Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), med bidragsnummer IT200819. Författarna erkänner Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC, för att ha kontrollerat den engelska grammatiken i detta manuskript; och tekniskt bistånd från Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) och Juan Manuel Barbosa Castillo (Instituto de Fisiología Celular, UNAM). Vi tackar också Dr Augusto César Lizarazo Chaparro (CEPIPSA) för att få fårblod. Vi tackar särskilt Dr José Saniger Blesa, ICAT-UNAM, för anläggningarna i hans laboratorium för videoinspelningen.

Havsanemonerna samlades in enligt riktlinjer från National Commission for Aquaculture, Fisheries and Food från Mexikos federala regering (tillståndsnummer PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Bioetikkommittén vid Institute of Biotechnology, National Autonomous University of Mexico godkände alla experiment med havsanemoner. Fårblodprovet köptes vid Center for Practical Teaching and Research in Animal Production and Health (CEPIPSA, National Autonomous University of Mexico).
1. Insamlin...

<ol>
	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+toxins:+recent+evidences+for+potential+therapeutic+uses.">Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses.</a> The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodr&#237;guez-Almaz&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinoporins:+From+the+structure+and+function+to+the+generation+of+biotechnological+and+therapeutic+tools.">Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools.</a> Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).</li><li>Fautin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity,+systematics,+and+evolution+of+cnidae.+Toxicon.">Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon.</a> Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+soluble+protein+contents+from+the+nematocysts+of+a+model+sea+anemone+sheds+light+on+venom+evolution.">Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution.</a> Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxin+localization+to+ectodermal+gland+cells+uncovers+an+alternative+mechanism+of+venom+delivery+in+sea+anemones.">Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).</li><li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification.">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).</li><li>Bulati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+purified+extracts+of+sea+anemone+Anemonia+viridis+affect+the+growth+and+viability+of+selected+tumour+cell+lines.">Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines.</a> BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).</li><li>Orts, D. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+electrophysiological+characterization+of+two+sea+anemone+type+1+potassium+toxins+from+a+geographically+distant+population+of+Bunodosoma+caissarum.">Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum.</a> Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).</li><li>Hader, D., Erzinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).</li><li>Anderluh, G., Macek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytolytic+peptide+and+protein+toxins+from+sea+anemones+(Anthozoa:+Actiniaria).">Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria).</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).</li><li>Nevalainen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+in+cnidaria.">Phospholipase A2 in cnidaria.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).</li><li>Razpotnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+phospholipase+A2+isolated+from+the+sea+anemone+Urticina+crassicornis+-+its+primary+structure+and+phylogenetic+classification.">A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification.</a> The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).</li><li>Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+enzymes:+Physical+structure,+biological+function,+disease+implication,+chemical+inhibition,+and+therapeutic+intervention.">Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention.</a> Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+a+venom+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+cavernata.">Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).</li><li>Morales-Landa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+antiprotozoal,+and+toxic+activities+of+Cnidarian+extracts+from+the+Mexican+Caribbean+Sea.">Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea.</a> Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).</li><li>S&#225;nchez-Rodr&#237;guez, J., Cruz-Vazquez, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+biological+characterization+of+neurotoxic+compounds+from+the+sea+anemone+Lebrunia+danae+(Duchassaing+and+Michelotti,+1860).">Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860).</a> Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).</li><li>de Oliveira, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caissarolysin+I+(Bcs+I),+a+new+hemolytic+toxin+from+the+Brazilian+sea+anemone+Bunodosoma+caissarum:+purification+and+biological+characterization.">Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).</li><li>Norton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crude+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+caissarum+elicits+convulsions+in+mice:+possible+involvement+of+the+glutamatergic+system.">The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).</li><li>Dion, A. S., Pomenti, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+lipids+of+sheep+red+blood+cells.+I.+Lipid+composition+in+low+and+high+potassium+red+cells.">Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells.</a> Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+and+proteomic+analysis+of+the+tentacles+and+mucus+of+Anthopleura+dowii+Verrill,+1869.">Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869.</a> Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).</li></ol>

Den stora efterfrågan på nya föreningar med tillämpningar inom olika områden av vetenskap och industri har lett till studier av gift. Gift representerar en rik källa till molekyler som fungerar som en mall för att generera nya molekylära verktyg. Komplexiteten hos dessa gifter kräver emellertid implementering och kombination av olika metoder för att erhålla och studera dem.
Här visar vi en metod för att erhålla och analysera giftet från havsanemonen Anthopleura dowii, V...

Marina djur är en rik källa till biologiskt aktiva föreningar. Under de senaste decennierna har sammansättningen av havsanemongift väckt vetenskaplig uppmärksamhet eftersom den omfattar en mångfald av polypeptider med hemolytisk, cytotoxisk, enzymatisk (fosfolipas, proteas, kitinas) och neurotoxisk aktivitet och hämmande effekter på proteolytisk aktivitet1. Dessutom är dessa polypeptider potentiella källor för utveckling av molekylära verktyg i bioteknisk och terapeutisk användning 2,3.
Det finns få rapporter om havsanemongift och dess molekylära komponenter på grund av komplexiteten att erhålla giftet, till och med isolering och karakterisering av toxiner. Extraktionsmetoderna som användes i rapporterna involverade lys och tömning av innehållet i celler som är relaterade och inte relaterade till giftproduktionen1.
En särskild egenskap hos alla cnidarians är frånvaron av ett system för produktion och frisättning av giftet centraliserat i en enda anatomisk region. Istället är nematocysterna strukturer som håller giftet 4,5. Andra typer av celler, som kallas epidermala körtelceller, utsöndrar också toxiner och fördelas också över hela kroppen av havsanemoner6.
Den första och mest avgörande utmaningen för att erhålla giftet är genereringen av ett extrakt med tillräcklig manipulation i efterföljande processer, utan inaktivering eller nedbrytning av labila proteiner. Därefter måste cellerna lyseras och komponenterna - i detta fall måste polypeptider extraheras effektivt och snabbt, vilket undviker proteolys och hydrolys samtidigt som andra cellulära komponenterelimineras 7.
Olika metoder används för att erhålla det råa extraktet av en havsanemon; vissa innebär att offra organismen medan andra tillåter den att hållas vid liv. Metoder som innebär användning av organismens hela kropp möjliggör frisättning av de flesta toxiner från giftet8, jämfört med metoder som håller organismer vid liv, som extraherar endast vissa komponenter i giftet9. Beredningen av ett extrakt kräver utvärdering av närvaron och styrkan hos ett ämne av intresse genom en specifik bioassay, som inkluderar strategier för att observera de farmakologiska effekterna med in vivo - eller in vitro-metoder 10.
Havsanemongift innehåller cytolytiska polypeptider, porbildande toxiner (PFT)11 och fosfolipaser12; dessa molekyler är modeller i studien av protein-lipidinteraktion, molekylära verktyg i cancerterapi och biosensorer baserade på nanopor3. Klassificeringen av havsanemon PFT utförs enligt deras storlek eller molekylvikt, från 5 kDa till 80 kDa. 20 kDa PFT, den mest studerade och kända som aktinoporiner11, är av särskilt intresse för sin biomedicinska potential i utvecklingen av molekylära verktyg för möjliga tillämpningar som anticancer, antimikrobiella och nanoporbaserade biosensorer. Ett annat cytolysin, inklusive fosfolipaser, specifikt fosfolipas A2 (PLA2)13, frigör en fettsyra på grund av och hydrolyserar fosfolipider, destabiliserar cellmembranet. På grund av denna verkningsmekanism lovar PLA2 att vara en viktig modell för studier och tillämpningar vid inflammatoriska sjukdomar. Det kan fungera som en modell för studier av lipidbeteende i cellmembranet14.
Här beskriver vi ett effektivt protokoll för att erhålla det råa extraktet från havsanemonen Anthopleura dowii Verrill, 1869, och detektera hemolysiner och fosfolipaser. Båda är relevanta toxiner som kan användas som mall för att designa nya molekylära verktyg.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

Havsanemongiftkomposition innefattar polypeptid- och icke-proteinmolekyler. Cytolytiska komponenter har en hög bioteknisk och biomedicinsk potential för att designa nya molekylära verktyg. Havsanemongift lokaliseras i körtelceller från ektoderm och subcellulära strukturer som kallas nematocyster, som båda är fördelade över hela havsanemonkroppen. Denna egenskap innebär utmaningar eftersom cellerna och nematocysten måste lyseras för att frigöra giftkomponenterna med andra giftfria molekyler. Därför härrör giftet först från ett grovt extrakt (blandning av olika och olika molekyler och vävnadsskräp). Nästa steg är att detektera polypeptider med specifika bioaktiviteter. Här beskriver vi en effektiv strategi för att erhålla havsanemonråextraktet och bioassay för att identifiera närvaron av cytolysiner. Det första steget innebär billiga och enkla tekniker (omrörd och frys-tina cykel) för att frigöra cytolysiner. Vi erhöll den högsta cytolytiska aktiviteten och proteinet (~ 500 mg protein från 20 g torrvikt). Därefter analyserades polypeptidkomplexiteten hos extraktet av SDS-PAGE-gel som detekterade proteiner med molekylvikter mellan 10 kDa och 250 kDa. I den hemolytiska analysen använde vi fårröda blodkroppar och bestämde HU50 (11,1 ± 0,3 μg / ml). Däremot bestämdes närvaron av fosfolipaser i det råa extraktet med användning av äggula som substrat i ett fast medium med agaros. Sammantaget använder denna studie ett effektivt och billigt protokoll för att förbereda det råa extraktet och tillämpar replikerbara bioassays för att identifiera cytolysiner, molekyler med biotekniska och biomedicinska intressen.

De representativa resultaten av protokollet som användes för att erhålla det råa extraktet av havsanemon visade att kombinationen av två tekniker (omrörning och cykler av frysning och upptining) gav en effektiv urladdning av nematocyster, och den totala mängden protein var 500 mg (8 mg / ml) (figur 3).
Det råa extraktets proteinkomplexitet kunde observeras från 10 kDa och större än 250 kDa genom SDS-PAGE-elektrofores. Dessutom detekterades cytolysiner i...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla rågiftextrakt från havsanemon och detektera dess hemolytiska och fosfolipasaktivitet.

Identifiering av hemolytisk och fosfolipasaktivitet i råa extrakt från havsanemoner genom enkla bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Havsanemontoxininteraktion måste använda minst antal organismer och effektiva protokoll för att få stor mångfald och överflöd av toxinerna och snabb identifiering av ett specifikt toxin. Vi kombinerade två effektiva tekniker för att förbereda det råa extraktet med en hög mängd protein och beskriva reproducerbara, specifika, snabba och billiga analyser för att identifiera hemolys och fosfolic baser i havsanemongiftet. Metoden kan användas i nästan alla exempel som beslutas för att identifiera en eller båda typerna av cytolysiner.Metodens effektivitet uppnås genom att ta hand om tiderna i varje steg medan man förbereder det råa extraktet. Nyckeln till hemolys är noggrann hantering av erytrocyten för att undvika mekanisk lys och i fosfolysanalys, ta hand om temperaturen vid beredningen av plattan. Demonstrerar proceduren kommer att vara Dr.Santos Ramirez-Carreto, biolog Sandra Salazar Garcia och biolog Giovanni Macias Martinez från mitt laboratorium.Börja med att rengöra den uppsamlade havsanemonen A.doi med destillerat vatten för hand för att ta bort de stora substratpartiklarna som fäster vid kroppen. Frys omedelbart organismerna vid minus 80 grader Celsius i en ultrafrysare i 72 timmar. Placera sedan organismerna i speciella glasögon för frystorkning med lyofiliseringsförhållanden i 48 timmar.För vävnadshydrering, rekonstituera 20 gram torrvikt av lyofiliserade organismer med 60 ml 50-millimolär natriumfosfatbuffert och en hämmare cocktailtablett. I en magnetisk omrörare, rör kontinuerligt provet vid cirka 800 varv / min och fyra grader Celsius i 12 timmar. Efter frysning av provet vid minus 20 grader Celsius i 12 timmar för att inducera celllys och nematocystutsläpp, placera behållaren i vatten vid rumstemperatur tills den tinar upp till 90%Upprepa denna procedur tre gånger.För att klargöra extraktet, centrifugera provet vid 25 400 gånger G i 40 minuter vid fyra grader Celsius. Återställ supernatanten och centrifugera den igen. Upprepa steget tre till fyra gånger och återställ supernatanten äntligen.Det återvunna supernatant- eller råextraktet innehåller giftkomponenterna och andra cellmolekyler såsom lipider, kolhydrater och nukleinsyror. Bestäm proteinkoncentrationen av råextraktet med hjälp av en kommersiell Bradford kolorimetrisk analyssats. Inkubera proverna i fem minuter vid rumstemperatur utan att skaka.Mät sedan absorbansen vid 595 nanometer. Plotta medelvärdena för provet BSA-absorbanser och bestäm ekvationen för grafen där y är absorbansen, m är linjens lutning, x är proteinkoncentrationen och b är ordinaten till ursprunget. För att analysera det råa extraktet, tillsätt 30 mikrogram av det råa extraktet till fem mikroliter av proteinladdningsbufferten för att denaturera proteinerna.Den slutliga volymen måste vara mindre än 50 mikroliter. Kör elektrofores med 25 milliampere konstant i en timme och 30 minuter. För att undvika diffusion av gelproteinerna, tillsätt fixeringslösningen till proteinerna och inkubera vid rumstemperatur i 40 minuter med skakning vid 80 RPM.Dekantera sedan lösningen och tillsätt proteinets tvärbindningslösning. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur med skakning vid 80 RPM. Ta bort lösningen och tvätta gelén med 100 ml destillerat vatten i fem minuter.Ta sedan bort vattnet och upprepa denna procedur fyra gånger. Utför proteinfärgning med 50 ml Coomassie Brilliant Blue R-250 filtrerad lösning under omrörning vid 60 rpm i en laboratorieroterande oscillator vid rumstemperatur i 15 minuter. Extrahera en milliliter blod från halsen på ett får och ta bort nålen från sprutan.Töm omedelbart blod i ett rör med 50 ml Alsever-lösning och centrifug vid 804 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Kassera supernatanten och tillsätt 30 ml Alsever-lösning genom att skjuta den längs rörets innerväggar. Resuspendera långsamt pelletsen med en Pasteur-plastpipett och centrifugera lösningen igen vid 804 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Upprepa denna procedur tills supernatanten är klargjord. Behåll den slutliga volymen av Alsever-lösningen för att uppnå en koncentration av 2 miljoner celler per milliliter ungefär. Använd sedan en Neubauer-kammare eller hemocytometer för att räkna cellerna.Inkubera lösningsblandningarna i en timme vid 37 grader Celsius utan att skaka och centrifugera sedan plattan vid 804 gånger G i fem minuter vid fyra grader Celsius. Återställ supernatanten i en annan 96-brunnsplatta med en platt botten. Om det råa extraktet innehåller cytolysiner kommer erytrocyter att lysa och frigöra hemoglobin.Läs absorbansen vid 415 nanometer och beräkna mängden extrakt som producerar hemolys i 50% av erytrocyterna. Öka mängden havsanemonråextrakt och utforma tomten med sigmoidala justeringar med hjälp av lämplig programvara. Tvätta ett kycklingägg med 1% SDS i destillerat vatten och separera äggulan från äggvitan under sterila förhållanden.Förbered lösningarna A, B, C och D.Tillsätt 500 mikroliter lösningar A och C till lösning B och 100 mikroliter lösning D.Blanda dem och häll 25 ml i varje petriskål. Vänta tills lösningen stelnar under sterila förhållanden och gör brunnar med ungefär två till tre millimeter i diameter med ett tunt rör. Tillsätt totalt 20 mikroliter fosfatbuffert som en negativ kontroll i en brunn och 20 mikroliter av ett bestämt fosfolipas som en positiv kontroll i en annan brunn.Placera olika mängder av råextraktproteinet 5, 15, 25, 35 och 45 mikrogram i de återstående brunnarna, var och en i en slutlig volym på 20 mikroliter. Inkubera vid 37 grader Celsius i 20 timmar. De representativa resultaten av protokollet som användes för att erhålla det råa extraktet av havsanemon visade att kombinationen av två tekniker, agitation och cykler av frysning och upptining, gav en effektiv urladdning av nematocyster.Nematocyterna före och efter stimuli visas här. Nematocysttubulen exponeras i denna bild, vilket indikerar toxinfrisättningen. Den elektroforetiska profilen för havsanemonråextrakt visas här.Havsanemonråextraktet analyserades av SDS-PAGE 15% polyakrylamidgel och visade protein från 10 kilodalton till 250 kilodalton molekylvikt. Här är lane 1 proteinstegen och lane 2 är havsanemongift. Cytolysiner detekterades i molekylviktszonen på 15 kilodalton och 20 kilodalton.Här visas hemolysanalysen i erytrocyter från får. Den hemolytiska aktiviteten hos extraktet före och under frysnings- och upptiningscyklerna ökade tills 100% hemolys uppnåddes med 50 mikrogram av det totala råextraktproteinet under de två senaste cyklerna. Mängden som behövs för att lysa 50% fårerytrocyter är 11,1 0,3 mikrogram per milliliter.Fosfolipasaktivitet detekterades genom bildandet av klara halos i de områden av agarplattan där råextraktprovet applicerades. Resultaten visar närvaron av fosfolipasaktivitet från 15 mikrogram totalt protein. Haloens diameter ökade på ett dosberoende sätt; det vill säga om mängden råextrakt ökade, ökade haloens diameter.När du försöker proceduren, se till att inducera nematocyst urladdning, kvantitera det totala proteinet, analysera råextrakt med SDS-PAGE elektrofores, beräkna mängden råextraktprotein för att producera 50% av hemolysen och använd olika mängder protein i fosfolipasanalys. Vi kan analysera det råa extraktet med proteomisk teknik för att identifiera polypeptider med stor relevans inom bioteknik och biomedicin, till och med profilera och karakterisera en unik molekyl och sedan producera den i laboratoriet för en applikation. Vi erhöll en del av sekvensen av ett utförande protein med antitumöraktivitet i de humana obdurate lungkarcinoma epitelcellerna.På samma sätt identifierar vi sekvensen av fosfolipaser av biotekniskt intresse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Identifiering av liten molekyl-bindande proteiner i en Native Cellular miljö med Live-cell fotoaffinitetsmärkning

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Definiera substratspecificiteter för lipas och fosfolipas kandidater

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Provberedning för Mass Spectrometry-baserade identifiering av RNA-bindande regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Beredning av Keratin hydrolysat från kyckling fjädrar och dess tillämpning i kosmetika

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestämning av proteashämmare specificitet i mus vävnad extrakt av MALDI-TOF-masspektrometri: manipulera PH för att orsaka specificitet förändringar

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Identifiering av havet nejonöga feromoner med hjälp av Bioassay-guidad fraktionering

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Påvisande av fosfolipas C aktivitet i hjärnan Homogenatet från honungsbiet

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...