Name: studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

אנו מודים לוויני ז'או וליין צ'ן וואן על מתן הערות מועילות על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה למחקר במדעי הטבע וההנדסה של קנדה (מענק #522691522691).

המחקר הנוכחי משתמש בזן בריסטול N2 מסוג C. elegans מסוג בר שגדל ב-21 מעלות צלזיוס.
1. הכנת מדיה
<ol><li>הכן מדיה M9 לפי הדו"ח הקודם21,22.</li>
	<li>להכין מדיום צמיחת נמטודות (NGM) לפי הדו"ח הקודם21,22. יוצקים 12 מ"ל של NGM לכל ...

<ol>
	<li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates:+current+knowledge+and+future+prospects.">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).</li><li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome.">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li><li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics:+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model.">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li><li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+worm:+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity.">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li><li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+your+enemies:+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans.">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection.">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741 (2020).</li><li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+microsporidia:+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites.">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).</li><li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+host+cells+by+microsporidia.">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).</li><li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion,+proliferation+and+exit.">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).</li><li>Balla, K. M., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection.">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).</li><li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+discreet+escape:+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li><li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia.">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li><li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins.">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023 (2017).</li><li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans.">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).</li><li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans.">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring.">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans.">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458 (2022).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic,+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).</li><li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host.">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Rivera, D. E., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines.">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes.">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).</li><li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans.">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).</li><li>Troemel, E. R., F&#233;lix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barri&#232;re, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309 (2008).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved,+stress-specific,+and+have+deleterious+trade-offs.">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425 (2021).</li><li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery.">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).</li><li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube.">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li></ol>

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את חקר המיקרוספורידיה והחסינות התורשתית במודל זיהום פשוט וניתן למתיחה גנטית של N. parisii -C. elegans .
הכנת נבגים היא פרוטוקול אינטנסיבי שבדרך כלל מניב מספיק נבגים במשך 6 חודשים של ניסויים, בהתאם לפרודוקטיביות24. חשוב לציין, יש לקבוע את הה...

חסינות תורשתית היא תופעה אפיגנטית לפיה חשיפה הורית לפתוגנים יכולה לאפשר ייצור של צאצאים עמידים לזיהומים. סוג זה של זיכרון חיסוני הוכח אצל חסרי חוליות רבים חסרי מערכת החיסון הנרכשת ויכולים להגן מפני מחלות ויראליות, חיידקיות ופטרייתיות1. בעוד שלחסינות תורשתית יש השלכות חשובות הן על הבנת הבריאות והן על האבולוציה, המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הגנה זו אינם ידועים במידה רבה. זאת, בין היתר, משום שרבים מבעלי החיים שבהם תוארה חסינות תורשתית אינם אורגניזמים מבוססים למחקר. לעומת זאת, מחקרים בנמטודה השקופה Caenorhabditis elegans נהנים מארגז כלים גנטי וביוכימי נרחב 2,3, גנום מבואר מאוד 4,5, וזמן דור קצר. ואכן, המחקר ב- C. elegans איפשר התקדמות בסיסית בתחומי האפיגנטיקה והחסינות המולדת 6,7, וכיום הוא מודל מבוסס לחקרהזיכרון החיסוני 8,9.
מיקרוספורידיה הם פתוגנים פטרייתיים שמדביקים כמעט את כל בעלי החיים וגורמים לזיהומים קטלניים בבני אדם מדוכאי חיסון10. זיהום מתחיל כאשר נבג מיקרוספורידיה מזריק או "יורה" את התוכן התאי שלו (sporoplasm) לתוך תא מארח באמצעות מבנה שנקרא צינור קוטב. שכפול תוך-תאי של הטפיל גורם להיווצרות של מרונטים, אשר בסופו של דבר מתמיינים לנבגים בוגרים שיכולים לצאת מהתא11,12. בעוד שטפילים אלה מזיקים הן לבריאות האדם והן לביטחון התזונתי, יש עדיין הרבה מה ללמוד על הביולוגיה הזיהומית שלהם12. Nematocida parisii הוא טפיל מיקרוספורידיאני טבעי המשתכפל אך ורק בתאי המעי של התולעים, וכתוצאה מכך מופחת הנקבוביות, ובסופו של דבר למוות. מודל ההדבקה של N. parisii -C. elegans שימש כדי להראות: (1) את התפקיד של אוטופגיה בפינוי פתוגנים13, (2) כיצד מיקרוספורידיה יכולה לצאת מתאים נגועים באופן לא ליטי14, (3) כיצד פתוגנים יכולים להתפשט מתא לתא על ידי יצירת סינקטיה15, (4) החלבונים שבהם N. parisii משתמש כדי להתממשק עם המארח שלה16, ו-(5) ויסות תגובת הפתוגן התוך-תאי השעתוק (IPR)17, 18.
פרוטוקולים לזיהום של C. elegans מתוארים בעבודה הנוכחית וניתן להשתמש בהם כדי לחשוף את הביולוגיה הייחודית של מיקרוספורידיה ולנתח את תגובת המארח לזיהום. המיקרוסקופיה של תולעים קבועות המוכתמות בצבע הקושר כיטין Direct Yellow 96 (DY96) מראה את התפשטות הזיהום של נבגי מיקרוספורידיה המכילים כיטין ברחבי המעי. צביעת DY96 מאפשרת גם הדמיה של עוברי תולעים המכילים כיטין לצורך הערכה סימולטנית של כוח המשיכה של התולעים (היכולת לייצר עוברים) כקריאה של כושר המארח.
עבודות אחרונות גילו כי C. elegans נגועים ב - N. parisii מייצרים צאצאים שעמידים מאוד לאותו זיהום19. חסינות תורשתית זו נמשכת דור אחד ותלויה במינון, שכן צאצאים מהורים נגועים יותר עמידים יותר בפני מיקרוספורידיה. באופן מעניין, הצאצאים בעלי הפריים של N. parisii גם עמידים יותר בפני פתוגן המעי החיידקי Pseudomonas aeruginosa, אם כי הם אינם מוגנים מפני הפתוגן הטבעי Orsay virus19. העבודה הנוכחית מראה גם כי צאצאים בעלי כוונה חיסונית מגבילים את פלישת התאים המארחים על ידי מיקרוספורידיה. השיטה מתארת גם את איסוף הצאצאים בעלי ההון החיסוני וכיצד ניתן להשתמש ב-FISH כדי לזהות N. parisii RNA בתאי מעיים כדי לבחון פלישה של תאים מארחים ולירותנבגים 20.
יחד, פרוטוקולים אלה מספקים בסיס מוצק לחקר מיקרוספורידיה וחסינות תורשתית ב- C. elegans. התקווה היא שעבודה עתידית במערכת מודלים זו תאפשר תגליות חשובות בתחום המתהווה של חסינות תורשתית. טכניקות אלה עשויות גם להיות נקודות מוצא לחקר חסינות תורשתית הנגרמת על ידי מיקרוספורידיה באורגניזמים מארחים אחרים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mm zirconia beads</td>
			<td>Biospec Products Inc.</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9FB893150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DRM600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Yellow 96</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S472409-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical rotor</td>
			<td>Thermo Sceintific</td>
			<td>415110 / 1834090806873</td>
			<td>Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB FISH probe</td>
			<td>Biosearch Technologies Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5&#39; modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Wild-type, Bristol strain</td>
			<td>Default strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (5 N)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>FLSS256500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution (6%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield + A16</td>
			<td>Biolynx</td>
			<td>VECTH1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection

חסינות תורשתית מתארת כיצד בעלי חיים מסוימים יכולים להעביר את "הזיכרון" של זיהום קודם לצאצאיהם. זה יכול להגביר את עמידות הפתוגנים בצאצאיהם ולקדם הישרדות. בעוד שחסינות תורשתית דווחה אצל חסרי חוליות רבים, המנגנונים העומדים בבסיס תופעה אפיגנטית זו אינם ידועים במידה רבה. הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הפתוגן המיקרוספורידיאני הטבעי Nematocida parisii גורם לתולעים לייצר צאצאים עמידים מאוד למיקרוספורידיה. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות בין-דורית במודל ההדבקה הפשוט והניתן לגישה גנטית של N. parisii -C. elegans . המאמר הנוכחי מתאר שיטות להדבקת C. elegans ולייצור צאצאים בעלי סיכון. שיטות ניתנות גם לבדיקת עמידות לזיהום מיקרוספורידיה על ידי צביעה למיקרוספורידיה והדמיה של זיהום על ידי מיקרוסקופיה. בפרט, חסינות תורשתית מונעת פלישת תאים מארחים על ידי מיקרוספורידיה, וניתן להשתמש בהכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לכמת אירועי פלישה. ניתן לכמת את הכמות היחסית של נבגי מיקרוספורידיה המיוצרים בצאצאים בעלי קדם חיסוני על ידי צביעת הנבגים בצבע הקושר כיטין. עד כה, שיטות אלה שפכו אור על הקינטיקה ועל הספציפיות הפתוגנית של חסינות תורשתית, כמו גם על המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיסה. טכניקות אלה, לצד הכלים הנרחבים העומדים לרשות המחקר של C. elegans , יאפשרו תגליות חשובות בתחום החסינות התורשתית.

במחקר הנוכחי, אוכלוסיות הורים של C. elegans (P0) נדבקו בשלב L1 עם מינון נמוך של נבגי N. parisii . תנאי זיהום אלה משמשים בדרך כלל להשגת מספר גבוה של צאצאי F1 עמידים למיקרוספורידיה באמצעות הלבנה של ההורים. אוכלוסיות הורים נגועות ובקרות לא נגועות נקבעו ב-72 hpi והוכתמו ב-DY96 כדי לדמיין את עוברי התולעי...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

הזיהום של Caenorhabditis elegans על ידי הטפיל המיקרוספורידי Nematocida parisii מאפשר לתולעים לייצר צאצאים שעמידים מאוד לאותו פתוגן. זוהי דוגמה לחסינות תורשתית, תופעה אפיגנטית לא מובנת היטב. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את המחקר של חסינות תורשתית במודל תולעת הניתנת למתיחה גנטית.

חקר חסינות תורשתית במודל Caenorhabditis elegans של זיהום מיקרוספורידיה

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

פרוטוקולים אלה מאפשרים לחקור חסינות תורשתית למיקרוספורידיה. הטכניקות המוסברות כאן יכולות לעזור לנו להבין כיצד חסינות מועברת לאורך דורות ואת המולקולות הקובעות חסינות למיקרוספורידיה בצאצאים. C.elegans הוא מודל פשוט וניתן למתיחה גנטית עם זמן דור קצר לבדיקת תורשה.הכלים הרבים הזמינים לתולעת יכולים לשמש לחשיפת מנגנונים מולקולריים של חסינות בין-דורית. בעת הדבקת חיות P0, השתמש במינון נבגים נמוך שאינו משפיע באופן משמעותי על יכולתו של ההורה לייצר צאצאים. זה מבטיח שהלבנה תניב מספיק בעלי חיים F1 לניסויים במורד הזרם כדי להתחיל, להעביר את המספר הנדרש של 10 ס"מ של לוחות בינוניים לצמיחת נמטודה בלתי נזרעת מ-4 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר יום אחד לפני ההדבקות המתוכננות.רגע לפני ההדבקה, גלולה למטה בערך 2, 500 תולעי L1 מסונכרנות בצינור microfuge ב 1, 400 פעמים G במשך 30 שניות. הסר את ה-supernatant עם קצה פיפטה כדי להשאיר תולעים ב-50 מיקרוליטרים של מדיה M9. הוסיפו מיליליטר אחד של זן Escherichia coli 10X OP50 לתולעים חד-שלבית, ונבגים מסוג N.parisii לריכוז הרצוי.כבקרה לא נגועה, הכן צינור שווה ערך של L1s ו- OP50 עם נפח של מדיית M9 השווה לנפח הכנת הנבגים המשמש. מערבבים את דגימת התולעת L1 על ידי מערבולת קצרה ולוח מעל מיליליטר אחד של תולעים על לוחית בינונית של צמיחת נמטודה בלתי נזרעת באורך 10 סנטימטרים. מערבלים כדי לוודא שהנוזל מתפשט על פני כל הצלחת.מייבשים את הצלחות בארון נקי עם המכסים כבויים למשך 10 עד 20 דקות או עד לייבוש מוחלט לפני דגירה בטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. בשעה 72 שעות לאחר ההדבקה, בדקו את הצלחות מתחת למיקרוסקופ הניתוח. הצלחת עם תולעים נגועות אמורה להכיל פחות עוברים מאשר הצלחות עם תולעים לא נגועות.לאחר מכן לשטוף את התולעים מן הצלחות לתוך צינור microcentrifuge באמצעות מדיה M9 מיליליטר אחד. אם תולעים רבות נשארות על הלוחות, גלול את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 1400 פעמים G במשך 30 שניות. מוציאים את הסופרנטנט ומבצעים שטיפות צלחת נוספות.צנטריפוגה ב 1400 פעמים G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר כדי לכדורף את התולעים ולשטוף פעמיים עם מיליליטר אחד של מדיה M9 או עד שהסופרנאטנט ברור. להשעות אותו מחדש בכרך סופי של מדיית M9 מיליליטר אחת ולערבב היטב על ידי צנרת. העבירו 100 מיקרוליטרים של התולעים התלויות לצינור טרי והלבינו את 900 המיקרוליטרים הנותרים כדי לפתוח את התולעים הבוגרות ולשחרר עוברי F1 לבדיקה.לבצע זיהומים עם שינויים. כפי שצוין בכתב היד. בשעה 72 שעות לאחר ההדבקה, בדקו צלחות תחת מיקרוסקופ מנתח.הצלחת עם התולעים הנאיביות צריכה להיות קטנה יותר ולהכיל פחות עוברים מאשר הצלחות עם תולעים מורמות. לאחר מכן, התחל את תהליך ההכתמה והתיקון של התולעים על ידי שטיפתן מהצלחות לתוך צינור microcentrifuge באמצעות מיליליטר אחד של 0.1% Tween 20 במדיה M9. אם תולעים רבות נשארות על הלוחות, גלול את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 1, 400 פעמים G במשך 30 שניות בטמפרטורת החדר, להסיר את supernatant באמצעות קצה פיפטה, ולבצע שטיפות צלחות נוספות.לאחר שכדור התולעים על ידי צנטריפוגה במשך 30 שניות ב-1, 400 פעמים G בטמפרטורת החדר, שטפו פעמיים עם מיליליטר אחד של מדיה M9 המכילה 0.1%Tween 20 או עד שהסופרנאטנט ברור. הסר את ה-supernatant, הוסף 700 מיקרוליטרים של אצטון והשאר את התולעים לתקן בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הוציאו את התולעים הקבועות האלה למשך 30 שניות ב-10, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר ותנו שתי שטיפות של מלח חיץ אחד של מיליליטר פוספט המכיל 0.1% Tween 20.הכינו 50 מיליליטרים של תמיסת עבודה DY96, עטפו את המיכל בנייר כסף ואחסנו אותו במגירה כדי למנוע חשיפה לאור. הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת עבודה DY96 לכדור התולעת וסובבו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. צנטריפוגה תגובה זו במשך 30 שניות ב 10, 000 פעמים G בטמפרטורת החדר כדי לכדור את התולעים ולהסיר את supernatant.לאחר מכן, הוסף 15 מיקרוליטרים של מדיום ההרכבה עם או בלי DAPI. פיפטה 10 מיקרוליטרים של התולעים המוכתמות האלה על מגלשת מיקרוסקופ ומניחים כיסוי מעל החלקה העליונה. כדי לנתח את התולעים המוכתמות ב-DY96 המותקנות על שקופיות, בצעו הדמיה באמצעות תעלת ה-GFP של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.כדי לקבוע את הכשירות של אוכלוסיות התולעים, השתמש במטרה של פי 5 או 10X כדי לבדוק את כוח המשיכה של יותר מ -100 תולעים לכל מצב. בשעה 72 שעות לאחר ההדבקה, חיות ה-F1 תוקנו והוכתמו ב-DY96 כדי להעריך את עמידות המיקרוספורידיה. אוכלוסיות הורים נגועות ובקרות לא נגועות תוקנו ב-72 שעות לאחר ההדבקה והוכתמו ב-DY96 כדי לדמיין את עוברי התולעים ואת נבגי המיקרוספורידיה.בעלי חיים נגועים הם קטנים, מכילים נבגי מיקרוספורידיה רבים, ומייצרים פחות עוברים מאשר פקדים בריאים ולא נגועים. הערכת כוח המשיכה של התולעים הראתה כי כ-95% מבעלי החיים הלא נגועים ייצרו צאצאים, בהשוואה לבעלי החיים הנגועים, שהיו פחות מ-80% כימות גילתה שכ-90% מהאוכלוסייה שטופלה במיקרוספורידיה היו נגועים, כפי שנקבע על ידי מספר התולעים המכילות נבגים מוכתמים ב-DY96. כימותים של בעלי חיים קבועים אלה גילו כי התולעים הראשוניות הכילו הרבה יותר עוברים מאשר עמיתיהם הנאיביים, מה שמעיד על כושר טוב יותר מול זיהום.פיג'י אימג'יי שימש לקביעת נטל הטפילים של תולעים נאיביות וחסינות בודדות, שהוא אחוז הגוף המלא בנבגי N.parisii פלואורסצנטיים. הכימותים חשפו ירידה דרמטית בנטל הטפילים של התולעים שהגיעו מהורים נגועים. יתר על כן, חישובי גודל התולעים האינדיבידואליים גילו כי לתולעים בעלות פריים היה יתרון גדילה משמעותי על פני בעלי חיים תמימים מול זיהום N.parisii.מחקרי הדמיה גילו כי בעוד שבעלי חיים תמימים הכילו בדרך כלל נבגים מרובים וכמה תאים נגועים, לבעלי החיים הפגועים היו הרבה פחות נבגים או ללא נבגים ובדרך כלל לא היו ספורופלזמות. אם באוכלוסיות F1 לא מרוסקות ומזוהמות יש מספר דומה של בעלי חיים דביקים ומזוהמים, ספרו את מספר הביצים לכל חיה, וניתחו את הרקמה הנגועה ב-ImageJ כדי למצוא הבדלים עדינים יותר. בעוד צהוב ישיר 96 כתמים נבגים בוגרים, הכלאה פלואורסצנטית באתרה יכולה לחשוף ספורופלזמות בתוך התאים.זה יכול להראות לך את מספר התאים הנגועים בתולעים מורמות ובלתי מרוסנות. טכניקות אלה הראו כי תגובת השעתוק ההורית יכולה לסייע בגרימת חסינות תורשתית אצל צאצאים. חוקרים חוקרים כעת את מהותה של חסינות זו אצל צאצאים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris זיהום: מודל של חסינות סוג 2, דלקת במעיים

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

מבחר Plasmodium falciparum טפילים עבור Cytoadhesion לתאי המוח האנושי האנדותל

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

תזרים הידבקות Assay ללמוד יקוציט גיוס לבדית אדם סינוסי תנאי האנדותל של מתח שאר

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

פרוטוקול להדביק<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; עם<em&gt; Typhimurium סלמונלה</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

בידוד נויטרופילים וניתוח כדי לקבוע את תפקידם רגישות תאים לימפומה לסוכנים טיפוליים

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

הדמיה פליטת אור כדי לזהות זיהום בשלב מאוחר של מחלת השינה

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

החלת העברת אנרגית תהודת קרינה (סריג) לבחינת יעילות טרנסלוקציה מפעיל ידי<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; במהלך siRNA השתקה

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

הערכת התקפה אלימה ו פתוגנזה של זיהום Aeromonas במודל Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

לדוגמא Galleria mellonella Waxworm זיהום קנדידה המופץ

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...