Name: studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00
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Siamo grati a Winnie Zhao e Yin Chen Wan per aver fornito utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dal Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).

Il presente studio utilizza il ceppo N2 wild-type C. elegans Bristol coltivato a 21 °C.
1. Preparazione dei media
<ol><li>Preparare i media M9 come da rapporto precedente21,22.</li>
	<li>Preparare il mezzo di crescita dei nematodi (NGM) come da precedente rapporto21,22. Versare 12 ml di NGM per piastra da 6 cm o 30 ml per piastra da 10 cm.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates:+current+knowledge+and+future+prospects.">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).</li><li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome.">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li><li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics:+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model.">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li><li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+worm:+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity.">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li><li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+your+enemies:+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans.">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection.">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741 (2020).</li><li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+microsporidia:+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites.">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).</li><li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+host+cells+by+microsporidia.">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).</li><li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion,+proliferation+and+exit.">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).</li><li>Balla, K. M., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection.">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).</li><li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+discreet+escape:+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li><li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia.">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li><li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins.">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023 (2017).</li><li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans.">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).</li><li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans.">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring.">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans.">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458 (2022).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic,+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).</li><li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host.">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Rivera, D. E., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines.">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes.">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).</li><li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans.">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).</li><li>Troemel, E. R., F&#233;lix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barri&#232;re, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309 (2008).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved,+stress-specific,+and+have+deleterious+trade-offs.">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425 (2021).</li><li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery.">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).</li><li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube.">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li></ol>

Il presente protocollo descrive lo studio dei microsporidi e dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da N. parisii -C. elegans semplice e geneticamente trattabile.
La preparazione delle spore è un protocollo intensivo che in genere produce abbastanza spore per 6 mesi di esperimenti, a seconda della produttività24. È importante sottolineare che l'infettività deve essere determinata per ogni nuovo "lotto" di spore prima di utilizzarlo pe...

L'immunità ereditaria è un fenomeno epigenetico in cui l'esposizione dei genitori agli agenti patogeni può consentire la produzione di prole resistente alle infezioni. Questo tipo di memoria immunitaria è stato dimostrato in molti invertebrati che mancano di sistema immunitario adattativo e possono proteggere dalle malattie virali, batteriche e fungine1. Mentre l'immunità ereditaria ha importanti implicazioni per la comprensione sia della salute che dell'evoluzione, i meccanismi molecolari alla base di questa protezione sono in gran parte sconosciuti. Ciò è in parte dovuto al fatto che molti degli animali in cui è stata descritta l'immunità ereditaria non sono organismi modello stabiliti per la ricerca. Al contrario, gli studi sul nematode trasparente Caenorhabditis elegans beneficiano di un ampio toolkit genetico e biochimico 2,3, un genoma altamente annotato 4,5 e un breve periodo di generazione. In effetti, la ricerca in C. elegans ha permesso progressi fondamentali nei campi dell'epigenetica e dell'immunità innata 6,7, ed è ora un modello consolidato per lo studio della memoria immunitaria 8,9.
I microsporidi sono patogeni fungini che infettano quasi tutti gli animali e causano infezioni letali negli esseri umani immunocompromessi10. L'infezione inizia quando una spora di microsporidi inietta o "accende" il suo contenuto cellulare (sporoplasma) in una cellula ospite utilizzando una struttura chiamata tubo polare. La replicazione intracellulare del parassita provoca la formazione di meronts, che alla fine si differenziano in spore mature che possono uscire dalla cellula11,12. Mentre questi parassiti sono dannosi sia per la salute umana che per la sicurezza alimentare, c'è ancora molto da imparare sulla loro biologia delle infezioni12. Nematocida parisii è un parassita microsporidiano naturale che si replica esclusivamente nelle cellule intestinali dei vermi, con conseguente riduzione della fecondità e, in definitiva, morte. Il modello di infezione da N. parisii -C. elegans è stato utilizzato per mostrare: (1) il ruolo dell'autofagia nella clearance dei patogeni13, (2) come i microsporidi possono uscire dalle cellule infette in modo non litico14, (3) come i patogeni possono diffondersi da cellula a cellula formando sincizia15, (4) le proteine che N. parisii usa per interfacciarsi con il suo ospite16 e (5) la regolazione della risposta patogena intracellulare trascrizionale (IPR)17, 18.
I protocolli per l'infezione di C. elegans sono descritti nel lavoro attuale e possono essere utilizzati per rivelare la biologia unica dei microsporidi e sezionare la risposta dell'ospite all'infezione. La microscopia di vermi fissi colorati con il colorante legante la chitina Direct Yellow 96 (DY96) mostra la diffusione dell'infezione delle spore di microsporidi contenenti chitina in tutto l'intestino. La colorazione DY96 consente anche la visualizzazione di embrioni di vermi contenenti chitina per la valutazione simultanea della gravidità dei vermi (capacità di produrre embrioni) come lettura dell'idoneità dell'ospite.
Lavori recenti hanno rivelato che C. elegans infettato da N. parisii produce prole che è robustamente resistente alla stessa infezione19. Questa immunità ereditaria dura una sola generazione ed è dose-dipendente, poiché la prole di genitori più pesantemente infetti è più resistente ai microsporidi. È interessante notare che la prole innescata da N. parisii è anche più resistente al patogeno batterico intestinale Pseudomonas aeruginosa, sebbene non sia protetta contro il patogeno naturale Orsay virus19. Il presente lavoro mostra anche che la prole immuno-innescata limita l'invasione delle cellule ospiti da parte dei microsporidi. Il metodo descrive anche la raccolta di prole immuno-innescata e come fish può essere utilizzato per rilevare n. parisii RNA nelle cellule intestinali per testare l'invasione delle cellule ospiti e il fuoco delle spore20.
Insieme, questi protocolli forniscono una solida base per lo studio dei microsporidi e dell'immunità ereditaria in C. elegans. Si spera che il lavoro futuro in questo sistema modello consentirà importanti scoperte nel nascente campo dell'immunità ereditaria. Queste tecniche sono anche probabilmente punti di partenza per studiare l'immunità ereditaria indotta da microsporidi in altri organismi ospiti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mm zirconia beads</td>
			<td>Biospec Products Inc.</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9FB893150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DRM600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Yellow 96</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S472409-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical rotor</td>
			<td>Thermo Sceintific</td>
			<td>415110 / 1834090806873</td>
			<td>Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB FISH probe</td>
			<td>Biosearch Technologies Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5&#39; modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Wild-type, Bristol strain</td>
			<td>Default strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (5 N)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>FLSS256500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution (6%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield + A16</td>
			<td>Biolynx</td>
			<td>VECTH1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection

L'immunità ereditaria descrive come alcuni animali possono trasmettere la "memoria" di una precedente infezione alla loro prole. Questo può aumentare la resistenza agli agenti patogeni nella loro progenie e promuovere la sopravvivenza. Mentre l'immunità ereditaria è stata riportata in molti invertebrati, i meccanismi alla base di questo fenomeno epigenetico sono in gran parte sconosciuti. L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del patogeno microsporidico naturale Nematocida parisii provoca la produzione di vermi che sono robustamente resistenti ai microsporidi. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità intergenerazionale nel modello di infezione da N. parisii -C. elegans semplice e geneticamente trattabile. L'articolo attuale descrive i metodi per infettare C. elegans e generare prole immuno-innescata. Vengono inoltre forniti metodi per valutare la resistenza all'infezione da microsporidi mediante colorazione per microsporidi e visualizzazione dell'infezione al microscopio. In particolare, l'immunità ereditaria previene l'invasione delle cellule ospiti da parte dei microsporidi e l'ibridazione fluorescente in situ (FISH) può essere utilizzata per quantificare gli eventi di invasione. La quantità relativa di spore di microsporidi prodotte nella prole immuno-innescata può essere quantificata colorando le spore con un colorante che lega la chitina. Ad oggi, questi metodi hanno fatto luce sulla cinetica e sulla specificità patogena dell'immunità ereditaria, nonché sui meccanismi molecolari alla base. Queste tecniche, insieme agli ampi strumenti disponibili per la ricerca su C. elegans , consentiranno importanti scoperte nel campo dell'immunità ereditaria.

Nel presente studio, le popolazioni parentali di C. elegans (P0) sono state infettate allo stadio L1 con una bassa dose di spore di N. parisii . Queste condizioni di infezione sono tipicamente utilizzate per ottenere un numero elevato di progenie F1 resistente ai microsporidi attraverso lo sbiancamento dei genitori. Le popolazioni parentali infette e i controlli non infetti sono stati fissati a 72 hpi e colorati con DY96 per visualizzare gli embrioni di vermi e le spore di microsporidi (<strong class="x...

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Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

L'infezione di Caenorhabditis elegans da parte del parassita microsporidiano Nematocida parisii consente ai vermi di produrre prole altamente resistente allo stesso agente patogeno. Questo è un esempio di immunità ereditaria, un fenomeno epigenetico poco compreso. Il presente protocollo descrive lo studio dell'immunità ereditaria in un modello di verme geneticamente trattabile.

Studio dell'immunità ereditaria in un modello di infezione da microsporidi di Caenorhabditis elegans

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Questi protocolli consentono lo studio dell'immunità ereditaria ai microsporidi. Le tecniche spiegate qui possono aiutarci a capire come l'immunità viene trasmessa attraverso le generazioni e le molecole che determinano l'immunità ai microsporidi nella prole. C.elegans è un modello semplice e geneticamente trattabile con un breve tempo di generazione per l'analisi dell'ereditarietà.I numerosi strumenti disponibili per il verme possono essere utilizzati per scoprire i meccanismi molecolari dell'immunità intergenerazionale. Quando si infettano animali P0, utilizzare una bassa dose di spore che non influisce in modo significativo sulla capacità del genitore di produrre progenie. Ciò garantisce che lo sbiancamento produca abbastanza animali F1 per gli esperimenti a valle Per iniziare, spostare il numero richiesto di piastre medie di crescita dei nematodi senza semi di 10 centimetri da quattro gradi Celsius a temperatura ambiente un giorno prima delle infezioni pianificate.Poco prima dell'infezione, pellet giù circa 2.500 vermi L1 sincronizzati in un tubo di microfuga a 1.400 volte G per 30 secondi. Rimuovere il surnatante con una punta a pipetta per lasciare i vermi in 50 microlitri di supporti M9. Aggiungere un millilitro di 10X Escherichia coli ceppo OP50 ai vermi a 1 stadio e spore N.parisii alla concentrazione desiderata.Come controllo non infetto, preparare un tubo equivalente di L1 e OP50 con un volume di mezzi M9 equivalente al volume di preparazione delle spore utilizzato. Mescolare il campione di verme L1 vorticando brevemente e piastra sopra un millilitro di vermi su una piastra media di crescita di nematodi senza semi di 10 centimetri. Ruotare per assicurarsi che il liquido si diffonda su tutto il piatto.Asciugare le piastre in un armadio pulito con i coperchi spenti per 10-20 minuti o fino a completa asciugatura prima di incubare a 21 gradi Celsius per 72 ore. A 72 ore dopo l'infezione, esaminare le piastre al microscopio sezionante. La piastra con vermi infetti dovrebbe contenere meno embrioni rispetto alle placche con vermi non infetti.Quindi lavare i vermi dalle piastre in un tubo microcentrifuga usando un mezzo M9 da un millilitro. Se molti vermi rimangono sulle piastre, pellet i vermi mediante centrifugazione a 1400 volte G per 30 secondi. Rimuovere il surnatante ed eseguire ulteriori lavaggi a piastre.Centrifugare a 1400 volte G per 30 secondi a temperatura ambiente per pellettizzare i vermi e lavare due volte con un millilitro di mezzo M9 o fino a quando il surnatante non è chiaro. Sospendetelo in un volume finale di un millilitro M9 e mescolate bene mediante pipettaggio. Trasferire 100 microlitri dei vermi sospesi in un tubo fresco e sbiancare i restanti 900 microlitri per rompere i vermi adulti e rilasciare embrioni F1 per i test.Eseguire infezioni con modifiche. come menzionato nel manoscritto. A 72 ore dopo l'infezione, esaminare le piastre al microscopio sezionante.Il piatto con vermi ingenui dovrebbe essere più piccolo e contenere meno embrioni rispetto alle placche con vermi innescati. Quindi, avviare il processo di colorazione e fissaggio dei vermi lavandoli dalle piastre in un tubo microcentrifuga utilizzando un millilitro di 0,1% Tween 20 in un mezzo M9. Se molti vermi rimangono sulle piastre, pellet i vermi mediante centrifugazione a 1, 400 volte G per 30 secondi a temperatura ambiente, rimuovere il surnatante usando una punta di pipetta ed eseguire ulteriori lavaggi a piastre.Dopo aver pellettato i vermi mediante centrifugazione per 30 secondi a 1.400 volte G a temperatura ambiente, lavare due volte con un millilitro di mezzo M9 contenente 0,1% Tween 20 o fino a quando il surnatante non è chiaro. Rimuovere il surnatante, aggiungere 700 microlitri di acetone e lasciare che i vermi fissino a temperatura ambiente per 10 minuti. Pellet fuori questi vermi fissi per 30 secondi a 10.000 volte G a temperatura ambiente e dare due lavaggi di un millilitro tampone fosfato salino contenente 0,1% Tween 20.Preparare 50 millilitri di soluzione di lavoro DY96, avvolgere il contenitore in un foglio e conservarlo in un cassetto per evitare l'esposizione alla luce. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavoro DY96 al pellet di vite senza fine e ruotare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifugare questa reazione per 30 secondi a 10.000 volte G a temperatura ambiente per pellettizzare i vermi e rimuovere il surnatante.Quindi, aggiungere 15 microlitri del mezzo di montaggio con o senza DAPI. Pipettare 10 microlitri di questi vermi macchiati su un vetrino per microscopio e posizionare un coperchio scivolare sopra la parte superiore. Per analizzare i vermi colorati DY96 montati su vetrini, eseguire l'imaging utilizzando il canale GFP di un microscopio a fluorescenza.Per determinare l'idoneità delle popolazioni di vermi, utilizzare un obiettivo 5X o 10X per testare la gravidità di oltre 100 vermi per condizione. A 72 ore dall'infezione, gli animali di F1 sono stati fissati e colorati con DY96 per valutare la resistenza ai microsporidi. Le popolazioni parentali infette e i controlli non infetti sono stati fissati a 72 ore dopo l'infezione e colorati con DY96 per visualizzare gli embrioni di verme e le spore di microsporidi.Gli animali infetti sono piccoli, contengono molte spore di microsporidi e producono meno embrioni rispetto ai controlli sani e non infetti. La valutazione della gravidità dei vermi ha mostrato che circa il 95% degli animali non infetti produceva prole, rispetto agli animali infetti, che erano inferiori all'80% Le quantificazioni hanno rivelato che circa il 90% della popolazione trattata con microsporidi era infetta, come determinato dal numero di vermi contenenti spore macchiate di DY96. Le quantificazioni di questi animali fissi hanno rivelato che i vermi innescati contenevano significativamente più embrioni rispetto alle loro controparti ingenue, indicando una maggiore idoneità di fronte all'infezione.Fiji ImageJ è stato utilizzato per determinare il carico parassitario dei singoli vermi naïve e immuno innescati, che è la percentuale del corpo piena di spore fluorescenti N.parisii. Le quantificazioni hanno rivelato una drastica riduzione del carico parassitario dei vermi provenienti da genitori infetti. Inoltre, i calcoli delle dimensioni dei singoli vermi hanno rivelato che i vermi innescati avevano un significativo vantaggio di crescita rispetto agli animali naïve di fronte all'infezione da N.parisii.Studi di imaging hanno rivelato che mentre gli animali naïve in genere contenevano più spore e diverse cellule infette, gli animali innescati avevano molte meno o nessuna spora e in genere nessun sporoplasma. Se le popolazioni di F1 non innescate e innescate hanno un numero simile di animali gravidi e infetti, contare il numero di uova per animale e analizzare il tessuto infetto con ImageJ per trovare differenze più sottili. Mentre il giallo diretto 96 macchie di spore mature, l'ibridazione fluorescente in situ può rivelare sporoplasmi all'interno delle cellule.Questo può mostrarti il numero di cellule infette nei vermi innescati e non innescati. Queste tecniche hanno dimostrato che la risposta trascrizionale dei genitori può essere strumentale nell'indurre l'immunità ereditaria nella prole. I ricercatori stanno ora studiando la natura di questa immunità nella prole.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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