Name: studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00
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Nous sommes reconnaissants à Winnie Zhao et Yin Chen Wan d’avoir fourni des commentaires utiles sur le manuscrit. Ces travaux ont été appuyés par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention no 522691522691).

La présente étude utilise la souche N2 bristol de type sauvage C. elegans cultivée à 21 °C.
1. Préparation des supports
<ol><li>Préparer les médias M9 conformément au rapport précédent21,22.</li>
	<li>Préparer le milieu de croissance des nématodes (NGM) conformément au rapport précédent21,22. Versez 12 mL de NGM par plaque de 6 cm ou ...

<ol>
	<li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates:+current+knowledge+and+future+prospects.">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).</li><li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome.">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li><li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics:+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model.">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li><li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+worm:+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity.">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li><li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+your+enemies:+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans.">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection.">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741 (2020).</li><li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+microsporidia:+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites.">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).</li><li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+host+cells+by+microsporidia.">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).</li><li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion,+proliferation+and+exit.">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).</li><li>Balla, K. M., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection.">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).</li><li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+discreet+escape:+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li><li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia.">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li><li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins.">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023 (2017).</li><li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans.">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).</li><li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans.">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring.">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans.">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458 (2022).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic,+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).</li><li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host.">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Rivera, D. E., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines.">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes.">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).</li><li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans.">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).</li><li>Troemel, E. R., F&#233;lix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barri&#232;re, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309 (2008).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved,+stress-specific,+and+have+deleterious+trade-offs.">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425 (2021).</li><li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery.">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).</li><li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube.">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li></ol>

Le présent protocole décrit l’étude des microsporidies et de l’immunité héréditaire dans un modèle d’infection à N. parisii-C. elegans simple et génétiquement traitable.
La préparation des spores est un protocole intensif qui produit généralement suffisamment de spores pour 6 mois d’expériences, en fonction de la productivité24. Il est important de noter que l’infectiosité doit être déterminée pour chaque nouveau « lot ?...

L’immunité héréditaire est un phénomène épigénétique par lequel l’exposition parentale à des agents pathogènes peut permettre la production d’une progéniture résistante aux infections. Ce type de mémoire immunitaire a été démontré chez de nombreux invertébrés qui manquent de système immunitaire adaptatif et peuvent protéger contre les maladies virales, bactériennes etfongiques 1. Bien que l’immunité héréditaire ait des implications importantes pour la compréhension de la santé et de l’évolution, les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette protection sont largement inconnus. Cela s’explique en partie par le fait que bon nombre des animaux chez lesquels l’immunité héréditaire a été décrite ne sont pas des organismes modèles établis pour la recherche. En revanche, les études sur le nématode transparent Caenorhabditis elegans bénéficient d’une vaste boîte à outils génétique et biochimique 2,3, d’un génome hautement annoté 4,5 et d’un court temps de génération. En effet, la recherche sur C. elegans a permis des avancées fondamentales dans les domaines de l’épigénétique et de l’immunité innée 6,7, et c’est maintenant un modèle établi pour l’étude de la mémoire immunitaire 8,9.
Les microsporidies sont des agents pathogènes fongiques qui infectent presque tous les animaux et provoquent des infections mortelles chez les humains immunodéprimés10. L’infection commence lorsqu’une spore de microsporidie injecte ou « déclenche » son contenu cellulaire (sporoplasme) dans une cellule hôte à l’aide d’une structure appelée tube polaire. La réplication intracellulaire du parasite entraîne la formation de méronts, qui se différencient finalement en spores matures qui peuvent sortir de la cellule11,12. Bien que ces parasites nuisent à la fois à la santé humaine et à la sécurité alimentaire, il reste encore beaucoup à apprendre sur la biologie de leur infection12. Nematocida parisii est un microsporidien naturel qui se réplique exclusivement dans les cellules intestinales des vers, entraînant une réduction de la fécondité et, finalement, la mort. Le modèle d’infection à N. parisii -C. elegans a été utilisé pour montrer : (1) le rôle de l’autophagie dans la clairance des agents pathogènes13, (2) comment les microsporidies peuvent sortir des cellules infectées de manière non lytique14, (3) comment les agents pathogènes peuvent se propager de cellule en cellule en formant une syncytie15, (4) les protéines que N. parisii utilise pour interagir avec son hôte16, et (5) la régulation de la réponse interne à l’agent pathogène transcriptionnel (DPI)17, 18.
Les protocoles pour l’infection de C. elegans sont décrits dans les travaux actuels et peuvent être utilisés pour révéler la biologie unique des microsporidies et disséquer la réponse de l’hôte à l’infection. La microscopie de vers fixes colorés avec le colorant liant la chitine Direct Yellow 96 (DY96) montre la propagation de l’infection des spores de microsporidies contenant de la chitine dans tout l’intestin. La coloration DY96 permet également la visualisation d’embryons de vers contenant de la chitine pour l’évaluation simultanée de la gravidité des vers (capacité à produire des embryons) en tant que lecture de l’aptitude de l’hôte.
Des travaux récents ont révélé que C. elegans infecté par N. parisii produit une progéniture robustement résistante à la même infection19. Cette immunité héréditaire dure une seule génération et dépend de la dose, car la progéniture de parents plus fortement infectés est plus résistante aux microsporidies. Fait intéressant, la progéniture amorcée par N. parisii est également plus résistante à l’agent pathogène intestinal bactérien Pseudomonas aeruginosa, bien qu’elle ne soit pas protégée contre l’agent pathogène naturel Orsay virus19. Les présents travaux montrent également que la progéniture immuno-amorcée limite l’invasion des cellules hôtes par les microsporidies. La méthode décrit également la collection de descendants immuno-amorcés et comment FISH peut être utilisé pour détecter l’ARN de N. parisii dans les cellules intestinales afin de tester l’invasion des cellules hôtes et le déclenchement des spores20.
Ensemble, ces protocoles fournissent une base solide pour l’étude des microsporidies et de l’immunité héréditaire chez C. elegans. On espère que les travaux futurs dans ce système modèle permettront d’importantes découvertes dans le domaine naissant de l’immunité héréditaire. Ces techniques sont également susceptibles d’être des points de départ pour étudier l’immunité héréditaire induite par les microsporidies chez d’autres organismes hôtes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mm zirconia beads</td>
			<td>Biospec Products Inc.</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9FB893150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DRM600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Yellow 96</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S472409-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical rotor</td>
			<td>Thermo Sceintific</td>
			<td>415110 / 1834090806873</td>
			<td>Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB FISH probe</td>
			<td>Biosearch Technologies Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5&#39; modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Wild-type, Bristol strain</td>
			<td>Default strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (5 N)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>FLSS256500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution (6%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield + A16</td>
			<td>Biolynx</td>
			<td>VECTH1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection

L’immunité héréditaire décrit comment certains animaux peuvent transmettre la « mémoire » d’une infection antérieure à leur progéniture. Cela peut augmenter la résistance aux agents pathogènes dans leur progéniture et favoriser la survie. Bien que l’immunité héréditaire ait été rapportée chez de nombreux invertébrés, les mécanismes sous-jacents à ce phénomène épigénétique sont largement inconnus. L’infection de Caenorhabditis elegans par l’agent pathogène microsporidien naturel Nematocida parisii entraîne la production d’une progéniture robuste aux microsporidies. Le présent protocole décrit l’étude de l’immunité intergénérationnelle dans le modèle d’infection simple et génétiquement traitable de N. parisii -C. elegans . L’article actuel décrit les méthodes permettant d’infecter C. elegans et de générer une progéniture immuno-amorcée. Des méthodes sont également données pour mesurer la résistance à l’infection par microsporidies en colorant les microsporidies et en visualisant l’infection par microscopie. En particulier, l’immunité héréditaire empêche l’invasion des cellules hôtes par les microsporidies, et l’hybridation in situ par fluorescence (FISH) peut être utilisée pour quantifier les événements d’invasion. La quantité relative de spores de microsporidies produites dans la progéniture immuno-amorcée peut être quantifiée en colorant les spores avec un colorant liant la chitine. À ce jour, ces méthodes ont mis en lumière la cinétique et la spécificité pathogène de l’immunité héréditaire, ainsi que les mécanismes moléculaires qui la sous-tendent. Ces techniques, ainsi que les nombreux outils disponibles pour la recherche sur C. elegans , permettront d’importantes découvertes dans le domaine de l’immunité héréditaire.

Dans la présente étude, les populations parentales de C. elegans (P0) ont été infectées au stade L1 par une faible dose de spores de N. parisii . Ces conditions d’infection sont généralement utilisées pour obtenir un nombre élevé de descendants F1 résistants aux microsporidies par blanchiment des parents. Les populations parentales infectées et les témoins non infectés ont été fixés à 72 HPI et colorés avec DY96 pour visualiser les embryons de vers et les spores de microsporidies (<...

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Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

L’infection de Caenorhabditis elegans par le parasite microsporidien Nematocida parisii permet aux vers de produire une progéniture très résistante au même agent pathogène. C’est un exemple d’immunité héréditaire, un phénomène épigénétique mal compris. Le présent protocole décrit l’étude de l’immunité héréditaire dans un modèle de ver génétiquement traitable.

Étude de l’immunité héréditaire dans un modèle d’infection à Microsporidia à Caenorhabditis elegans

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Ces protocoles permettent l’étude de l’immunité héréditaire aux microsporidies. Les techniques expliquées ici peuvent nous aider à comprendre comment l’immunité est transmise d’une génération à l’autre et les molécules déterminant l’immunité aux microsporidies chez la progéniture. C.elegans est un modèle simple et génétiquement traitable avec un temps de génération court pour tester l’héritage.Les nombreux outils disponibles pour le ver peuvent être utilisés pour découvrir les mécanismes moléculaires de l’immunité intergénérationnelle. Lorsque vous infectez des animaux P0, utilisez une faible dose de spores qui n’a pas d’impact significatif sur la capacité du parent à produire une progéniture. Cela garantit que le blanchiment donne suffisamment d’animaux F1 pour les expériences en aval Pour commencer, déplacez le nombre requis de plaques de milieu de croissance de nématodes non ensemencés de 10 centimètres de quatre degrés Celsius à température ambiante un jour avant les infections planifiées.Juste avant l’infection, réduisez environ 2 500 vers L1 synchronisés dans un tube de microfuge à 1 400 fois G pendant 30 secondes. Retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette pour laisser les vers dans 50 microlitres de milieu M9. Ajouter un millilitre de 10X souche OP50 d’Escherichia coli aux vers à 1 stade et les spores de N.parisii à la concentration souhaitée.Comme témoin non infecté, préparer un tube équivalent de L1 et OP50 avec un volume de milieu M9 équivalent au volume de préparation de spores utilisé. Mélanger l’échantillon de ver L1 en vortexant brièvement et plaquer au-dessus d’un millilitre de vers sur une plaque de milieu de croissance de nématode non ensemencée de 10 centimètres. Tourbillonnez pour vous assurer que le liquide se répand sur toute la plaque.Séchez les plaques dans une armoire propre avec les couvercles enlevés pendant 10 à 20 minutes ou jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches avant d’incuber à 21 degrés Celsius pendant 72 heures. 72 heures après l’infection, examiner les plaques sous le microscope à dissection. La plaque avec des vers infectés doit contenir moins d’embryons que les plaques avec des vers non infectés.Ensuite, lavez les vers des plaques dans un tube de microcentrifugation à l’aide d’un média M9 millilitre. Si de nombreux vers restent sur les plaques, abattez les vers par centrifugation à 1400 fois G pendant 30 secondes. Retirez le surnageant et effectuez des lavages de plaque supplémentaires.Centrifuger à 1400 fois G pendant 30 secondes à température ambiante pour granuler les vers et laver deux fois avec un millilitre de milieu M9 ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Remettez-le en suspension dans un volume final d’un millilitre de média M9 et mélangez-le bien par pipetage. Transférer 100 microlitres des vers en suspension dans un tube frais et blanchir les 900 microlitres restants pour ouvrir les vers adultes et libérer les embryons F1 pour les tester.Effectuer des infections avec des modifications. comme mentionné dans le manuscrit. 72 heures après l’infection, examiner les plaques sous un microscope à dissection.La plaque avec des vers naïfs doit être plus petite et contenir moins d’embryons que les plaques avec des vers amorcés. Ensuite, commencez le processus de coloration et de fixation des vers en les lavant des plaques dans un tube de microcentrifugation en utilisant un millilitre de 0,1% Tween 20 dans un milieu M9. S’il reste de nombreux vers sur les plaques, abattez les vers par centrifugation à 1 400 fois G pendant 30 secondes à température ambiante, retirez le surnageant à l’aide d’une pointe de pipette et effectuez des lavages supplémentaires des plaques.Après avoir granulé les vers par centrifugation pendant 30 secondes à 1 400 fois G à température ambiante, laver deux fois avec un millilitre de milieu M9 contenant 0,1% Tween 20 ou jusqu’à ce que le surnageant soit clair. Retirez le surnageant, ajoutez 700 microlitres d’acétone et laissez les vers se fixer à température ambiante pendant 10 minutes. Éliminez ces vers fixes pendant 30 secondes à 10 000 fois G à température ambiante et donnez deux lavages d’une solution saline tampon phosphate millilitre contenant 0,1% Tween 20.Préparez 50 millilitres de solution de travail DY96, enveloppez le récipient dans du papier d’aluminium et rangez-le dans un tiroir pour éviter toute exposition à la lumière. Ajouter 500 microlitres de solution de travail DY96 à la pastille de ver et faire pivoter pendant 30 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger cette réaction pendant 30 secondes à 10 000 fois G à température ambiante pour granuler les vers et éliminer le surnageant.Ensuite, ajoutez 15 microlitres du support de montage avec ou sans DAPI. Pipette 10 microlitres de ces vers colorés sur une lame de microscope et place un couvercle sur le dessus. Pour analyser les vers tachés DY96 montés sur des lames, effectuez une imagerie à l’aide du canal GFP d’un microscope à fluorescence.Pour déterminer l’aptitude des populations de vers, utilisez un objectif 5X ou 10X pour mesurer la gravidité de plus de 100 vers par condition. 72 heures après l’infection, les animaux F1 ont été fixés et colorés avec DY96 pour évaluer la résistance aux microsporidies. Les populations parentales infectées et les témoins non infectés ont été fixés 72 heures après l’infection et colorés avec DY96 pour visualiser les embryons de vers et les spores de microsporidies.Les animaux infectés sont petits, contiennent de nombreuses spores de microsporidies et produisent moins d’embryons que les témoins sains et non infectés. L’évaluation de la gravidité des vers a montré qu’environ 95 % des animaux non infectés ont produit une progéniture, comparativement aux animaux infectés, qui étaient inférieurs à 80 %Les quantifications ont révélé qu’environ 90 % de la population traitée par microsporidies étaient infectées, comme déterminé par le nombre de vers contenant des spores colorées par DY96. Les quantifications de ces animaux fixes ont révélé que les vers amorcés contenaient significativement plus d’embryons que leurs homologues naïfs, ce qui indique une plus grande aptitude face à l’infection.Fiji ImageJ a été utilisé pour déterminer le fardeau parasitaire des vers naïfs et immunisés individuels, qui est le pourcentage du corps rempli de spores fluorescentes de N.parisii. Les quantifications ont révélé une réduction spectaculaire du fardeau parasitaire des vers provenant de parents infectés. En outre, les calculs de la taille individuelle des vers ont révélé que les vers amorcés avaient un avantage de croissance significatif sur les animaux naïfs face à l’infection à N.parisii.Des études d’imagerie ont révélé que si les animaux naïfs contenaient généralement plusieurs spores et plusieurs cellules infectées, les animaux amorcés avaient beaucoup moins ou pas de spores et généralement pas de sporoplasmes. Si les populations F1 non amorcées et amorcées ont un nombre similaire d’animaux gravides et infectés, comptez le nombre d’œufs par animal et analysez les tissus infectés avec ImageJ pour trouver des différences plus subtiles. Alors que le jaune direct 96 tache les spores matures, l’hybridation in situ par fluorescence peut révéler des sporoplasmes dans les cellules.Cela peut vous montrer le nombre de cellules infectées dans les vers amorcés et non amorcés. Ces techniques ont montré que la réponse transcriptionnelle parentale peut jouer un rôle déterminant dans l’induction de l’immunité héréditaire chez la progéniture. Les chercheurs étudient maintenant la nature de cette immunité chez la progéniture.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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