Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), com um número de subvenção IT200819. Os autores reconhecem a Tom Musselman, Edição de Papel de Rock, LLC, por verificar a gramática inglesa deste manuscrito; e assistência técnica de Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) e Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Agradecemos também ao Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) pela obtenção de sangue de ovelha. Agradecemos especialmente ao Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, pelas instalações em seu laboratório para a gravação de vídeo.

As anêmonas do mar foram coletadas de acordo com as diretrizes da Comissão Nacional de Aquicultura, Pesca e Alimentação do Governo Federal do México (número de licença PPF/DGOPTA 07332.250810.4060). O Comitê de Bioética do Instituto de Biotecnologia da Universidade Nacional Autônoma do México aprovou todos os experimentos com anêmonas do mar. A amostra de sangue de ovelha foi adquirida no Centro de Ensino Prático e Pesquisa em Produção e Saúde Animal (CEPIPSA, Universidade Nacional Autônoma do México).<...

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	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+toxins:+recent+evidences+for+potential+therapeutic+uses.">Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses.</a> The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodr&#237;guez-Almaz&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinoporins:+From+the+structure+and+function+to+the+generation+of+biotechnological+and+therapeutic+tools.">Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools.</a> Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).</li><li>Fautin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity,+systematics,+and+evolution+of+cnidae.+Toxicon.">Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon.</a> Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+soluble+protein+contents+from+the+nematocysts+of+a+model+sea+anemone+sheds+light+on+venom+evolution.">Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution.</a> Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxin+localization+to+ectodermal+gland+cells+uncovers+an+alternative+mechanism+of+venom+delivery+in+sea+anemones.">Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).</li><li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification.">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).</li><li>Bulati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+purified+extracts+of+sea+anemone+Anemonia+viridis+affect+the+growth+and+viability+of+selected+tumour+cell+lines.">Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines.</a> BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).</li><li>Orts, D. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+electrophysiological+characterization+of+two+sea+anemone+type+1+potassium+toxins+from+a+geographically+distant+population+of+Bunodosoma+caissarum.">Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum.</a> Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).</li><li>Hader, D., Erzinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).</li><li>Anderluh, G., Macek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytolytic+peptide+and+protein+toxins+from+sea+anemones+(Anthozoa:+Actiniaria).">Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria).</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).</li><li>Nevalainen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+in+cnidaria.">Phospholipase A2 in cnidaria.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).</li><li>Razpotnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+phospholipase+A2+isolated+from+the+sea+anemone+Urticina+crassicornis+-+its+primary+structure+and+phylogenetic+classification.">A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification.</a> The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).</li><li>Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+enzymes:+Physical+structure,+biological+function,+disease+implication,+chemical+inhibition,+and+therapeutic+intervention.">Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention.</a> Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+a+venom+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+cavernata.">Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).</li><li>Morales-Landa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+antiprotozoal,+and+toxic+activities+of+Cnidarian+extracts+from+the+Mexican+Caribbean+Sea.">Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea.</a> Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).</li><li>S&#225;nchez-Rodr&#237;guez, J., Cruz-Vazquez, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+biological+characterization+of+neurotoxic+compounds+from+the+sea+anemone+Lebrunia+danae+(Duchassaing+and+Michelotti,+1860).">Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860).</a> Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).</li><li>de Oliveira, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caissarolysin+I+(Bcs+I),+a+new+hemolytic+toxin+from+the+Brazilian+sea+anemone+Bunodosoma+caissarum:+purification+and+biological+characterization.">Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).</li><li>Norton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crude+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+caissarum+elicits+convulsions+in+mice:+possible+involvement+of+the+glutamatergic+system.">The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).</li><li>Dion, A. S., Pomenti, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+lipids+of+sheep+red+blood+cells.+I.+Lipid+composition+in+low+and+high+potassium+red+cells.">Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells.</a> Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+and+proteomic+analysis+of+the+tentacles+and+mucus+of+Anthopleura+dowii+Verrill,+1869.">Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869.</a> Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).</li></ol>

A alta demanda por novos compostos com aplicações em diferentes campos da ciência e da indústria levou ao estudo do veneno. O veneno representa uma rica fonte de moléculas que serve como modelo para a geração de novas ferramentas moleculares. No entanto, a complexidade desses venenos requer a implementação e combinação de vários métodos para obtê-los e estudá-los.
Aqui, mostramos um método para obter e analisar o veneno da anêmona do mar Anthopleura dowii, Verrill 186...

Animais marinhos são uma rica fonte de compostos biologicamente ativos. Nas últimas décadas, a composição do veneno de anêmona marinha tem atraído atenção científica, pois compreende uma diversidade de polipeptídeos com hemolítica, citotóxica, enzimática (fosfolipase, protease, quitinase) e atividade neurotóxica e efeitos inibitórios na atividade proteolítica1. Além disso, esses polipeptídeos são fontes potenciais para o desenvolvimento de ferramentas moleculares no uso biotecnológico e terapêutico 2,3.
Há poucos relatos sobre o veneno de anêmona marinha e seus componentes moleculares devido à complexidade da obtenção do veneno, até mesmo do isolamento e caracterização de toxinas. Os métodos de extração utilizados nos relatórios envolveram a lise e o esvaziamento do conteúdo das células relacionadas e não relacionadas à produçãode veneno 1.
Uma característica particular em todos os cnidários é a ausência de um sistema de produção e liberação do veneno centralizado em uma única região anatômica. Em vez disso, os nematocistos são estruturas que mantêm o veneno 4,5. Outros tipos de células, chamadas células da glândula epidérmica, também secretam toxinas e também são distribuídas por todo o corpo de anêmonas do mar6.
O primeiro e mais crucial desafio na obtenção do veneno é a geração de um extrato com manipulação suficiente em processos subsequentes, sem a inativação ou degradação de proteínas labile. Em seguida, as células devem ser liseadas, e os componentes - neste caso, os polipeptídeos devem ser extraídos de forma eficiente e rápida, evitando a proteólise e a hidrólise ao eliminar outros componentes celulares7.
Diferentes métodos são utilizados para obter o extrato bruto de uma anêmona marinha; alguns envolvem sacrificar o organismo, enquanto outros permitem que ele seja mantido vivo. Métodos que implicam o uso de todo o corpo do organismo permitem a liberação da maioria das toxinas do veneno8, em comparação com métodos que mantêm os organismos vivos, que extraem apenas alguns componentes do veneno9. A elaboração de um extrato requer avaliar a presença e potência de uma substância de interesse por meio de um bioensaio específico, que inclui estratégias para observar os efeitos farmacológicos pelos métodos in vivo ou in vitro 10.
O veneno de anêmona do mar contém polipeptídeos citólíticos, toxinas formadoras de poros (PFTs)11 e fosfolipases12; essas moléculas são modelos no estudo da interação proteína-lipídica, ferramentas moleculares na terapia do câncer e biosensores à base de nanoporos3. A classificação de PFTs de anêmona marinha é realizada de acordo com seu tamanho ou peso molecular, de 5 kDa a 80 kDa. O PFT de 20 kDa, o mais estudado e conhecido como actinoporinas11, é de particular interesse por seu potencial biomédico no desenvolvimento de ferramentas moleculares para possíveis aplicações como biosensores anticancerígenos, antimicrobianos e à base de nanoporos. Outra citolisina, incluindo fosfolipases, especificamente fosfolipase A2 (PLA2)13, libera um ácido graxo devido e hidrolisa fosfolipídios, desestabilizando a membrana celular. Devido a esse mecanismo de ação, o PLA2 promete ser um modelo essencial para o estudo e aplicações em doenças inflamatórias. Poderia servir de modelo para estudos de comportamento lipídudo na membranacelular 14.
Aqui, descrevemos um protocolo eficiente para a obtenção do extrato bruto da anêmona anthopleura dowii Verrill, 1869, e a detecção de hemolises e fosfolipases. Ambas são toxinas relevantes que poderiam ser usadas como modelo para projetar novas ferramentas moleculares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

A composição do veneno de anêmona do mar inclui moléculas de polipeptídeos e não-proteínas. Os componentes citólticos têm um alto potencial biotecnológico e biomédico para projetar novas ferramentas moleculares. O veneno de anêmona marinha se localiza em células glandulares a partir de ectoderme e estruturas subcelulares chamadas nematocistos, ambas distribuídas por todo o corpo de anêmona do mar. Essa característica implica desafios porque as células e o nematócito devem ser lícitos para liberar os componentes do veneno com outras moléculas não tóxicas. Portanto, primeiro, o veneno é derivado de um extrato bruto (mistura de moléculas diferentes e diversas e detritos teciduais). O próximo passo é detectar polipeptídeos com bioatividades específicas. Aqui, descrevemos uma estratégia eficiente para obter o extrato bruto de anêmona do mar e bioensaio para identificar a presença de citolises. O primeiro passo envolve técnicas baratas e simples (ciclo agitado e degelo) para liberar citolísinas. Obtivemos a maior atividade citolítica e proteína (~500 mg de proteína a partir de 20 g de peso seco). Em seguida, a complexidade do polipeptídeo do extrato foi analisada pelo gel SDS-PAGE detectando proteínas com pesos moleculares entre 10 kDa e 250 kDa. No ensaio hemollítico, utilizamos glóbulos vermelhos ovelhas e determinamos hu50 (11,1 ± 0,3 μg/mL). Em contraste, a presença de fosfolipases no extrato bruto foi determinada utilizando gema de ovo como substrato em um meio sólido com agarose. No geral, este estudo utiliza um protocolo eficiente e barato para preparar o extrato bruto e aplica bioensações replicáveis para identificar citolysinas, moléculas com interesses biotécnicos e biomédicos.

Os resultados representativos do protocolo utilizado para a obtenção do extrato bruto da anêmona do mar mostraram que a combinação de duas técnicas (agitação e ciclos de congelamento e descongelamento) produziu uma descarga eficiente de nematocistos, e a quantidade total de proteína foi de 500 mg (8 mg/mL) (Figura 3).
A complexidade proteica do extrato bruto poderia ser observada a partir de 10 kDa e maior que 250 kDa através da eletroforese SDS-PAGE. Al...

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Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Aqui, descrevemos um protocolo para obter extrato de veneno bruto da anêmona do mar e detectar sua atividade hemolítica e fosfolipase.

Identificação da Atividade Hemolítica e Fosfolipase em Extratos Brutos de Anêmonas do Mar por Bioensaões Simples

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

A interação com a toxina de anêmona do mar deve usar o menor número de organismos e protocolos eficientes para obter grande diversidade e abundância das toxinas e identificação rápida de uma toxina específica. Combinamos duas técnicas eficientes para preparar o extrato bruto com uma alta quantidade de proteína e descrever ensaios reprodutíveis, específicos, rápidos e baratos para identificar bases hemólise e fosfólicas no veneno de anêmona marinha. O método pode ser usado em quase qualquer exemplo que se desprendou para identificar um ou ambos os tipos de citolysinas.A eficiência do método é alcançada cuidando dos tempos em cada etapa durante a preparação do extrato bruto. A chave para a hemólise é o manuseio cuidadoso do eritrócito para evitar a lise mecânica, e no ensaio de fosfólise, cuidando da temperatura na preparação da placa. Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Santos Ramirez-Carreto, a bióloga Sandra Salazar Garcia e o biólogo Giovanni Macias Martinez do meu laboratório.Comece limpando a anêmona do mar coletada A.doi com água destilada à mão para remover as grandes partículas de substrato que aderiram ao corpo. Congele imediatamente os organismos a menos 80 graus Celsius em um ultracongelante por 72 horas. Em seguida, coloque os organismos em copos especiais para congelar a secagem com condições de liofilização por 48 horas.Para hidratação tecidual, reconstitua 20 gramas de peso seco de organismos liofilizados com 60 mililitros de tampão fosfato de sódio de 50 milimolares e um comprimido de coquetel inibidor. Em um agitador magnético, mexa continuamente a amostra em torno de 800 RPM e quatro graus Celsius por 12 horas. Depois de congelar a amostra a menos 20 graus Celsius por 12 horas para induzir a lise celular e a descarga do nematócito, coloque o recipiente na água em temperatura ambiente até descongelar até 90% Repita este procedimento três vezes.Para esclarecer o extrato, centrifufique a amostra a 25.400 vezes G durante 40 minutos a quatro graus Celsius. Recupere o supernatante e centrifuá-lo novamente. Repita o passo de três a quatro vezes e recupere o supernatante finalmente.O extrato supernante ou bruto recuperado contém os componentes do veneno e outras moléculas celulares, como lipídios, carboidratos e ácidos nucleicos. Determine a concentração proteica do extrato bruto usando um kit comercial de ensaio colorimétrico bradford. Incubar as amostras por cinco minutos em temperatura ambiente sem tremer.Em seguida, meça a absorvância em 595 nanômetros. Plote as médias das absorvâncias BSA da amostra e determine a equação do gráfico onde y é a absorção, m é a inclinação da linha, x é a concentração de proteína, e b é a ordinaada à origem. Para analisar o extrato bruto, adicione 30 microgramas do extrato bruto a cinco microliters do tampão de carga de proteínas para desnaturar as proteínas.O volume final deve ser inferior a 50 microliters. Executar eletroforese a 25 miliamperes constante por uma hora e 30 minutos. Para evitar a difusão das proteínas em gel, adicione a solução de fixação às proteínas e incubar à temperatura ambiente por 40 minutos com agitação a 80 RPM.Em seguida, decante a solução e adicione a solução de crosslinking de proteínas. Incubar por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação a 80 RPM. Retire a solução e lave o gel com 100 mililitros de água destilada por cinco minutos.Depois disso, retire a água e repita este procedimento quatro vezes. Realize a coloração proteica com 50 mililitros de solução filtrada Coomassie Brilliant Blue R-250 mexendo a 60 RPM em um oscilador rotativo de laboratório à temperatura ambiente por 15 minutos. Extrair um mililitro de sangue da veia jugular de uma ovelha e remover a agulha da seringa.Drene imediatamente o sangue em um tubo com 50 mililitros de solução Alsever e centrífuga a 804 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Descarte o supernatante e adicione 30 mililitros de solução Alsever deslizando-o ao longo das paredes internas do tubo. Leve lentamente a pelota usando uma pipeta de plástico Pasteur e centrifugar a solução novamente a 804 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius.Repita este procedimento até que o sobrenatante seja esclarecido. Mantenha o volume final da solução Alsever para alcançar uma concentração de 2 milhões de células por mililitro aproximadamente. Em seguida, use uma câmara de Neubauer ou hemótmetro para contar as células.Incubar as misturas da solução por uma hora a 37 graus Celsius sem tremer e, em seguida, centrifugar a placa a 804 vezes G por cinco minutos a quatro graus Celsius. Recupere o supernatante em outra placa de 96 poços com um fundo plano. Se o extrato bruto contiver citolises, os eritrócitos irão lise e liberarão hemoglobina.Leia a absorvência em 415 nanômetros e calcule a quantidade de extrato que produz hemólise em 50% dos eritrócitos. Aumente a quantidade de extrato bruto de anêmona do mar e projete o lote com ajustes sigmoidal usando software apropriado. Lave um ovo de galinha com 1%de SDS em água destilada e separe a gema de ovo da clara de ovo em condições estéreis.Prepare as soluções A, B, C e D.Add 500 microliters de soluções A e C para a solução B e 100 microliters de solução D.Mix-los e despeje 25 mililitros em cada placa de Petri. Aguarde a solução para solidificar em condições estéreis e fazer poços de aproximadamente dois a três milímetros de diâmetro com um tubo fino. Adicione um total de 20 microlitres de tampão fosfato como um controle negativo em um poço e 20 microlitres de uma fosfolipase determinada como um controle positivo em outro poço.Coloque diferentes quantidades da proteína extrato bruto 5, 15, 25, 35 e 45 microgramas nos poços restantes, cada um em um volume final de 20 microliters. Incubar a 37 graus Celsius por 20 horas. Os resultados representativos do protocolo utilizado para a obtenção do extrato bruto da anêmona do mar mostraram que a combinação de duas técnicas, agitação e ciclos de congelamento e descongelamento, produziu uma descarga eficiente de nematocistos.Os nematocitos antes e depois dos estímulos são mostrados aqui. O túbulo do nematocisto é exposto nesta imagem, indicando a liberação da toxina. O perfil eletroforético do extrato bruto de anêmona marinha é mostrado aqui.O extrato bruto de anêmona marinha foi analisado pelo gel de poliacrilamida de 15%da SDS-PAGE e mostrou proteína de 10 kilodaltons a 250 kilodaltons de peso molecular. Aqui, a pista 1 é a escada de proteína e a pista 2 é veneno de anêmona marinha. Citolysinas foram detectadas na zona de peso molecular de 15 kilodaltons e 20 kilodaltons.Mostrado aqui é o ensaio de hemólise em eritrócitos de ovelhas. A atividade hemolítica do extrato antes e durante os ciclos de congelamento e descongelamento aumentou até que 100% da hemólise foi atingida com 50 microgramas da proteína total do extrato bruto nos dois últimos ciclos. A quantidade necessária para lise 50% de eritrócitos de ovelhas é de 11,1 0,3 microgramas por mililitro.A atividade de fosfolipase foi detectada pela formação de halos claros nas áreas da placa de ágar onde a amostra de extrato bruto foi aplicada. Os resultados mostram a presença de atividade fosfolipase a partir de 15 microgramas de proteína total. O diâmetro do halo aumentou de forma dependente de dose;ou seja, se a quantidade de extrato bruto aumentou, o diâmetro do halo aumentou.Ao tentar o procedimento, certifique-se de induzir a descarga do nematocisto, quantificar a proteína total, analisar extrato bruto pela eletroforese SDS-PAGE, calcular a quantidade de proteína extrato bruta para produzir 50% da hemólise e usar diferentes quantidades de proteína no ensaio fosfolipase. Podemos analisar o extrato bruto por técnica proteômica para identificar polipeptídeos com grande relevância em biotecnologia e biomedicina, até mesmo perfilar e caracterizar uma molécula única e depois produzi-la em laboratório para uma aplicação. Obtivemos parte da sequência de uma proteína performática com atividade antitumoral nas células epiteliais de carcinoma pulmonar obstinada humanas.Da mesma forma, identificamos a sequência de fosfolipases de interesse biotecnológico.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificação de pequenas proteínas de ligação da molécula em um Cellular ambiente nativo por célula vivo fotoafinidade Labeling

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Bioquímica

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Definindo substrato Especificidades para a lipase e fosfolipase candidatos

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparação da amostra para identificação de espectrometria de massa-baseada das regiões de ligação de RNA

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Preparação de hidrolisado de queratina de penas de galinha e sua aplicação em cosméticos

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

A identificação das feromonas de lampreia do mar usando guiada por bioensaio fracionamento

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...