Name: studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

Vi er taknemmelige for Winnie Zhao og Yin Chen Wan for at give nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).

Den foreliggende undersøgelse bruger vildtype C. elegans Bristol stamme N2 dyrket ved 21 ° C.
1. Forberedelse af medier
<ol><li>Forbered M9-medier i henhold til tidligere rapport21,22.</li>
	<li>Forbered nematode vækstmedium (NGM) i henhold til tidligere rapport21,22. Hæld 12 ml NGM pr. 6 cm plade eller 30 ml pr. 10 cm plade.</li>
	<li>Forbered <...

<ol>
	<li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates:+current+knowledge+and+future+prospects.">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).</li><li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome.">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li><li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics:+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model.">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li><li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+worm:+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity.">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li><li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+your+enemies:+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans.">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection.">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741 (2020).</li><li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+microsporidia:+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites.">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).</li><li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+host+cells+by+microsporidia.">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).</li><li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion,+proliferation+and+exit.">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).</li><li>Balla, K. M., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection.">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).</li><li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+discreet+escape:+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li><li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia.">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li><li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins.">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023 (2017).</li><li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans.">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).</li><li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans.">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring.">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans.">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458 (2022).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic,+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).</li><li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host.">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Rivera, D. E., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines.">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes.">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).</li><li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans.">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).</li><li>Troemel, E. R., F&#233;lix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barri&#232;re, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309 (2008).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved,+stress-specific,+and+have+deleterious+trade-offs.">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425 (2021).</li><li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery.">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).</li><li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube.">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li></ol>

Den nuværende protokol beskriver undersøgelsen af mikrosporidier og arvelig immunitet i en simpel og genetisk trækbar N. parisii -C. elegans infektionsmodel .
Sporeforberedelse er en intensiv protokol, der typisk giver nok sporer til 6 måneders eksperimenter, afhængigt af produktivitet24. Det er vigtigt, at smitsomheden skal bestemmes for hver ny spore "lot", før den bruges til eksperimenterne. På grund af variabiliteten i infektivitet mellem sp...

Arvelig immunitet er et epigenetisk fænomen, hvor forældrenes eksponering for patogener kan muliggøre produktion af infektionsresistente afkom. Denne type immunhukommelse er blevet vist hos mange hvirvelløse dyr, der mangler adaptive immunsystemer og kan beskytte mod virale, bakterielle og svampesygdomme1. Mens arvelig immunitet har vigtige konsekvenser for forståelsen af både sundhed og evolution, er de molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne beskyttelse, stort set ukendte. Det skyldes blandt andet, at mange af de dyr, hvor arvelig immunitet er beskrevet, ikke er etablerede modelorganismer til forskning. I modsætning hertil drager undersøgelser af den gennemsigtige nematode Caenorhabditis elegans fordel af et omfattende genetisk og biokemisk værktøjssæt 2,3, et stærkt kommenteret genom 4,5 og en kort generationstid. Faktisk har forskning i C. elegans muliggjort grundlæggende fremskridt inden for epigenetik og medfødt immunitet 6,7, og det er nu en etableret model til undersøgelse af immunhukommelse 8,9.
Microsporidia er svampepatogener, der inficerer næsten alle dyr og forårsager dødelige infektioner hos immunkompromitterede mennesker10. Infektion begynder, når en microsporidia spore injicerer eller "fyrer" sit cellulære indhold (sporoplasma) i en værtscelle ved hjælp af en struktur kaldet et polært rør. Intracellulær replikation af parasitten resulterer i dannelsen af meronter, som i sidste ende differentierer sig til modne sporer, der kan forlade cellen11,12. Selvom disse parasitter er skadelige for både menneskers sundhed og fødevaresikkerheden, er der stadig meget at lære om deres infektionsbiologi12. Nematocida parisii er en naturlig mikrosporidisk parasit, der udelukkende replikerer i ormens tarmceller, hvilket resulterer i reduceret fecundity og i sidste ende død. N. parisii-C. elegans-infektionsmodellen er blevet brugt til at vise: (1) autofagiets rolle i patogenclearance13, (2) hvordan mikrosporidier kan forlade inficerede celler ikke-lytisk14, (3) hvordan patogener kan sprede sig fra celle til celle ved at danne syncytia15, (4) proteinerne N. parisii bruger til at kommunikere med sin vært16 og (5) reguleringen af transkriptionelt intracellulært patogenrespons (IPR)17, 18.
Protokoller for infektion af C. elegans er beskrevet i det aktuelle arbejde og kan bruges til at afsløre den unikke microsporidia biologi og dissekere værtens reaktion på infektion. Mikroskopien af faste orme farvet med det chitinbindende farvestof Direct Yellow 96 (DY96) viser infektionsspredningen af chitinholdige mikrosporidisporer i hele tarmen. DY96-farvning muliggør også visualisering af chitinholdige ormbryoner til samtidig vurdering af orm graviditet (evne til at producere embryoner) som en aflæsning af værtsfitness.
Nylige resultater har afsløret, at C. elegans inficeret med N. parisii producerer afkom, der er robust resistente over for den samme infektion19. Denne arvelige immunitet varer en enkelt generation og er dosisafhængig, da afkom fra mere stærkt inficerede forældre er mere resistente over for mikrosporidier. Interessant nok er N. parisii-primede afkom også mere resistente over for det bakterielle tarmpatogen Pseudomonas aeruginosa, selvom de ikke er beskyttet mod det naturlige patogen Orsay-virus19. Det foreliggende arbejde viser også, at immunprimede afkom begrænser værtscelleinvasion af mikrosporidier. Metoden beskriver også indsamlingen af immunprimede afkom, og hvordan FISH kan bruges til at detektere N. parisii RNA i tarmceller til at analysere værtscelleinvasion og sporeaffyring20.
Sammen giver disse protokoller et solidt fundament for at studere mikrosporidier og arvelig immunitet i C. elegans. Det er håbet, at fremtidigt arbejde i dette modelsystem vil muliggøre vigtige opdagelser inden for det spirende felt af arvelig immunitet. Disse teknikker vil sandsynligvis også være udgangspunkter for undersøgelse af mikrosporidiinduceret arvelig immunitet hos andre værtsorganismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mm zirconia beads</td>
			<td>Biospec Products Inc.</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9FB893150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DRM600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Yellow 96</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S472409-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical rotor</td>
			<td>Thermo Sceintific</td>
			<td>415110 / 1834090806873</td>
			<td>Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB FISH probe</td>
			<td>Biosearch Technologies Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5&#39; modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Wild-type, Bristol strain</td>
			<td>Default strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (5 N)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>FLSS256500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution (6%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield + A16</td>
			<td>Biolynx</td>
			<td>VECTH1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection

Arvelig immunitet beskriver, hvordan nogle dyr kan videregive "hukommelsen" af en tidligere infektion til deres afkom. Dette kan øge patogenresistensen i deres afkom og fremme overlevelse. Mens arvelig immunitet er blevet rapporteret hos mange hvirvelløse dyr, er mekanismerne bag dette epigenetiske fænomen stort set ukendte. Infektionen af Caenorhabditis elegans med det naturlige mikrosporidiske patogen Nematocida parisii resulterer i, at ormene producerer afkom, der er robust resistente over for mikrosporidier. Den foreliggende protokol beskriver undersøgelsen af intergenerationel immunitet i den enkle og genetisk trækbare N. parisii -C. elegans infektionsmodel . Den nuværende artikel beskriver metoder til at inficere C. elegans og generere immun-primed afkom. Der gives også metoder til analyse af resistens over for mikrosporidier ved farvning for mikrosporidier og visualisering af infektion ved mikroskopi. Især forhindrer arvelig immunitet værtscelleinvasion af mikrosporidier, og fluorescens in situ-hybridisering (FISH) kan bruges til at kvantificere invasionshændelser. Den relative mængde mikrosporidiasporer, der produceres i det immunprimede afkom, kan kvantificeres ved at farve sporerne med et chitinbindende farvestof. Hidtil har disse metoder kastet lys over kinetikken og patogens specificiteten af arvelig immunitet såvel som de molekylære mekanismer, der ligger til grund for den. Disse teknikker, sammen med de omfattende værktøjer, der er tilgængelige for C. elegans forskning, vil muliggøre vigtige opdagelser inden for arvelig immunitet.

I den foreliggende undersøgelse blev forældrepopulationer af C. elegans (P0) inficeret på L1-stadiet med en lav dosis N. parisii-sporer . Disse infektionsbetingelser bruges typisk til at opnå et stort antal mikrosporidieresistente F1-afkom gennem blegning af forældrene. Inficerede forældrepopulationer og uinficerede kontroller blev fastsat til 72 hpi og farvet med DY96 for at visualisere ormbryoner og microsporidia-sporer (figur 1A). Inficerede dyr er små, indeholder...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Infektionen af Caenorhabditis elegans af den mikrosporidiske parasit Nematocida parisii gør det muligt for ormene at producere afkom, der er stærkt resistente over for det samme patogen. Dette er et eksempel på arvelig immunitet, et dårligt forstået epigenetisk fænomen. Den foreliggende protokol beskriver undersøgelsen af arvelig immunitet i en genetisk trækbar ormmodel.

Undersøgelse af arvelig immunitet i en Caenorhabditis elegans model af microsporidia infektion

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Disse protokoller gør det muligt at undersøge arvelig immunitet over for mikrosporidier. Teknikker, der forklares her, kan hjælpe os med at forstå, hvordan immunitet overføres på tværs af generationer og molekylerne, der bestemmer immunitet mod mikrosporidier hos afkom. C.elegans er en simpel og genetisk trækbar model med en kort generationstid til at analysere arv.De mange værktøjer, der er til rådighed for ormen, kan bruges til at afdække molekylære mekanismer for intergenerationel immunitet. Når du inficerer P0-dyr, skal du bruge en lav sporedosis, der ikke påvirker forældrenes evne til at producere afkom væsentligt. Dette sikrer, at blegning giver nok F1-dyr til nedstrømsforsøg Til at begynde med skal du flytte det krævede antal 10 centimeter ikke-såede nematodevækstmediumplader fra fire grader Celsius til stuetemperatur en dag før planlagte infektioner.Lige før infektionen pellet ned ca. 2.500 synkroniserede L1 orme i et microfuge rør ved 1.400 gange G i 30 sekunder. Fjern supernatanten med en pipettespids for at efterlade orme i 50 mikroliter M9-medier. Tilsæt en milliliter 10X Escherichia coli stamme OP50 til 1-trins ormene, og N.parisii sporer til den ønskede koncentration.Som en uinficerede kontrol fremstilles et ækvivalent rør af L1'er og OP50 med et volumen M9-medier svarende til det anvendte volumen sporepræparat. Bland L1-ormprøven ved at hvirvle kort og plade over en milliliter orme på en 10 centimeter useedet nematode vækst medium plade. Hvirvl for at sikre, at væsken spredes over hele pladen.Tør pladerne i et rent skab med lågene slukket i 10 til 20 minutter eller indtil de er helt tørre, inden de inkuberes ved 21 grader Celsius i 72 timer. Efter 72 timer efter infektion undersøges plader under dissekeringsmikroskopet. Pladen med inficerede orme skal indeholde færre embryoner end pladerne med uinficerede orme.Vask derefter ormene af pladerne i et mikrocentrifugerør ved hjælp af et milliliter M9-medie. Hvis der forbliver mange orme på pladerne, pellets ormene ved centrifugering ved 1400 gange G i 30 sekunder. Fjern supernatanten og udfør yderligere pladevask.Centrifugering ved 1400 gange G i 30 sekunder ved stuetemperatur for at pelletere ormene og vaske to gange med en milliliter M9-medier, eller indtil supernatanten er klar. Ophæng det igen i et endeligt volumen på et milliliter M9-medie og bland godt ved pipettering. Overfør 100 mikroliter af de suspenderede orme til et nyt rør og bleg de resterende 900 mikroliter for at bryde de voksne orme op og frigive F1-embryoner til testning.Udfør infektioner med ændringer. som nævnt i manuskriptet. Ved 72 timer efter infektion skal du undersøge plader under et dissekerende mikroskop.Pladen med naive orme skal være mindre og indeholde mindre embryoner end pladerne med grundede orme. Start derefter farvnings- og fastgørelsesprocessen af orme ved at vaske dem af pladerne i et mikrocentrifugerør ved hjælp af en milliliter på 0,1% Tween 20 i M9-medier. Hvis mange orme forbliver på pladerne, pellet ormene ved centrifugering ved 1.400 gange G i 30 sekunder ved stuetemperatur, fjern supernatanten ved hjælp af en pipettespids og udfør yderligere pladevask.Efter pelletering af ormene ved centrifugering i 30 sekunder ved 1.400 gange G ved stuetemperatur vaskes to gange med en milliliter M9-medier indeholdende 0,1% Tween 20, eller indtil supernatanten er klar. Fjern supernatanten, tilsæt 700 mikroliter acetone, og lad ormene fiksere ved stuetemperatur i 10 minutter. Pellet ud disse faste orme i 30 sekunder ved 10.000 gange G ved stuetemperatur og give to vaske af en milliliter fosfat buffer saltvand indeholdende 0,1% Tween 20.Forbered 50 ml DY96-arbejdsløsning, pakk beholderen ind i folie, og opbevar den i en skuffe for at forhindre udsættelse for lys. Tilsæt 500 mikroliter DY96-arbejdsløsning til ormpillen og drej i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke. Centrifugering af denne reaktion i 30 sekunder ved 10.000 gange G ved stuetemperatur for at pelletere ormene og fjerne supernatanten.Derefter tilsættes 15 mikroliter af monteringsmediet med eller uden DAPI. Pipette 10 mikroliter af disse farvede orme på et mikroskop dias og læg et dæksel glide over toppen. For at analysere de DY96-farvede orme, der er monteret på dias, skal du udføre billeddannelse ved hjælp af GFP-kanalen i et fluorescensmikroskop.For at bestemme ormpopulationernes egnethed skal du bruge et 5X eller 10X mål til at analysere graviditeten af mere end 100 orme pr. Tilstand. 72 timer efter infektion blev F1-dyrene fikseret og farvet med DY96 for at vurdere mikrosporidieresistens. Inficerede forældrepopulationer og uinficerede kontroller blev fastsat til 72 timer efter infektion og farvet med DY96 for at visualisere ormbryoner og mikrosporidisporsporer.Inficerede dyr er små, indeholder mange mikrosporidiasporer og producerer færre embryoner end sunde, uinficerede kontroller. Vurdering af orm graviditet viste, at ca. 95% af de uinficerede dyr producerede afkom sammenlignet med de inficerede dyr, som var mindre end 80% Kvantificeringer afslørede, at ca. 90% af den mikrosporidia-behandlede befolkning var inficeret, som bestemt af antallet af orme indeholdende DY96-farvede sporer. Kvantificeringer af disse faste dyr afslørede, at de grundede orme indeholdt betydeligt flere embryoner end deres naive modstykker, hvilket indikerer større egnethed i lyset af infektion.Fiji ImageJ blev brugt til at bestemme parasitbyrden for individuelle naive og immunprimede orme, hvilket er procentdelen af kroppen fyldt med fluorescerende N.parisii-sporer. Kvantificeringer afslørede en dramatisk reduktion i parasitbyrden af orme, der kom fra inficerede forældre. Endvidere afslørede beregningerne af individuel ormstørrelse, at primede orme havde en betydelig vækstfordel i forhold til naive dyr i lyset af N.parisii-infektion.Billeddannelsesundersøgelser afslørede, at mens naive dyr typisk indeholdt flere sporer og flere inficerede celler, havde de primede dyr langt færre eller ingen sporer og typisk ingen sporoplasmer. Hvis uprimede og grundede F1-populationer har et lignende antal gravide og inficerede dyr, skal du tælle antallet af æg pr. Dyr og analysere inficeret væv med ImageJ for at finde mere subtile forskelle. Mens direkte gule 96 pletter modne sporer, kan fluorescens in situ hybridisering afsløre sporoplasmer i celler.Dette kan vise dig antallet af inficerede celler i grundede og uprimede orme. Disse teknikker har vist, at forældrenes transkriptionelle respons kan være medvirkende til at fremkalde arvelig immunitet hos afkom. Forskere undersøger nu arten af denne immunitet hos afkom.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Valg af Plasmodium falciparum Parasitter for Cytoadhesion Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vedhæftning Assay til at studere Leucocyte Rekruttering til human hepatiske Sinusformede endotel Under betingelser for forskydningsspænding

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

High Yield Oprensning af<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoites Til brug i opsoniserende antistofanalyser

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

En protokol til at inficere<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Med<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering og analyse for at fastslå deres rolle i lymfom Cell Følsomhed til terapeutiske midler

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminescens Imaging Detect Late Stage Infektion af afrikansk trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Anvendelse fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) til at undersøge Effector translokationseffektivitet af<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Musemodeller af Helicobacter infektion og gastrisk patologier

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluering af virulens og patogenese af Aeromonas infektion i en Caenorhabditis elegans Model

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...