Name: identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays
Uploaded: 2022-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Bu çalışma Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT) tarafından IT200819 hibe numarası ile desteklenmiştir. Yazarlar, Tom Musselman, Rock Paper Editing, LLC'ye bu makalenin İngilizce dilbilgisini kontrol ettiği için teşekkür eder; ve Samanta Jiménez (CICESE, Ensenada) ve Juan Manuel Barbosa Castillo'nun (Instituto de Fisiología Celular, UNAM) teknik yardımı. Ayrıca koyun kanı elde ettiği için Dr. Augusto César Lizarazo Chaparro'ya (CEPIPSA) teşekkür ederiz. Özellikle ICAT-UNAM Dr. José Saniger Blesa'ya video kaydı için laboratuvarındaki tesisler için teşekkür ederiz.

Deniz anemonları, Meksika Federal Hükümeti Ulusal Su Ürünleri Yetiştiriciliği, Balıkçılık ve Gıda Komisyonu yönergelerine göre toplanmıştır (izin numarası PPF / DGOPTA 07332.250810.4060). Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Biyoetik Komitesi, deniz anemonlarıyla yapılan tüm deneyleri onayladı. Koyun kanı örneği, Hayvansal Üretim ve Sağlık Pratik Öğretim ve Araştırma Merkezi'nden (CEPIPSA, Meksika Ulusal Özerk Üniversitesi) satın alındı.
<p class="jove_tit...

<ol>
	<li>Fraz&#227;o, B., Vasconcelos, V., Antunes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+anemone+(Cnidaria,+Anthozoa,+Actiniaria)+toxins:+an+overview.">Sea anemone (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria) toxins: an overview.</a> Marine Drugs. 10 (8), 1812-1851 (2012).</li><li>Jayathilake, J. M. N. J., Gunathilake, K. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarian+toxins:+recent+evidences+for+potential+therapeutic+uses.">Cnidarian toxins: recent evidences for potential therapeutic uses.</a> The European Zoological Journal. 87 (1), 708-713 (2020).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., Miranda-Zaragoza, B., Rodr&#237;guez-Almaz&#225;n, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actinoporins:+From+the+structure+and+function+to+the+generation+of+biotechnological+and+therapeutic+tools.">Actinoporins: From the structure and function to the generation of biotechnological and therapeutic tools.</a> Biomolecules. 10 (4), 539 (2020).</li><li>Fautin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+diversity,+systematics,+and+evolution+of+cnidae.+Toxicon.">Structural diversity, systematics, and evolution of cnidae. Toxicon.</a> Official Journal of the International Society on Toxinology. 54 (8), 1054-1064 (2009).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+soluble+protein+contents+from+the+nematocysts+of+a+model+sea+anemone+sheds+light+on+venom+evolution.">Analysis of soluble protein contents from the nematocysts of a model sea anemone sheds light on venom evolution.</a> Marine Biotechnology. 15 (3), 329-339 (2013).</li><li>Moran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotoxin+localization+to+ectodermal+gland+cells+uncovers+an+alternative+mechanism+of+venom+delivery+in+sea+anemones.">Neurotoxin localization to ectodermal gland cells uncovers an alternative mechanism of venom delivery in sea anemones.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 279 (1732), 1351-1358 (2012).</li><li>Grabski, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+preparation+of+biological+extracts+for+protein+purification.">Advances in preparation of biological extracts for protein purification.</a> Methods in Enzymology. 463, 285-303 (2009).</li><li>Bulati, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+purified+extracts+of+sea+anemone+Anemonia+viridis+affect+the+growth+and+viability+of+selected+tumour+cell+lines.">Partially purified extracts of sea anemone Anemonia viridis affect the growth and viability of selected tumour cell lines.</a> BioMed Research International. 2016, 3849897 (2016).</li><li>Orts, D. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+electrophysiological+characterization+of+two+sea+anemone+type+1+potassium+toxins+from+a+geographically+distant+population+of+Bunodosoma+caissarum.">Biochemical and electrophysiological characterization of two sea anemone type 1 potassium toxins from a geographically distant population of Bunodosoma caissarum.</a> Marine Drugs. 11 (3), 655-679 (2013).</li><li>Hader, D., Erzinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioassays: Advanced Methods and Applications. , (2017).</li><li>Anderluh, G., Macek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytolytic+peptide+and+protein+toxins+from+sea+anemones+(Anthozoa:+Actiniaria).">Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria).</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (2), 111-124 (2002).</li><li>Nevalainen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+in+cnidaria.">Phospholipase A2 in cnidaria.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. Part B, Biochemistry &amp; Molecular Biology. 139 (4), 731-735 (2004).</li><li>Razpotnik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+phospholipase+A2+isolated+from+the+sea+anemone+Urticina+crassicornis+-+its+primary+structure+and+phylogenetic+classification.">A new phospholipase A2 isolated from the sea anemone Urticina crassicornis - its primary structure and phylogenetic classification.</a> The FEBS Journal. 277 (12), 2641-2653 (2010).</li><li>Dennis, E. A., Cao, J., Hsu, Y. -. H., Magrioti, V., Kokotos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+A2+enzymes:+Physical+structure,+biological+function,+disease+implication,+chemical+inhibition,+and+therapeutic+intervention.">Phospholipase A2 enzymes: Physical structure, biological function, disease implication, chemical inhibition, and therapeutic intervention.</a> Chemical Reviews. 111 (10), 6130-6185 (2011).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li><li>Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis.">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663 (2015).</li><li>Eno, A. E., Konya, R. S., Ibu, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+a+venom+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+cavernata.">Biological properties of a venom extract from the sea anemone, Bunodosoma cavernata.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 36 (12), 2013-2020 (1998).</li><li>Morales-Landa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial,+antiprotozoal,+and+toxic+activities+of+Cnidarian+extracts+from+the+Mexican+Caribbean+Sea.">Antimicrobial, antiprotozoal, and toxic activities of Cnidarian extracts from the Mexican Caribbean Sea.</a> Pharmaceutical Biology. 45 (1), 37-43 (2007).</li><li>S&#225;nchez-Rodr&#237;guez, J., Cruz-Vazquez, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+biological+characterization+of+neurotoxic+compounds+from+the+sea+anemone+Lebrunia+danae+(Duchassaing+and+Michelotti,+1860).">Isolation and biological characterization of neurotoxic compounds from the sea anemone Lebrunia danae (Duchassaing and Michelotti, 1860).</a> Archives of Toxicology. 80 (7), 436-441 (2006).</li><li>de Oliveira, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caissarolysin+I+(Bcs+I),+a+new+hemolytic+toxin+from+the+Brazilian+sea+anemone+Bunodosoma+caissarum:+purification+and+biological+characterization.">Caissarolysin I (Bcs I), a new hemolytic toxin from the Brazilian sea anemone Bunodosoma caissarum: purification and biological characterization.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1760 (3), 453-461 (2006).</li><li>Norton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterisation+of+proteins+with+cardiac+stimulatory+and+haemolytic+activity+from+the+anemone+Actinia+tenebrosa.">Purification and characterisation of proteins with cardiac stimulatory and haemolytic activity from the anemone Actinia tenebrosa.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 28 (1), 29-41 (1990).</li><li>Gondran, M., Eckeli, A. L., Migues, P. V., Gabilan, N. H., Rodrigues, A. L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crude+extract+from+the+sea+anemone,+Bunodosoma+caissarum+elicits+convulsions+in+mice:+possible+involvement+of+the+glutamatergic+system.">The crude extract from the sea anemone, Bunodosoma caissarum elicits convulsions in mice: possible involvement of the glutamatergic system.</a> Toxicon: Official Journal of the International Society on Toxinology. 40 (12), 1667-1674 (2002).</li><li>Dion, A. S., Pomenti, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammoniacal+silver+staining+of+proteins:+mechanism+of+glutaraldehyde+enhancement.">Ammoniacal silver staining of proteins: mechanism of glutaraldehyde enhancement.</a> Analytical Biochemistry. 129 (2), 490-496 (1983).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+pore-forming+protein+from+sea+anemone+Anthopleura+dowii+Verrill+(1869)+venom+by+mass+spectrometry.">Identification of a pore-forming protein from sea anemone Anthopleura dowii Verrill (1869) venom by mass spectrometry.</a> The Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 25, 147418 (2019).</li><li>Nelson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+lipids+of+sheep+red+blood+cells.+I.+Lipid+composition+in+low+and+high+potassium+red+cells.">Studies on the lipids of sheep red blood cells. I. Lipid composition in low and high potassium red cells.</a> Lipids. 2 (1), 64-71 (1967).</li><li>Ram&#237;rez-Carreto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+and+proteomic+analysis+of+the+tentacles+and+mucus+of+Anthopleura+dowii+Verrill,+1869.">Transcriptomic and proteomic analysis of the tentacles and mucus of Anthopleura dowii Verrill, 1869.</a> Marine Drugs. 17 (8), 436 (2019).</li></ol>

Bilim ve endüstrinin farklı alanlarındaki uygulamalara sahip yeni bileşiklere olan yüksek talep, zehir çalışmalarına yol açmıştır. Venom, yeni moleküler araçlar üretmek için bir şablon görevi gören zengin bir molekül kaynağını temsil eder. Bununla birlikte, bu zehirlerin karmaşıklığı, bunları elde etmek ve incelemek için çeşitli yöntemlerin uygulanmasını ve birleştirilmesini gerektirir.
Burada, liyofilize örneklerle başlayan diğer deniz anemon türlerini...

Deniz hayvanları, biyolojik olarak aktif bileşiklerin zengin bir kaynağıdır. Son yıllarda, deniz anemon zehirinin bileşimi, hemolitik , sitotoksik, enzimatik (fosfolipaz, proteaz, kitinaz) ve nörotoksik aktiviteye sahip polipeptitlerin çeşitliliğini ve proteolitik aktivite üzerindeki inhibitör etkileri içerdiğinden bilimsel dikkat çekmiştir1. Ek olarak, bu polipeptitler biyoteknolojik ve terapötik kullanımda moleküler araçların geliştirilmesi için potansiyel kaynaklardır 2,3.
Deniz anemon zehiri ve moleküler bileşenleri hakkında, zehirin elde edilmesinin, hatta izolasyonun ve toksinlerin karakterizasyonunun karmaşıklığı nedeniyle çok az rapor vardır. Raporlarda kullanılan ekstraksiyon yöntemleri, zehir üretimi ile ilişkili ve ilgisi olmayan hücrelerin içeriğinin lizis ve boşaltılmasını içeriyordu1.
Tüm cnidarian'larda özel bir özellik, tek bir anatomik bölgede merkezileştirilmiş zehirin üretimi ve serbest bırakılması için bir sistemin olmamasıdır. Bunun yerine, nematosistler zehiritutan yapılardır 4,5. Epidermal bez hücreleri olarak adlandırılan diğer hücre tipleri de toksinler salgılar ve ayrıca deniz anemonlarının vücuduna dağılır6.
Zehirin elde edilmesindeki ilk ve en önemli zorluk, kararsız proteinlerin inaktivasyonu veya bozulması olmadan, sonraki işlemlerde yeterli manipülasyona sahip bir ekstraktın üretilmesidir. Daha sonra, hücreler lize edilmeli ve bileşenler - bu durumda, polipeptitler verimli ve hızlı bir şekilde ekstrakte edilmeli, proteoliz ve hidrolizden kaçınırken, diğer hücresel bileşenleri ortadan kaldırmalıdır7.
Bir deniz anemonunun ham ekstraktını elde etmek için farklı yöntemler kullanılır; bazıları organizmayı feda etmeyi içerirken, diğerleri canlı tutulmasına izin verir. Organizmanın tüm vücudunun kullanımını ima eden yöntemler, zehirin sadece bazı bileşenlerini çıkaran organizmaları canlı tutan yöntemlere kıyasla, zehir8'den çoğu toksinin salınmasına izin verir9. Bir ekstraktın hazırlanması, ilgilenilen bir maddenin varlığının ve gücünün, farmakolojik etkileri in vivo veya in vitro yöntemlerle gözlemleme stratejilerini içeren belirli bir biyotahlil yoluyla değerlendirilmesini gerektirir10.
Deniz anemon zehiri sitolitik polipeptitler, gözenek oluşturan toksinler (PFT'ler)11 ve fosfolipazlar12 içerir; Bu moleküller, protein-lipid etkileşimi, kanser terapisindeki moleküler araçlar ve nanopore3'e dayanan biyosensörlerin incelenmesinde modellerdir. Deniz anemonlu PFT'lerin sınıflandırılması, boyutlarına veya moleküler ağırlıklarına göre, 5 kDa'dan 80 kDa'ya kadar gerçekleştirilir. En çok çalışılan ve aktinoporinler11 olarak bilinen 20 kDa PFT, antikanser, antimikrobiyal ve nanopor bazlı biyosensörler gibi olası uygulamalar için moleküler araçların geliştirilmesindeki biyomedikal potansiyeli nedeniyle özellikle ilgi çekicidir. Fosfolipazlar, özellikle fosfolipaz A2 (PLA2)13 dahil olmak üzere başka bir sitolisin, bir yağ asidi nedeniyle serbest bırakır ve fosfolipitleri hidrolize ederek hücre zarını dengesizleştirir. Bu etki mekanizması nedeniyle, PLA2, enflamatuar hastalıklardaki çalışma ve uygulamalar için önemli bir model olmayı vaat etmektedir. Hücre zarındaki lipit davranışı çalışmaları için bir model olarak hizmet edebilir14.
Burada, deniz anemonundan ham ekstrakt elde etmek için etkili bir protokol açıklıyoruz Anthopleura dowii Verrill, 1869 ve hemolizinleri ve fosfolipazları tespit etmek. Her ikisi de yeni moleküler araçlar tasarlamak için bir şablon olarak kullanılabilecek ilgili toksinlerdir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B75808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoetanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9515-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bisacrylamide</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3059-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein Assays</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture plates 96 well, V-bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3894</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc MP system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear flat.bottom 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue G-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1916-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ductless Enclosure</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>Vertical</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc EZ</td>
			<td>Bio Rad.</td>
			<td></td>
			<td>Gel Documentation System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>650030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (Software)</td>
			<td>NIH, USA</td>
			<td>Version 1.53c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator 211</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>I5211 DS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9049-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-PROTEAN tetra cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1658000EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3824-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3624-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4.H2O</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>3818-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin software</td>
			<td></td>
			<td>version 9</td>
			<td>To design the plot with sigmoidal adjustments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman kit</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precast mini gel</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>26620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836153001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 6G</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate dihydrate</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>3646-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>THERMO SCIENTIFIC</td>
			<td>G10S UV-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77-86-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt Power Supply</td>
			<td>Hoefer</td>
			<td>PS300B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of hemolytic and phospholipase activity in crude extracts from sea anemones by straightforward bioassays

Deniz anemon zehiri bileşimi polipeptit ve protein olmayan molekülleri içerir. Sitolitik bileşenler, yeni moleküler araçların tasarlanması için yüksek biyoteknolojik ve biyomedikal potansiyele sahiptir. Deniz anemon zehiri, ektodermden glandüler hücrelerde ve her ikisi de deniz anemon gövdesi boyunca dağılmış olan nematokistler adı verilen alt hücresel yapılarda bulunur. Bu özellik zorluklar anlamına gelir, çünkü zehir bileşenlerini diğer toksik olmayan moleküllerle serbest bırakmak için hücreler ve nematosist lize edilmelidir. Bu nedenle, ilk olarak, zehir ham bir ekstrakttan (farklı ve çeşitli moleküllerin ve doku kalıntılarının karışımı) türetilir. Bir sonraki adım, spesifik biyoaktivitelere sahip polipeptitleri tespit etmektir. Burada, sitolisinlerin varlığını tanımlamak için deniz anemonunun ham ekstraktını ve biyotahlilini elde etmek için etkili bir strateji açıklıyoruz. İlk adım, sitolisinleri serbest bırakmak için ucuz ve basit teknikleri (karıştırılmış ve dondurarak çözülme döngüsü) içerir. En yüksek sitolitik aktiviteyi ve proteini elde ettik (20 g kuru ağırlıktan ~ 500 mg protein). Daha sonra, ekstraktın polipeptit karmaşıklığı, 10 kDa ile 250 kDa arasında moleküler ağırlıklara sahip proteinleri tespit eden SDS-PAGE jeli ile analiz edildi. Hemolitik tahlilde koyun kırmızı kan hücreleri kullandık ve HU50 (11.1 ± 0.3 μg / mL) belirledik. Buna karşılık, ham ekstraktta fosfolipazların varlığı, agarozlu katı bir ortamda substrat olarak yumurta sarısı kullanılarak belirlendi. Genel olarak, bu çalışma ham ekstraktı hazırlamak için verimli ve ucuz bir protokol kullanır ve sitolisinleri, biyoteknolojik ve biyomedikal çıkarları olan molekülleri tanımlamak için tekrarlanabilir biyotahliller uygular.

Deniz anemonunun ham ekstraktını elde etmek için kullanılan protokolün temsili sonuçları, iki tekniğin (ajitasyon ve donma ve çözülme döngüleri) birleştirilmesinin nematosistlerin etkili bir şekilde boşaltılmasını sağladığını ve toplam protein miktarının 500 mg (8 mg / mL) olduğunu göstermiştir (Şekil 3).
Ham ekstraktın protein karmaşıklığı, SDS-PAGE elektroforezi yoluyla 10 kDa'dan ve 250 kDa'dan daha büyük olarak gözlemlene...

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays at JoVE.com

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Burada, deniz anemonundan ham zehir ekstraktı elde etmek ve hemolitik ve fosfolipaz aktivitesini tespit etmek için bir protokol tarif ediyoruz.

Deniz Anemonlardan Elde Edilen Ham Ekstraktlarda Hemolitik ve Fosfolipaz Aktivitesinin Basit Biyotahlillerle Tanımlanması

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Deniz anemon toksini etkileşimi, toksinlerin çeşitliliğini ve bolluğunu elde etmek ve belirli bir toksinin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlamak için en az sayıda organizma ve etkili protokoller kullanmalıdır. Ham ekstraktı yüksek miktarda protein ile hazırlamak ve deniz anemon zehirindeki hemoliz ve fosfolik bazları tanımlamak için tekrarlanabilir, spesifik, hızlı ve ucuz testleri tanımlamak için iki etkili tekniği birleştirdik. Yöntem, bir veya her iki sitolisin tipini tanımlamaya karar verilen hemen hemen her örnekte kullanılabilir.Yöntemin verimliliği, ham ekstraktı hazırlarken her adımda zamanlara dikkat edilerek elde edilir. Hemolizin anahtarı, mekanik lizisten kaçınmak için eritrositin dikkatli bir şekilde kullanılması ve fosfoliz tahlilinde, plakanın hazırlanmasında sıcaklığa dikkat edilmesidir. Prosedürü gösterecek olan Dr. Santos Ramirez-Carreto, biyolog Sandra Salazar Garcia ve laboratuvarımdan biyolog Giovanni Macias Martinez olacak.Vücuda yapışan büyük substrat parçacıklarını çıkarmak için toplanan deniz anemonunu A.doi'yi elle damıtılmış suyla temizleyerek başlayın. Organizmaları hemen eksi 80 santigrat derecede bir ultradondurucuda 72 saat boyunca dondurun. Daha sonra, organizmaları 48 saat boyunca liyofilizasyon koşullarıyla dondurarak kurutmak için özel bardaklara yerleştirin.Doku hidrasyonu için, liyofilize organizmaların 20 gram kuru ağırlığını, 60 mililitre 50 milimolar sodyum fosfat tamponu ve bir inhibitör kokteyl tableti ile yeniden oluşturun. Manyetik bir karıştırıcıda, numuneyi 12 saat boyunca yaklaşık 800 RPM ve dört santigrat derecede sürekli karıştırın. Hücre lizisini ve nematokist deşarjını indüklemek için numuneyi eksi 20 santigrat derecede 12 saat dondurduktan sonra,% 90'a kadar çözülene kadar kabı oda sıcaklığında suya koyunBu prosedürü üç kez tekrarlayın.Ekstraktı açıklığa kavuşturmak için, numuneyi dört santigrat derecede 40 dakika boyunca 25.400 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı kurtarın ve tekrar santrifüj yapın. Adımı üç ila dört kez tekrarlayın ve sonunda süpernatantı kurtarın.Geri kazanılan süpernatant veya ham ekstrakt, zehir bileşenlerini ve lipitler, karbonhidratlar ve nükleik asitler gibi diğer hücre moleküllerini içerir. Ticari bir Bradford kolorimetrik tahlil kiti kullanarak ham ekstraktın protein konsantrasyonunu belirleyin. Numuneleri titremeden oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin.Ardından, absorbansı 595 nanometrede ölçün. Örnek BSA absorbanslarının ortalamalarını çizin ve y'nin absorbans, m'nin çizginin eğimi, x'in protein konsantrasyonu ve b'nin orijinin ordinatı olduğu grafiğin denklemini belirleyin. Ham ekstraktı analiz etmek için, proteinleri denatüre etmek için protein yükleme tamponunun beş mikrolitresine 30 mikrogram ham ekstrakt ekleyin.Son hacim 50 mikrolitreden az olmalıdır. Elektroforezi bir saat 30 dakika boyunca sabit 25 miliamperde çalıştırın. Jel proteinlerinin difüzyonunu önlemek için, fiksasyon çözeltisini proteinlere ekleyin ve 80 RPM'de çalkalayarak 40 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.Daha sonra, çözeltiyi boşaltın ve protein çapraz bağlama çözeltisini ekleyin. 80 RPM'de sallayarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Çözeltiyi çıkarın ve jeli beş dakika boyunca 100 mililitre damıtılmış suyla yıkayın.Bundan sonra, suyu çıkarın ve bu prosedürü dört kez tekrarlayın. Oda sıcaklığında bir laboratuvar döner osilatöründe 15 dakika boyunca 60 RPM'de karıştırılarak 50 mililitre Coomassie Brilliant Blue R-250 filtrelenmiş çözelti ile protein boyama işlemi gerçekleştirin. Bir koyunun juguler damarından bir mililitre kan çıkarın ve iğneyi şırıngadan çıkarın.Kanı derhal 50 mililitre Alsever çözeltisi içeren bir tüpe boşaltın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 804 kez G'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve tüpün iç duvarları boyunca kaydırarak 30 mililitre Alsever çözeltisi ekleyin. Bir Pasteur plastik pipet kullanarak peleti yavaşça yeniden askıya alın ve çözeltiyi dört santigrat derecede beş dakika boyunca 804 kez G'de tekrar santrifüj yapın.Süpernatant netleşene kadar bu prosedürü tekrarlayın. Yaklaşık mililitre başına 2 milyon hücre konsantrasyonu elde etmek için Alsever çözeltisinin son hacmini koruyun. Ardından, hücreleri saymak için bir Neubauer odası veya hemositometre kullanın.Çözelti karışımlarını sallamadan 37 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin ve ardından plakayı dört santigrat derecede beş dakika boyunca 804 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı düz tabanlı başka bir 96 delikli plakada kurtarın. Ham ekstrakt sitolisinler içeriyorsa, eritrositler hemoglobini lize eder ve serbest bırakır.415 nanometredeki absorbansı okuyun ve eritrositlerin% 50'sinde hemoliz üreten ekstrakt miktarını hesaplayın. Deniz anemonunun ham ekstraktı miktarını artırın ve uygun yazılımı kullanarak grafiği sigmoidal ayarlamalarla tasarlayın. Bir tavuk yumurtasını% 1 SDS ile damıtılmış suda yıkayın ve yumurta sarısını steril koşullar altında yumurta akından ayırın.A, B, C ve D çözeltilerini hazırlayın.B çözeltisine 500 mikrolitre A ve C çözeltisi ve 100 mikrolitre çözelti D.Karıştırın ve her Petri kabına 25 mililitre dökün. Çözeltinin steril koşullar altında katılaşmasını bekleyin ve ince bir tüp ile yaklaşık iki ila üç milimetre çapında kuyucuklar açın. Bir kuyucukta negatif kontrol olarak toplam 20 mikrolitre fosfat tamponu ve başka bir kuyuda pozitif kontrol olarak 20 mikrolitre belirlenmiş fosfolipaz ekleyin.Ham ekstrakt proteini 5, 15, 25, 35 ve 45 mikrogramlarının farklı miktarlarını, her biri 20 mikrolitrelik son bir hacimde kalan kuyucuklara yerleştirin. 20 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Deniz anemonunun ham ekstraktını elde etmek için kullanılan protokolün temsili sonuçları, iki tekniğin, ajitasyon ve donma ve çözülme döngülerinin birleştirilmesinin nematosistlerin verimli bir şekilde boşaltılmasını sağladığını göstermiştir.Uyaranlardan önce ve sonra nematositler burada gösterilmiştir. Nematocyst tübül bu görüntüde maruz kalır ve toksin salınımını gösterir. Deniz anemonunun ham ekstraktının elektroforetik profili burada gösterilmiştir.Deniz anemon ham ekstresi SDS-PAGE% 15 poliakrilamid jel ile analiz edildi ve 10 kilodaltondan 250 kilodalton moleküler ağırlığa kadar protein gösterdi. Burada, şerit 1 protein merdiveni ve şerit 2 deniz anemon zehiridir. Sitolisinler 15 kilodalton ve 20 kilodalton moleküler ağırlık bölgesinde tespit edildi.Burada koyunlardan elde edilen eritrositlerde hemoliz testi gösterilmektedir. Donma ve çözülme döngülerinden önce ve sırasında ekstraktın hemolitik aktivitesi, son iki döngüde toplam ham ekstrakt proteininin 50 mikrogramı ile% 100 hemolize ulaşılana kadar artmıştır. % 50 koyun eritrositlerini lize etmek için gereken miktar, mililitre başına 11.1 0.3 mikrogramdır.Fosfolipaz aktivitesi, ham ekstrakt örneğinin uygulandığı agar plakası alanlarında berrak halelerin oluşumu ile tespit edildi. Sonuçlar, 15 mikrogram toplam proteinden fosfolipaz aktivitesinin varlığını göstermektedir. Halenin çapı doza bağımlı bir şekilde artmıştır; yani, ham ekstrakt miktarı artarsa, halenin çapı artmıştır.Prosedürü denerken, nematokist deşarjını indüklediğinizden, toplam proteini nicelleştirdiğinizden, SDS-PAGE elektroforezi ile ham ekstraktı analiz ettiğinizden, hemolizin% 50'sini üretmek için ham ekstrakt proteininin miktarını hesapladığınızdan ve fosfolipaz testinde farklı miktarlarda protein kullandığınızdan emin olun. Biyoteknoloji ve biyotıpta büyük ilgisi olan polipeptitleri tanımlamak, hatta benzersiz bir molekülün profilini çıkarmak ve karakterize etmek ve daha sonra bir uygulama için laboratuvarda üretmek için ham ekstraktı proteomik teknikle analiz edebiliriz. İnsan obdürat akciğer karsinomu epitel hücrelerinde antitümör aktiviteye sahip performans gösteren bir proteinin dizisinin bir kısmını elde ettik.Aynı şekilde, biyoteknolojik açıdan ilgi çekici fosfolipazların sırasını da tanımlıyoruz.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Identifying the molecular target(s) of small molecules is a challenging but necessary step towards understanding their mechanism of action. While several ...

Biyokimya

Defining Substrate Specificities for Lipase and Phospholipase Candidates

Lipaz ve Fosfolipaz Adayları için substrat özellikleri tanımlama

Microorganisms produce a wide spectrum of (phospho)lipases that are secreted in order to make external substrates available for the organism. ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Kütle spektrometresi tabanlı kimlik RNA-bağlama bölgelerinin için numune hazırlama

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Keratin hidrolizat tavuk tüyleri ve kozmetik kendi uygulamasında hazırlanması

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteaz özgüllük fare doku belirlenmesi MALDI-TOF Kütle spektrometresi tarafından ayıklar: PH özgüllük değişiklikler neden manipüle

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Balarısı üzerinden beyin Homogenate Fosfolifaz C aktivite tespiti

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...