Name: studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

We zijn Winnie Zhao en Yin Chen Wan dankbaar voor het geven van nuttig commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).

De huidige studie maakt gebruik van wild-type C. elegans Bristol stam N2 gekweekt bij 21 °C.
1. Voorbereiding van media
<ol><li>Bereid M9-media voor volgens het vorige rapport21,22.</li>
	<li>Bereid nematodengroeimedium (NGM) voor volgens vorig rapport21,22. Giet 12 ml NGM per plaat van 6 cm of 30 ml per plaat van 10 cm.</li>
	<li>Bereid Escheri...

<ol>
	<li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates:+current+knowledge+and+future+prospects.">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).</li><li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome.">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li><li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics:+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model.">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li><li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+worm:+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity.">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li><li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+your+enemies:+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans.">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection.">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741 (2020).</li><li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+microsporidia:+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites.">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).</li><li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+host+cells+by+microsporidia.">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).</li><li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion,+proliferation+and+exit.">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).</li><li>Balla, K. M., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection.">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).</li><li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+discreet+escape:+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li><li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia.">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li><li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins.">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023 (2017).</li><li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans.">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).</li><li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans.">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring.">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans.">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458 (2022).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic,+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).</li><li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host.">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Rivera, D. E., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines.">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes.">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).</li><li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans.">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).</li><li>Troemel, E. R., F&#233;lix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barri&#232;re, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309 (2008).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved,+stress-specific,+and+have+deleterious+trade-offs.">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425 (2021).</li><li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery.">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).</li><li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube.">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li></ol>

Het huidige protocol beschrijft de studie van microsporidia en erfelijke immuniteit in een eenvoudig en genetisch handelbaar N. parisii -C. elegans infectiemodel.
Sporenpreparaat is een intensief protocol dat doorgaans voldoende sporen oplevert voor 6 maanden experimenten, afhankelijk van de productiviteit24. Belangrijk is dat de infectiviteit moet worden bepaald voor elke nieuwe sporen "partij" voordat het voor de experimenten wordt gebruikt. Vanwege ...

Erfelijke immuniteit is een epigenetisch fenomeen waarbij ouderlijke blootstelling aan pathogenen de productie van infectieresistente nakomelingen mogelijk kan maken. Dit type immuungeheugen is aangetoond bij veel ongewervelde dieren die geen adaptief immuunsysteem hebben en kunnen beschermen tegen virale, bacteriële en schimmelziekten1. Hoewel erfelijke immuniteit belangrijke implicaties heeft voor het begrijpen van zowel gezondheid als evolutie, zijn de moleculaire mechanismen die aan deze bescherming ten grondslag liggen grotendeels onbekend. Dit komt deels omdat veel van de dieren waarbij erfelijke immuniteit is beschreven, geen gevestigde modelorganismen zijn voor onderzoek. Daarentegen profiteren studies in de transparante nematode Caenorhabditis elegans van een uitgebreide genetische en biochemische toolkit 2,3, een sterk geannoteerd genoom 4,5 en een korte generatietijd. Inderdaad, onderzoek in C. elegans heeft fundamentele vooruitgang mogelijk gemaakt op het gebied van epigenetica en aangeboren immuniteit 6,7, en het is nu een gevestigd model voor het bestuderen van immuungeheugen 8,9.
Microsporidia zijn schimmelpathogenen die bijna alle dieren infecteren en dodelijke infecties veroorzaken bij immuungecompromitteerde mensen10. Infectie begint wanneer een microsporidia-spore zijn cellulaire inhoud (sporoplasma) injecteert of "afvuurt" in een gastheercel met behulp van een structuur die een polaire buis wordt genoemd. Intracellulaire replicatie van de parasiet resulteert in de vorming van meronten, die uiteindelijk differentiëren in volwassen sporen die de cel kunnen verlaten11,12. Hoewel deze parasieten schadelijk zijn voor zowel de menselijke gezondheid als de voedselzekerheid, is er nog veel te leren over hun infectiebiologie12. Nematocida parisii is een natuurlijke microsporidische parasiet die zich uitsluitend in de darmcellen van wormen vermenigvuldigt, wat resulteert in verminderde vruchtbaarheid en uiteindelijk de dood. Het N. parisii -C. elegans infectiemodel is gebruikt om aan te tonen: (1) de rol van autofagie bij de klaring van pathogenen13, (2) hoe microsporidia geïnfecteerde cellen niet-lytisch kunnen verlaten14, (3) hoe pathogenen zich van cel tot cel kunnen verspreiden door syncytia15 te vormen, (4) de eiwitten die N. parisii gebruikt om te communiceren met zijn gastheer16, en (5) de regulatie van de transcriptionele intracellulaire pathogene respons (IPR)17, 18.
Protocollen voor de infectie van C. elegans worden beschreven in het huidige werk en kunnen worden gebruikt om de unieke microsporidia-biologie te onthullen en de reactie van de gastheer op infectie te ontleden. De microscopie van vaste wormen gekleurd met de chitinebindende kleurstof Direct Yellow 96 (DY96) toont de infectieverspreiding van chitinebevattende microsporidia-sporen door de darm. DY96-kleuring maakt ook de visualisatie van chitinebevattende wormembryo's mogelijk voor de gelijktijdige beoordeling van worm graviditeit (vermogen om embryo's te produceren) als een uitlezing van de geschiktheid van de gastheer.
Recent werk heeft aangetoond dat C. elegans geïnfecteerd met N. parisii nakomelingen produceren die robuust resistent zijn tegen dezelfde infectie19. Deze erfelijke immuniteit duurt een enkele generatie en is dosisafhankelijk, omdat nakomelingen van zwaarder geïnfecteerde ouders resistenter zijn tegen microsporidia. Interessant is dat N. parisii-geprimeerde nakomelingen ook resistenter zijn tegen de bacteriële darmpathogeen Pseudomonas aeruginosa, hoewel ze niet beschermd zijn tegen de natuurlijke ziekteverwekker Orsay-virus19. Het huidige werk toont ook aan dat immuungeprimeerde nakomelingen de invasie van gastheercellen door microsporidia beperken. De methode beschrijft ook de verzameling immuungeprimeerde nakomelingen en hoe FISH kan worden gebruikt om N. parisii-RNA in darmcellen te detecteren om gastheercelinvasie en sporenvurente testen 20.
Samen bieden deze protocollen een solide basis voor het bestuderen van microsporidia en erfelijke immuniteit in C. elegans. Het is te hopen dat toekomstig werk in dit modelsysteem belangrijke ontdekkingen op het ontluikende gebied van erfelijke immuniteit mogelijk zal maken. Deze technieken zijn waarschijnlijk ook startpunten voor het onderzoeken van microsporidia-geïnduceerde erfelijke immuniteit in andere gastheerorganismen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mm zirconia beads</td>
			<td>Biospec Products Inc.</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9FB893150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DRM600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Yellow 96</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S472409-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical rotor</td>
			<td>Thermo Sceintific</td>
			<td>415110 / 1834090806873</td>
			<td>Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB FISH probe</td>
			<td>Biosearch Technologies Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5&#39; modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Wild-type, Bristol strain</td>
			<td>Default strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (5 N)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>FLSS256500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution (6%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield + A16</td>
			<td>Biolynx</td>
			<td>VECTH1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection

Erfelijke immuniteit beschrijft hoe sommige dieren de "herinnering" aan een eerdere infectie kunnen doorgeven aan hun nakomelingen. Dit kan de resistentie tegen ziekteverwekkers in hun nageslacht verhogen en de overleving bevorderen. Hoewel erfelijke immuniteit is gemeld bij veel ongewervelde dieren, zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan dit epigenetische fenomeen grotendeels onbekend. De infectie van Caenorhabditis elegans door de natuurlijke microsporidische ziekteverwekker Nematocida parisii resulteert in de wormen die nakomelingen produceren die robuust resistent zijn tegen microsporidia. Het huidige protocol beschrijft de studie van intergenerationele immuniteit in het eenvoudige en genetisch verhandelbare N. parisii -C. elegans infectiemodel. Het huidige artikel beschrijft methoden voor het infecteren van C. elegans en het genereren van immuungeprimeerde nakomelingen. Er worden ook methoden gegeven voor het testen van de weerstand tegen microsporidia-infectie door kleuring voor microsporidia en het visualiseren van infectie door microscopie. In het bijzonder voorkomt erfelijke immuniteit gastheercelinvasie door microsporidia en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) kan worden gebruikt om invasiegebeurtenissen te kwantificeren. De relatieve hoeveelheid microsporidia-sporen die in de immuungeprimeerde nakomelingen worden geproduceerd, kan worden gekwantificeerd door de sporen te kleuren met een chitinebindende kleurstof. Tot op heden hebben deze methoden licht geworpen op de kinetische en pathogene specificiteit van erfelijke immuniteit, evenals de moleculaire mechanismen die eraan ten grondslag liggen. Deze technieken, samen met de uitgebreide hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor C. elegans-onderzoek , zullen belangrijke ontdekkingen op het gebied van erfelijke immuniteit mogelijk maken.

In de huidige studie werden ouderpopulaties van C. elegans (P0) in het L1-stadium geïnfecteerd met een lage dosis N. parisii-sporen . Deze infectieomstandigheden worden meestal gebruikt om hoge aantallen microsporidia-resistente F1-nakomelingen te verkrijgen door het bleken van de ouders. Geïnfecteerde ouderlijke populaties en niet-geïnfecteerde controles werden vastgesteld op 72 hpi en gekleurd met DY96 om de wormembryo's en microsporidia-sporen te visualiseren (figuur 1A</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.

Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Deze protocollen maken de studie van erfelijke immuniteit tegen microsporidia mogelijk. Technieken die hier worden uitgelegd, kunnen ons helpen begrijpen hoe immuniteit wordt overgedragen tussen generaties en de moleculen die de immuniteit voor microsporidia bij nakomelingen bepalen. C.elegans is een eenvoudig en genetisch handelbaar model met een korte generatietijd voor het testen van overerving.De vele beschikbare hulpmiddelen voor de worm kunnen worden gebruikt om moleculaire mechanismen van intergenerationele immuniteit te ontdekken. Gebruik bij het infecteren van P0-dieren een lage sporendosis die geen significante invloed heeft op het vermogen van de ouder om nageslacht te produceren. Dit zorgt ervoor dat bleken voldoende F1-dieren oplevert voor stroomafwaartse experimenten Om te beginnen, verplaats het vereiste aantal 10-centimeter ongeplaatste nematodengroeimediumplaten van vier graden Celsius naar kamertemperatuur een dag voor geplande infecties.Vlak voor de infectie, pellet naar beneden ongeveer 2, 500 gesynchroniseerde L1 wormen in een microfuge buis op 1, 400 keer G gedurende 30 seconden. Verwijder het supernatant met een pipetpunt om wormen in 50 microliter M9-media achter te laten. Voeg één milliliter 10X Escherichia coli stam OP50 toe aan de 1-stadium wormen en N.parisii sporen aan de gewenste concentratie.Bereid als niet-geïnfecteerde controle een gelijkwaardige buis van L1s en OP50 met een volume van M9-media dat overeenkomt met het volume van het gebruikte sporenpreparaat. Meng het L1-wormmonster door kort te vortexen en plaats boven één milliliter wormen op een 10-centimeter ongewassen nematodengroeimediumplaat. Draai om ervoor te zorgen dat de vloeistof zich over de hele plaat verspreidt.Droog de platen in een schone kast met de deksels eraf gedurende 10 tot 20 minuten of tot ze volledig droog zijn voordat ze 72 uur bij 21 graden Celsius worden geïncubeerd. Onderzoek 72 uur na infectie platen onder de ontleedmicroscoop. De plaat met geïnfecteerde wormen moet minder embryo's bevatten dan de platen met niet-geïnfecteerde wormen.Spoel vervolgens de wormen van de platen in een microcentrifugebuis met behulp van één milliliter M9-medium. Als er veel wormen op de platen achterblijven, pellet de wormen dan door centrifugeren op 1400 keer G gedurende 30 seconden. Verwijder het supernatant en voer extra plaatwassingen uit.Centrifugeer gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur op 1400 maal G om de wormen te pelleteren en was tweemaal met één milliliter M9-media of totdat het supernatant helder is. Hang het opnieuw op in een laatste volume van een milliliter M9-media en meng goed door te pipetteren. Breng 100 microliter van de gesuspendeerde wormen over in een verse buis en bleek de resterende 900 microliter om de volwassen wormen open te breken en F1-embryo's vrij te geven voor testen.Voer infecties uit met wijzigingen. zoals vermeld in het manuscript. Onderzoek 72 uur na infectie platen onder een ontleedmicroscoop.De plaat met naïeve wormen moet kleiner zijn en minder embryo's bevatten dan de platen met geprimeerde wormen. Start vervolgens het kleurings- en bevestigingsproces van wormen door ze van de platen in een microcentrifugebuis te spoelen met één milliliter van 0,1% Tween 20 in M9-media. Als er veel wormen op de platen achterblijven, pelleteert u de wormen door centrifugering op 1,400 maal G gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur, verwijdert u het supernatant met een pipetpunt en voert u extra plaatwassingen uit.Na het pelleteren van de wormen door centrifugeren gedurende 30 seconden bij 1, 400 maal G bij kamertemperatuur, tweemaal wassen met één milliliter M9-media met 0,1%Tween 20 of totdat het supernatant helder is. Verwijder het supernatant, voeg 700 microliter aceton toe en laat de wormen gedurende 10 minuten op kamertemperatuur fixeren. Pellet deze vaste wormen gedurende 30 seconden bij 10.000 maal G bij kamertemperatuur en geef twee wasbeurten van één milliliter fosfaatbufferzoutoplossing met 0,1%Tween 20.Bereid 50 milliliter DY96-werkoplossing voor, wikkel de container in folie en bewaar deze in een lade om blootstelling aan licht te voorkomen. Voeg 500 microliter DY96-werkoplossing toe aan de wormkorrel en draai gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Centrifugeer deze reactie gedurende 30 seconden bij 10.000 keer G bij kamertemperatuur om de wormen te pelleteren en het supernatant te verwijderen.Voeg vervolgens 15 microliter van het montagemedium met of zonder DAPI toe. Pipetteer 10 microliter van deze gekleurde wormen op een microscoopglaasje en plaats een afdekslip over de bovenkant. Om de DY96-gekleurde wormen op dia's te analyseren, voert u beeldvorming uit met behulp van het GFP-kanaal van een fluorescentiemicroscoop.Om de fitheid van de wormpopulaties te bepalen, gebruikt u een 5X- of 10X-doelstelling om de graviditeit van meer dan 100 wormen per aandoening te testen. 72 uur na infectie werden de F1-dieren gefixeerd en gekleurd met DY96 om de resistentie tegen microsporidia te beoordelen. Geïnfecteerde ouderlijke populaties en niet-geïnfecteerde controles werden 72 uur na infectie vastgesteld en gekleurd met DY96 om de wormembryo's en microsporidia-sporen te visualiseren.Geïnfecteerde dieren zijn klein, bevatten veel microsporidia-sporen en produceren minder embryo's dan gezonde, niet-geïnfecteerde controles. Beoordeling van de graviditeit van wormen toonde aan dat ongeveer 95% van de niet-geïnfecteerde dieren nakomelingen produceerde, vergeleken met de geïnfecteerde dieren, die minder dan 80% waren Kwantificeringen onthulden dat ongeveer 90% van de met microsporidia behandelde populatie besmet was, zoals bepaald door het aantal wormen dat DY96-gekleurde sporen bevatte. Kwantificeringen van deze vaste dieren onthulden dat de geprimeerde wormen aanzienlijk meer embryo's bevatten dan hun naïeve tegenhangers, wat wijst op een grotere fitheid in het licht van infectie.Fiji ImageJ werd gebruikt om de parasietlast van individuele naïeve en immuungeprimeerde wormen te bepalen, wat het percentage van het lichaam is dat gevuld is met fluorescerende N.parisii-sporen. Kwantificeringen onthulden een dramatische vermindering van de parasietlast van wormen die afkomstig waren van geïnfecteerde ouders. Verder onthulden de berekeningen van de individuele wormgrootte dat geprimeerde wormen een aanzienlijk groeivoordeel hadden ten opzichte van naïeve dieren in het licht van N.parisii-infectie.Beeldvormende studies toonden aan dat terwijl naïeve dieren meestal meerdere sporen en verschillende geïnfecteerde cellen bevatten, de geprimeerde dieren veel minder of geen sporen hadden en meestal geen sporoplasmata. Als niet-geprimeerde en geprimeerde F1-populaties vergelijkbare aantallen gravid en geïnfecteerde dieren hebben, tel dan het aantal eieren per dier en analyseer geïnfecteerd weefsel met ImageJ om subtielere verschillen te vinden. Terwijl directe gele 96 vlekken rijpen, kan fluorescentie in situ hybridisatie sporoplasmata in cellen onthullen.Dit kan u het aantal geïnfecteerde cellen in geprimeerde en niet-geprimeerde wormen laten zien. Deze technieken hebben aangetoond dat de ouderlijke transcriptionele respons instrumenteel kan zijn bij het induceren van erfelijke immuniteit bij nakomelingen. Onderzoekers onderzoeken nu de aard van deze immuniteit bij nakomelingen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Infectie: Een model van type 2 immuniteit en ontsteking in de darm

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selectie van Plasmodium falciparum Parasieten voor Cytoadhesion Human Brain endotheelcellen

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Een Flow adhesieanalyse om te studeren leukocyten rekrutering van humane lever Sinusvormige endotheel onder omstandigheden van Afschuifspanning

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Een protocol te infecteren<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Met<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofielen Isolatie en analyse van hun rol in de Lymphoma Cell Gevoeligheid voor therapeutische middelen te bepalen

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Aanbrengen Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) naar Effector Translocatie Efficiency Onderzoek door<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Tijdens siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Muismodellen van Helicobacter infectie en maag pathologieën

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluatie van de virulentie en pathogenese van Aeromonas infectie in een Model Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

De wasmot Waxworm infectie Model voor verspreid Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...