applikasjoner som anticancer, antimikrobielle og nanoporebaserte biosensorer. En annen cytolysin, inkludert fosfolipaser, spesielt fosfolipase A2 (PLA2)13, frigjør en fettsyre på grunn og hydrolyserer fosfolipider, destabiliserer cellemembranen. På grunn av denne virkningsmekanismen lover PLA2 å være en viktig modell for studien og anvendelser i inflammatoriske sykdommer. Det kan tjene som modell for studier av lipidadferd i cellemembranen14.
Her beskriver vi en effektiv protokoll for å skaffe råoljeekstraktet fra sjøemone Anthopleura dowii Verrill, 1869, og oppdage hemolysiner og fosfolipaser. Begge er relevante giftstoffer som kan brukes som mal for å designe nye molekylære verktøy.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

Havemone gift sammensetning inkluderer polypeptid og ikke-proteiner molekyler. Cytolytiske komponenter har et høyt bioteknologisk og biomedisinsk potensial for å designe nye molekylære verktøy. Sjøemone gift finner i kjertelceller fra ektoderm og sub-cellulære strukturer kalt nematocysts, som begge er fordelt over hele havets anemone kropp. Denne egenskapen innebærer utfordringer fordi cellene og nematocysten må lyses for å frigjøre giftkomponentene med andre ikke-giftige molekyler. Derfor er giften først avledet fra et råekstrakt (blanding av forskjellige og mangfoldige molekyler og vevsrester). Det neste trinnet er å oppdage polypeptider med spesifikke bioaktiviteter. Her beskriver vi en effektiv strategi for å få sjøemone råolje ekstrakt og bioassay for å identifisere tilstedeværelsen av cytolysiner. Det første trinnet innebærer billige og enkle teknikker (rørt og fryse-tine syklus) for å frigjøre cytolysiner. Vi fikk den høyeste cytolytiske aktiviteten og proteinet (~ 500 mg protein fra 20 g tørrvekt). Deretter ble polypeptidkompleksiteten til ekstraktet analysert av SDS-PAGE gel detekterende proteiner med molekylvekter mellom 10 kDa og 250 kDa. I den hemolytiske analysen brukte vi sauerøde blodlegemer og bestemte HU50 (11,1 ± 0,3 μg/ml). I motsetning ble tilstedeværelsen av fosfolipaser i råekstraktet bestemt ved hjelp av eggeplomme som substrat i et solid medium med agarose. Samlet sett bruker denne studien en effektiv og billig protokoll for å forberede råoljeekstraktet og bruker replikerbare bioassays for å identifisere cytolysiner, molekyler med bioteknologiske og biomedisinske interesser.

De representative resultatene av protokollen som ble brukt til å oppnå rå ekstrakt av sjøemone viste at å kombinere to teknikker (agitasjon og sykluser med frysing og tining) ga en effektiv utslipp av nematocyster, og den totale mengden protein var 500 mg (8 mg / ml) (figur 3).
Råekstraktens proteinkompleksitet kunne observeres fra 10 kDa og større enn 250 kDa gjennom SDS-PAGE elektroforese. I tillegg ble cytolysiner påvist i molekylvektsonen på 15 kDa og...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Her beskriver vi en protokoll for å få rå giftekstrakt fra sjøemone og oppdage dens hemolytiske og fosfolipaseaktivitet.

Identifisering av hemolytisk og fosfolipaseaktivitet i råoljeekstrakter fra sjøemoner av enkle bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Sjøemonetoksininteraksjon må bruke minst antall organismer og effektive protokoller for å oppnå stort mangfold og overflod av toksinene og rask identifisering av et bestemt toksin. Vi kombinerte to effektive teknikker for å forberede råoljeekstraktet med en høy mengde protein og beskrive reproduserbare, spesifikke, raske og rimelige analyser for å identifisere hemolyse- og fosforbaser i sjøemongiften. Metoden kan brukes i nesten alle eksempler som er besluttet å identifisere en eller begge typer cytolysiner.Metodens effektivitet oppnås ved å ta vare på tidene i hvert trinn mens du forbereder råekstraktet. Nøkkelen til hemolyse er forsiktig håndtering av erytrocytten for å unngå mekanisk lysis, og i fosforoceseanalyse, ta vare på temperaturen i utarbeidelsen av platen. Demonstrere prosedyren vil være Dr.Santos Ramirez-Carreto, biolog Sandra Salazar Garcia, og biolog Giovanni Macias Martinez fra laboratoriet mitt.Begynn med å rengjøre den oppsamlede sjøemonen A.doi med destillert vann for hånd for å fjerne de store substratpartiklene som holder seg til kroppen. Umiddelbart fryse organismene ved minus 80 grader Celsius i en ultrafreezer i 72 timer. Plasser deretter organismene i spesielle briller for frysetørking med lyofiliseringsforhold i 48 timer.For vevshydrering, rekonstituere 20 gram tørrvekt av lyofiliserte organismer med 60 milliliter 50 millimolar natriumfosfatbuffer og en hemmer cocktailtablett. I en magnetisk rører rører du kontinuerlig prøven ved rundt 800 RPM og fire grader Celsius i 12 timer. Etter å ha fryset prøven ved minus 20 grader Celsius i 12 timer for å indusere cellelys og nematocystutladning, plasser beholderen i vann ved romtemperatur til den tiner opptil 90%Gjenta denne prosedyren tre ganger.For å avklare ekstraktet, sentrifuger prøven ved 25.400 ganger G i 40 minutter ved fire grader Celsius. Gjenopprett supernatanten og sentrifuger den igjen. Gjenta trinnet tre til fire ganger og gjenopprette supernatanten til slutt.Det gjenvunne supernatant- eller råekstraktet inneholder giftkomponentene og andre cellemolekyler som lipider, karbohydrater og nukleinsyrer. Bestem proteinkonsentrasjonen av råekstraktet ved hjelp av et kommersielt Bradford kolorimetrisk analysesett. Inkuber prøvene i fem minutter ved romtemperatur uten å riste.Mål deretter absorbansen ved 595 nanometer. Plott gjennomsnittene av prøven BSA-absorbanser og bestem ligningen av grafen der y er absorbansen, m er skråningen av linjen, x er proteinkonsentrasjonen, og b er ordinatet til opprinnelsen. For å analysere råekstraktet, tilsett 30 mikrogram av råoljeekstraktet til fem mikroliter av proteinbelastningsbufferen for å tette proteinene.Det endelige volumet må være mindre enn 50 mikroliter. Kjør elektroforese ved 25 milliampere konstant i en time og 30 minutter. For å unngå diffusjon av gelproteinene, legg til fikseringsløsningen til proteinene og inkuber ved romtemperatur i 40 minutter med risting ved 80 RPM.Deretter dekanterer du løsningen og legger til proteinkrysskoblingsløsningen. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur med risting ved 80 RPM. Fjern løsningen og vask gelen med 100 milliliter destillert vann i fem minutter.Deretter fjerner du vannet og gjentar denne prosedyren fire ganger. Utfør proteinfarging med 50 milliliter Coomassie Brilliant Blue R-250 filtrert oppløsningsrøring ved 60 RPM i en laboratorie roterende oscillator ved romtemperatur i 15 minutter. Trekk ut en milliliter blod fra en sauens jugulære vene og fjern nålen fra sprøyten.Tøm umiddelbart blod i et rør med 50 milliliter Alsever-løsning og sentrifuger ved 804 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Kast supernatanten og tilsett 30 milliliter Alsever-oppløsning ved å skyve den langs rørets indre vegger. Resuspend pelletsen langsomt ved hjelp av en Pasteur plastpipette og sentrifuger løsningen igjen ved 804 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius.Gjenta denne prosedyren til supernatanten er avklart. Oppretthold det endelige volumet av Alsever-løsningen for å oppnå en konsentrasjon på 2 millioner celler per milliliter omtrent. Bruk deretter et Neubauer-kammer eller hemocytometer for å telle cellene.Inkuber løsningsblandingene i en time ved 37 grader Celsius uten risting og sentrifuger deretter platen ved 804 ganger G i fem minutter ved fire grader Celsius. Gjenopprett supernatanten i en annen 96-brønnsplate med en flat bunn. Hvis råekstraktet inneholder cytolysiner, vil erytrocytter lyse og frigjøre hemoglobin.Les absorbansen ved 415 nanometer og beregn mengden ekstrakt som produserer hemolyse i 50% av erytrocyttene. Øk mengden sjøemone råolje ekstrakt og design plottet med sigmoidal justeringer ved hjelp av passende programvare. Vask ett kyllingegg med 1% SDS i destillert vann og skill eggeplommen fra eggehviten under sterile forhold.Forbered løsninger A, B, C og D.Tilsett 500 mikroliter løsninger A og C til løsning B og 100 mikroliter oppløsning D.Bland dem og hell 25 milliliter i hver Petri-tallerken. Vent til løsningen størkner under sterile forhold og gjør brønner på omtrent to til tre millimeter i diameter med et tynt rør. Tilsett totalt 20 mikroliter fosfatbuffer som en negativ kontroll i en brønn og 20 mikroliter av en bestemt fosfolipase som en positiv kontroll i en annen brønn.Plasser forskjellige mengder av råekstraktproteinet 5, 15, 25, 35 og 45 mikrogram i de resterende brønnene, hver i et sluttvolum på 20 mikroliter. Inkuber ved 37 grader Celsius i 20 timer. De representative resultatene av protokollen som ble brukt til å oppnå rå ekstrakt av sjøemone viste at å kombinere to teknikker, agitasjon og sykluser av frysing og tining, produserte en effektiv utslipp av nematocytter.Nematocyttene før og etter stimuli vises her. Nematocyst tubule er eksponert i dette bildet, noe som indikerer toksinutløsningen. Den elektroforetiske profilen til sjøemone råolje ekstrakt er vist her.Sjøemone råolje ekstrakt ble analysert av SDS-PAGE 15% polyakrylamid gel og viste protein fra 10 kilodaltonn til 250 kilodaltonn molekylvekt. Her er bane 1 proteinstigen og kjørefelt 2 er sjøemone gift. Cytolysiner ble påvist i molekylvektsonen på 15 kilodaltonn og 20 kilodaltonn.Vist her er hemolyseanalysen i erytrocytter fra sauer. Den hemolytiske aktiviteten til ekstraktet før og under fryse- og tiningssyklusene økte til 100% hemolyse ble nådd med 50 mikrogram av det totale råoljeekstraktproteinet i de to siste syklusene. Mengden som trengs for å lyse 50% sauer erytrocytter er 11,1 0,3 mikrogram per milliliter.Fosfolipaseaktivitet ble påvist ved dannelse av klare glorier i områdene av agarplaten der råekstraktprøven ble påført. Resultatene viser tilstedeværelsen av fosfolipaseaktivitet fra 15 mikrogram totalt protein. Haloens diameter økte på en doseavhengig måte;det vil være, hvis mengden råoljeekstrakt økte, økte haloens diameter.Mens du prøver prosedyren, sørg for å indusere nematocystutslipp, kvantisere det totale proteinet, analysere råoljeekstrakt ved SDS-PAGE elektroforese, beregne mengden råekstraktprotein for å produsere 50% hemolyse, og bruk forskjellige mengder protein i fosfolipaseanalyse. Vi kan analysere råekstraktet ved proteomisk teknikk for å identifisere polypeptider med stor relevans i bioteknologi og biomedisin, til og med profilere og karakterisere et unikt molekyl og deretter produsere det i laboratoriet for en applikasjon. Vi fikk en del av sekvensen av et utøvende protein med antitumoraktivitet i de humane obdurat lungekarsinom epitelceller.På samme måte identifiserer vi sekvensen av fosfolipaser av bioteknologisk interesse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifisering av lite molekyl bindende proteiner i en Native Cellular Miljø via Live-celle Photoaffinity Merking

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Definere substratspesifisiteter for lipase og fosfolipase Kandidater

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Utarbeidelse av Keratin hydrolyse fra kylling fjær og dens anvendelse i kosmetikk

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifikasjon av havet Lamprey feromoner bruker Bioassay-guidede fraksjoneres

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Deteksjon av fosfolipase C aktivitet i hjernen Homogenate fra Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...