Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), con número de subvención IT200819. Los autores agradecen a Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, por revisar la gramática inglesa de este manuscrito; y la asistencia técnica de Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada), y Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). También agradecemos al Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) por obtener sangre de oveja. Agradecemos especialmente al Dr. José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, por las instalaciones de su laboratorio para la grabación de video.

Las anémonas de mar fueron recolectadas de acuerdo a lineamientos de la Comisión Nacional de Acuacultura, Pesca y Alimentación del Gobierno Federal de México (número de permiso PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). El Comité de Bioética del Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional Autónoma de México aprobó todos los experimentos con anémonas de mar. La muestra de sangre ovina fue adquirida en el Centro de Enseñanza Práctica e Investigación en Producción y Sanidad Animal (CEPIPSA, Universidad Nacio...

<ol>
	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+antiprotozoal,+and+toxic+activities+of+Cnidarian+extracts+from+the+Mexican+Caribbean+Sea.">Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea.</a> Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).</li><li>S&#225;nchez-Rodr&#237;guez, J., Cruz-Vazquez, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+biological+characterization+of+neurotoxic+compounds+from+the+sea+anemone+Lebrunia+danae+(Duchassaing+and+Michelotti,+1860).">Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860).</a> Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).</li><li>de Oliveira, J. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. 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La alta demanda de nuevos compuestos con aplicaciones en diferentes campos de la ciencia y la industria ha llevado al estudio del veneno. El veneno representa una rica fuente de moléculas que sirve como plantilla para generar nuevas herramientas moleculares. Sin embargo, la complejidad de estos venenos requiere la implementación y combinación de varios métodos para obtenerlos y estudiarlos.
Aquí, mostramos un método para obtener y analizar el veneno de la anémona de mar Anthopleura ...

Los animales marinos son una rica fuente de compuestos biológicamente activos. En las últimas décadas, la composición del veneno de anémona de mar ha atraído la atención científica ya que comprende una diversidad de polipéptidos con actividad hemolítica, citotóxica, enzimática (fosfolipasa, proteasa, quitinasa) y neurotóxica y efectos inhibitorios sobre la actividad proteolítica1. Además, estos polipéptidos son fuentes potenciales para el desarrollo de herramientas moleculares en uso biotecnológico y terapéutico 2,3.
Hay pocos informes sobre el veneno de anémona de mar y sus componentes moleculares debido a la complejidad de obtener el veneno, incluso el aislamiento y la caracterización de toxinas. Los métodos de extracción utilizados en los informes implicaron la lisis y el vaciado del contenido de las células que están relacionadas y no relacionadas con la producción de veneno1.
Una característica particular en todos los cnidarios es la ausencia de un sistema para la producción y liberación del veneno centralizado en una sola región anatómica. En cambio, los nematocistos son estructuras que mantienen el veneno 4,5. Otros tipos de células, llamadas células de la glándula epidérmica, también secretan toxinas y también se distribuyen por todo el cuerpo de las anémonas de mar6.
El primer y más crucial reto en la obtención del veneno es la generación de un extracto con suficiente manipulación en procesos posteriores, sin la inactivación o degradación de proteínas lábiles. A continuación, las células deben ser lisadas, y los componentes, en este caso, los polipéptidos deben extraerse de manera eficiente y rápida, evitando la proteólisis y la hidrólisis mientras se eliminan otros componentes celulares7.
Se utilizan diferentes métodos para obtener el extracto crudo de una anémona de mar; algunos implican sacrificar el organismo, mientras que otros permiten que se mantenga vivo. Los métodos que implican el uso de todo el cuerpo del organismo permiten la liberación de la mayoría de las toxinas del veneno8, en comparación con los métodos que mantienen vivos a los organismos, que extraen solo algunos componentes del veneno9. La preparación de un extracto requiere evaluar la presencia y potencia de una sustancia de interés a través de un bioensayo específico, que incluye estrategias para observar los efectos farmacológicos por métodos in vivo o in vitro 10.
El veneno de anémona de mar contiene polipéptidos citolíticos, toxinas formadoras de poros (PFT)11 y fosfolipasas12; estas moléculas son modelos en el estudio de la interacción proteína-lípido, herramientas moleculares en la terapia del cáncer y biosensores basados en nanoporos3. La clasificación de los PFT de anémona de mar se realiza según su tamaño o peso molecular, de 5 kDa a 80 kDa. El PFT de 20 kDa, el más estudiado y conocido como actinoporinas11, es de particular interés por su potencial biomédico en el desarrollo de herramientas moleculares para posibles aplicaciones como biosensores anticancerígenos, antimicrobianos y basados en nanoporos. Otra citolisina, incluidas las fosfolipasas, específicamente la fosfolipasa A2 (PLA2)13, libera un ácido graso debido e hidroliza los fosfolípidos, desestabilizando la membrana celular. Debido a este mecanismo de acción, PLA2 promete ser un modelo esencial para el estudio y las aplicaciones en enfermedades inflamatorias. Podría servir como modelo para estudios del comportamiento lipídico en la membrana celular14.
Aquí, describimos un protocolo eficiente para obtener el extracto crudo de anémona de mar Anthopleura dowii Verrill, 1869, y detectar hemolisinas y fosfolipasas. Ambas son toxinas relevantes que podrían usarse como plantilla para diseñar nuevas herramientas moleculares.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

La composición del veneno de anémona de mar incluye moléculas polipeptídicas y no proteicas. Los componentes citolíticos tienen un alto potencial biotecnológico y biomédico para diseñar nuevas herramientas moleculares. El veneno de anémona de mar se localiza en las células glandulares del ectodermo y las estructuras subcelulares llamadas nematocistos, las cuales se distribuyen por todo el cuerpo de la anémona de mar. Esta característica implica desafíos porque las células y el nematocisto deben ser lisados para liberar los componentes del veneno con otras moléculas no tóxicas. Por lo tanto, primero, el veneno se deriva de un extracto crudo (mezcla de moléculas diferentes y diversas y restos de tejido). El siguiente paso es detectar polipéptidos con bioactividades específicas. Aquí, describimos una estrategia eficiente para obtener el extracto crudo de anémona de mar y bioensayo para identificar la presencia de citolisinas. El primer paso implica técnicas económicas y sencillas (ciclo agitado y de congelación-descongelación) para liberar citolisinas. Obtuvimos la mayor actividad citolítica y proteína (~500 mg de proteína de 20 g de peso seco). A continuación, se analizó la complejidad polipeptídica del extracto mediante el gel SDS-PAGE detectando proteínas con pesos moleculares entre 10 kDa y 250 kDa. En el ensayo hemolítico, utilizamos glóbulos rojos de oveja y determinamos HU50 (11,1 ± 0,3 μg/mL). Por el contrario, la presencia de fosfolipasas en el extracto crudo se determinó utilizando yema de huevo como sustrato en un medio sólido con agarosa. En general, este estudio utiliza un protocolo eficiente y económico para preparar el extracto crudo y aplica bioensayos replicables para identificar citolisinas, moléculas con intereses biotecnológicos y biomédicos.

Los resultados representativos del protocolo utilizado para obtener el extracto crudo de anémona de mar mostraron que la combinación de dos técnicas (agitación y ciclos de congelación y descongelación) produjo una descarga eficiente de nematocistos, y la cantidad total de proteína fue de 500 mg (8 mg/ml) (Figura 3).
La complejidad proteica del extracto crudo se pudo observar a partir de 10 kDa y superior a 250 kDa a través de la electroforesis SDS-PAGE. Ad...

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Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Aquí, describimos un protocolo para obtener extracto de veneno crudo de la anémona de mar y detectar su actividad hemolítica y fosfolipasa.

Identificación de la actividad hemolítica y fosfolipasa en extractos crudos de anémonas de mar mediante bioensayos sencillos

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

La interacción de la toxina de la anémona de mar debe utilizar el menor número de organismos y protocolos eficientes para obtener una gran diversidad y abundancia de las toxinas y la rápida identificación de una toxina específica. Combinamos dos técnicas eficientes para preparar el extracto crudo con una alta cantidad de proteína y describir ensayos reproducibles, específicos, rápidos y económicos para identificar la hemólisis y las bases fosfólicas en el veneno de anémona de mar. El método se puede utilizar en casi cualquier ejemplo que se decida identificar uno o ambos tipos de citolisinas.La eficiencia del método se logra cuidando los tiempos en cada paso mientras se prepara el extracto crudo. La clave de la hemólisis es el manejo cuidadoso del eritrocito para evitar la lisis mecánica, y en el ensayo de fosfólisis, cuidar la temperatura en la preparación de la placa. Demostrando el procedimiento estarán el Dr. Santos Ramírez-Carreto, la bióloga Sandra Salazar García y el biólogo Giovanni Macías Martínez de mi laboratorio.Comience limpiando la anémona de mar A.doi recolectada con agua destilada a mano para eliminar las grandes partículas de sustrato que se adhieren al cuerpo. Congelar inmediatamente los organismos a menos 80 grados centígrados en un ultracongelante durante 72 horas. Luego, coloque los organismos en vasos especiales para liofilización con condiciones de liofilización durante 48 horas.Para la hidratación de los tejidos, reconstituya 20 gramos de peso seco de organismos liofilizados con 60 mililitros de tampón de fosfato de sodio 50 milimolar y una tableta de cóctel inhibidor. En un agitador magnético, revuelva continuamente la muestra a alrededor de 800 RPM y cuatro grados Celsius durante 12 horas. Después de congelar la muestra a menos 20 grados centígrados durante 12 horas para inducir la lisis celular y la descarga de nematocistos, coloque el recipiente en agua a temperatura ambiente hasta que se descongele hasta un 90%Repita este procedimiento tres veces.Para aclarar el extracto, centrífuga la muestra a 25, 400 veces G durante 40 minutos a cuatro grados centígrados. Recupera el sobrenadante y centrífuga de nuevo. Repita el paso tres o cuatro veces y recupere el sobrenadante por fin.El sobrenadante recuperado o extracto crudo contiene los componentes del veneno y otras moléculas celulares como lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos. Determine la concentración de proteínas del extracto crudo utilizando un kit de ensayo colorimétrico comercial de Bradford. Incubar las muestras durante cinco minutos a temperatura ambiente sin agitar.Luego, mida la absorbancia a 595 nanómetros. Trazar los promedios de las absorbancias BSA de la muestra y determinar la ecuación del gráfico donde y es la absorbancia, m es la pendiente de la recta, x es la concentración de proteínas y b es la ordenada al origen. Para analizar el extracto crudo, agregue 30 microgramos del extracto crudo a cinco microlitros del tampón de carga de proteínas para desnaturalizar las proteínas.El volumen final debe ser inferior a 50 microlitros. Ejecute la electroforesis a 25 miliamperios constantes durante una hora y 30 minutos. Para evitar la difusión de las proteínas del gel, agregue la solución de fijación a las proteínas e incube a temperatura ambiente durante 40 minutos con agitación a 80 RPM.Luego, decante la solución y agregue la solución de reticulación de proteínas. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación a 80 RPM. Retire la solución y lave el gel con 100 mililitros de agua destilada durante cinco minutos.Después de eso, retire el agua y repita este procedimiento cuatro veces. Realice la tinción de proteínas con 50 mililitros de solución filtrada Coomassie Brilliant Blue R-250 agitando a 60 RPM en un oscilador rotativo de laboratorio a temperatura ambiente durante 15 minutos. Extraiga un mililitro de sangre de la vena yugular de una oveja y retire la aguja de la jeringa.Drene inmediatamente la sangre en un tubo con 50 mililitros de solución de Alsever y centrífuga a 804 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y agregue 30 mililitros de solución de Alsever deslizándolo a lo largo de las paredes internas del tubo. Resuspender lentamente el pellet con una pipeta de plástico Pasteur y centrifugar la solución de nuevo a 804 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.Repita este procedimiento hasta que se aclare el sobrenadante. Mantener el volumen final de la solución de Alsever para lograr una concentración de 2 millones de células por mililitro aproximadamente. Luego, use una cámara neubauer o un hemocitómetro para contar las células.Incubar las mezclas de solución durante una hora a 37 grados Celsius sin agitar y luego centrifugar la placa a 804 veces G durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Recupere el sobrenadante en otra placa de 96 pocillos con fondo plano. Si el extracto crudo contiene citolisinas, los eritrocitos lisarán y liberarán hemoglobina.Lea la absorbancia a 415 nanómetros y calcule la cantidad de extracto que produce hemólisis en el 50% de los eritrocitos. Aumente la cantidad de extracto crudo de anémona de mar y diseñe la parcela con ajustes sigmoidales utilizando el software adecuado. Lave un huevo de gallina con 1% SDS en agua destilada y separe la yema de huevo de la clara de huevo en condiciones estériles.Prepare las soluciones A, B, C y D.Agregue 500 microlitros de las soluciones A y C a la solución B y 100 microlitros de la solución D.Mezcle y vierta 25 mililitros en cada placa de Petri. Espere a que la solución se solidifique en condiciones estériles y haga pocillos de aproximadamente dos a tres milímetros de diámetro con un tubo delgado. Agregue un total de 20 microlitros de tampón de fosfato como control negativo en un pozo y 20 microlitros de una fosfolipasa determinada como control positivo en otro pozo.Coloque diferentes cantidades de la proteína de extracto crudo 5, 15, 25, 35 y 45 microgramos en los pocillos restantes, cada uno en un volumen final de 20 microlitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 20 horas. Los resultados representativos del protocolo utilizado para obtener el extracto crudo de anémona de mar mostraron que combinando dos técnicas, agitación y ciclos de congelación y descongelación, produjo una descarga eficiente de nematocistos.Los nematocitos antes y después de los estímulos se muestran aquí. El túbulo del nematocisto está expuesto en esta imagen, lo que indica la liberación de toxinas. El perfil electroforético del extracto crudo de anémona de mar se muestra aquí.El extracto crudo de anémona de mar fue analizado por SDS-PAGE 15%polyacrylamide gel y mostró proteínas de 10 kilodaltons a 250 kilodaltons de peso molecular. Aquí, el carril 1 es la escalera de proteínas y el carril 2 es el veneno de anémona de mar. Se detectaron citolisinas en la zona de peso molecular de 15 kilodaltons y 20 kilodaltons.Aquí se muestra el ensayo de hemólisis en eritrocitos de ovejas. La actividad hemolítica del extracto antes y durante los ciclos de congelación y descongelación aumentó hasta alcanzar el 100% de hemólisis con 50 microgramos de la proteína total del extracto crudo en los dos últimos ciclos. La cantidad necesaria para lisar el 50% de eritrocitos de oveja es de 11,1 0,3 microgramos por mililitro.La actividad de la fosfolipasa se detectó mediante la formación de halos claros en las áreas de la placa de agar donde se aplicó la muestra de extracto crudo. Los resultados muestran la presencia de actividad fosfolipasa a partir de 15 microgramos de proteína total. El diámetro del halo aumentó de una manera dependiente de la dosis; es decir, si la cantidad de extracto crudo aumentó, el diámetro del halo aumentó.Mientras intenta el procedimiento, asegúrese de inducir la descarga de nematocistos, cuantificar la proteína total, analizar el extracto crudo por electroforesis SDS-PAGE, calcular la cantidad de proteína de extracto crudo para producir el 50% de la hemólisis y usar diferentes cantidades de proteína en el ensayo de fosfolipasa. Podemos analizar el extracto crudo por técnica proteómica para identificar polipéptidos con gran relevancia en biotecnología y biomedicina, incluso perfilar y caracterizar una molécula única y luego producirla en el laboratorio para una aplicación. Se obtuvo parte de la secuencia de una proteína ejecutora con actividad antitumoral en las células epiteliales del carcinoma de pulmón obstruido humano.Asimismo, identificamos la secuencia de fosfolipasas de interés biotecnológico.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identificación de las pequeñas proteínas de unión a la molécula-celular en un entorno nativo de Células vivas marcado por fotoafinidad

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Investigación

Bioquímica

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

La definición de Sustrato especificidades para la lipasa y la fosfolipasa candidatos

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Preparación de muestras para identificación basada en espectrometría de masa de regiones de unión de ARN

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Preparación de hidrolizado de queratina de plumas de pollo y su aplicación en cosméticos

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Aislamiento y medidas respiratoria de las mitocondrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificación de quinasa dependiente de ciclina 1 sitios específicos de fosforilación por una quinasa In Vitro ensayo

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

La identificación de las feromonas de la lamprea de mar usando fraccionamiento guiado por bioensayo

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Detección de actividad de fosfolipasa C en el homogeneizado de cerebro de la abeja

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...