Name: studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00
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Somos gratos a Winnie Zhao e Yin Chen Wan por fornecer comentários úteis sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Pesquisa em Ciências Naturais e Engenharia do Canadá (Grant #522691522691).

O presente estudo utiliza o tipo selvagem C. elegans Bristol strain N2 cultivado a 21 °C.
1. Preparação de mídia
<ol><li>Prepare a mídia M9 conforme relatório anterior 21,22.</li>
	<li>Prepare o meio de crescimento do nematoide (GNM) conforme relatório anterior21,22. Despeje 12 mL de NGM por placa de 6 cm ou 30 mL por placa de 10 cm.</li>
	<li...

<ol>
	<li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates:+current+knowledge+and+future+prospects.">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).</li><li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome.">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li><li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics:+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model.">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li><li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+worm:+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity.">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li><li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+your+enemies:+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans.">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection.">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741 (2020).</li><li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+microsporidia:+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites.">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).</li><li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+host+cells+by+microsporidia.">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).</li><li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion,+proliferation+and+exit.">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).</li><li>Balla, K. M., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection.">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).</li><li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+discreet+escape:+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li><li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia.">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li><li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins.">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023 (2017).</li><li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans.">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).</li><li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans.">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring.">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans.">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458 (2022).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic,+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).</li><li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host.">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Rivera, D. E., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines.">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes.">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).</li><li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans.">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).</li><li>Troemel, E. R., F&#233;lix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barri&#232;re, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309 (2008).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved,+stress-specific,+and+have+deleterious+trade-offs.">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425 (2021).</li><li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery.">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).</li><li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube.">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li></ol>

O presente protocolo descreve o estudo da microsporidia e da imunidade herdada em um modelo de infecção n. parisii-C. elegans simples e geneticamente tratável.
A preparação do esporo é um protocolo intensivo que normalmente produz esporos suficientes para 6 meses de experimentos, dependendo da produtividade24. É importante ressaltar que a infectividade deve ser determinada para cada novo esporo "lote" antes de usá-lo para os experimentos. Devid...

A imunidade herdada é um fenômeno epigenético pelo qual a exposição dos pais a patógenos pode permitir a produção de descendentes resistentes a infecções. Esse tipo de memória imunológica tem sido mostrado em muitos invertebrados que não possuem sistemas imunológicos adaptativos e podem proteger contra doenças virais, bacterianas e fúngicas1. Embora a imunidade herdada tenha implicações importantes para entender a saúde e a evolução, os mecanismos moleculares subjacentes a essa proteção são amplamente desconhecidos. Isso ocorre em parte porque muitos dos animais em que a imunidade herdada foi descrita não são organismos modelo estabelecidos para pesquisa. Em contraste, estudos no nematode transparente Caenorhabditis elegans se beneficiam de um extenso kit de ferramentas genéticas e bioquímicas 2,3, um genoma altamente anotado 4,5, e um curto tempo de geração. De fato, a pesquisa em C. elegans permitiu avanços fundamentais nos campos da epigenética e imunidade inata 6,7, e agora é um modelo estabelecido para estudar a memória imunológica 8,9.
Microsporidia são patógenos fúngicos que infectam quase todos os animais e causam infecções letais em humanos imunocomprometidos10. A infecção começa quando um esporo de microsporidia injeta ou "dispara" seu conteúdo celular (sporoplasma) em uma célula hospedeira usando uma estrutura chamada tubo polar. A replicação intracelular do parasita resulta na formação de meronts, que acabam se diferenciando em esporos maduros que podem sair da célula11,12. Embora esses parasitas sejam prejudiciais tanto para a saúde humana quanto para a segurança alimentar, ainda há muito a aprender sobre sua biologia de infecção12. Nematocida parisii é um parasita microsporídano natural que se replica exclusivamente nas células intestinais dos vermes, resultando em redução da fecundidade e, em última instância, morte. O modelo de infecção N. parisii -C. elegans tem sido usado para mostrar: (1) o papel da autofagia no desembaraço do patógeno13, (2) como a microsporidia pode sair das células infectadas nãoapenas 14, (3) como os patógenos podem se espalhar de célula para célula formando sincronia15, (4) as proteínas N. parisii usam para interagir com seu hospedeiro16, e (5) a regulação da resposta transcricional de patógenos intracelulares (IPR)17, 18 anos.
Os protocolos para a infecção de C. elegans são descritos no trabalho atual e podem ser usados para revelar a biologia única da microsporidia e dissecar a resposta do hospedeiro à infecção. A microscopia de vermes fixos manchados com o corante de tingitina Direct Yellow 96 (DY96) mostra a propagação da infecção de esporos de microsporidia contendo quitina em todo o intestino. A coloração DY96 também permite a visualização de embriões de vermes contendo quitina para a avaliação simultânea da gravididade do verme (capacidade de produzir embriões) como uma leitura da aptidão do hospedeiro.
Trabalhos recentes revelaram que C. elegans infectados com N. parisii produzem descendentes que são robustamente resistentes à mesma infecção19. Esta imunidade herdada dura uma única geração e é dependente de doses, pois descendentes de pais mais fortemente infectados são mais resistentes à microsporidia. Curiosamente, os filhotes de N. parisii também são mais resistentes ao patógeno intestinal bacteriano Pseudomonas aeruginosa, embora não estejam protegidos contra o vírus natural orsay19. O presente trabalho também mostra que a prole imuno-preparada limita a invasão de células hospedeiras por microsporidia. O método também descreve a coleção de descendentes imuno-primed e como o PEIXE pode ser usado para detectar N. parisii RNA em células intestinais para avaliar a invasão celular hospedeira e o disparode 20 esporos.
Juntos, esses protocolos fornecem uma base sólida para o estudo da microsporidia e imunidade herdada em C. elegans. Espera-se que o trabalho futuro neste sistema modelo permita importantes descobertas no campo nascente da imunidade herdada. Essas técnicas também são susceptíveis de ser pontos de partida para investigar a imunidade herdada induzida pela microsporídia em outros organismos hospedeiros.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mm zirconia beads</td>
			<td>Biospec Products Inc.</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9FB893150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DRM600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Yellow 96</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S472409-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical rotor</td>
			<td>Thermo Sceintific</td>
			<td>415110 / 1834090806873</td>
			<td>Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB FISH probe</td>
			<td>Biosearch Technologies Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5&#39; modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Wild-type, Bristol strain</td>
			<td>Default strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (5 N)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>FLSS256500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution (6%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield + A16</td>
			<td>Biolynx</td>
			<td>VECTH1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection

Imunidade herdada descreve como alguns animais podem passar a "memória" de uma infecção anterior para seus filhos. Isso pode aumentar a resistência ao patógeno em sua descendência e promover a sobrevivência. Embora a imunidade herdada tenha sido relatada em muitos invertebrados, os mecanismos subjacentes a este fenômeno epigenético são amplamente desconhecidos. A infecção de Caenorhabditis elegans pelo patógeno microsporidiano natural Nematocida parisii resulta nos vermes que produzem descendentes que são robustamente resistentes à microsporidia. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade intergeracional no modelo de infecção n . parisii -C. elegans simples e geneticamente tratável. O artigo atual descreve métodos para infectar C. elegans e gerar descendentes imuno-primed. Métodos também são dados para avaliar a resistência à infecção por microsporidia, por meio da coloração de microsporidia e da visualização da infecção por microscopia. Em particular, a imunidade herdada impede a invasão de células hospedeiras por microsporidia, e a fluorescência na hibridização in situ (FISH) pode ser usada para quantificar eventos de invasão. A quantidade relativa de esporos de microsporidia produzidos na prole imuno-primed pode ser quantificada pela coloração dos esporos com um corante de ligação de quitina. Até o momento, esses métodos lançaram luz sobre a cinética e a especificidade do patógeno da imunidade herdada, bem como os mecanismos moleculares que a subjacente. Essas técnicas, ao lado das extensas ferramentas disponíveis para a pesquisa de C. elegans , permitirão importantes descobertas no campo da imunidade herdada.

No presente estudo, as populações parentais de C. elegans (P0) foram infectadas na fase L1 com uma baixa dose de esporos N. parisii . Essas condições de infecção são tipicamente usadas para obter um alto número de progêneres f1 resistentes a microsporídia através do branqueamento dos pais. Populações parentais infectadas e controles não infectados foram fixados em 72 hpi e manchados com DY96 para visualizar os embriões de vermes e esporos de microsporidia (Figura 1A</...

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Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

A infecção da Caenorhabditis elegans pelo parasita microsporidiano Nematocida parisii permite que os vermes produzam descendentes altamente resistentes ao mesmo patógeno. Este é um exemplo de imunidade herdada, um fenômeno epigenético mal compreendido. O presente protocolo descreve o estudo da imunidade herdada em um modelo de verme geneticamente tratável.

Estudando imunidade herdada em um modelo de infecção por microsporidia

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Esses protocolos permitem o estudo da imunidade herdada à microsporidia. Técnicas explicadas aqui podem nos ajudar a entender como a imunidade é transmitida através de gerações e as moléculas que determinam imunidade à microsporidia na prole. C.elegans é um modelo simples e geneticamente tratável com um curto tempo de geração para avaliar a herança.As muitas ferramentas disponíveis para o verme podem ser usadas para descobrir mecanismos moleculares de imunidade intergeracional. Ao infectar animais P0, use uma dose de esporo baixa que não impacte significativamente a capacidade do pai de produzir prole. Isso garante que o branqueamento produz animais F1 suficientes para experimentos a jusante Para começar, mova o número necessário de placas médias de crescimento de nematoides não semeadas de 10 centímetros de quatro graus Celsius para a temperatura ambiente um dia antes das infecções planejadas.Pouco antes da infecção, a pelota diminuiu aproximadamente 2.500 vermes L1 sincronizados em um tubo de microfuge a 1.400 vezes G por 30 segundos. Remova o supernatante com uma ponta de pipeta para deixar vermes em 50 microliters de mídia M9. Adicione um mililitro de 10X Escherichia coli cepa OP50 aos vermes de 1 estágio, e esporos N.parisii à concentração desejada.Como um controle não infectado, prepare um tubo equivalente de L1s e OP50 com um volume de mídia M9 equivalente ao volume de preparação de esporos utilizado. Misture a amostra de verme L1 por vórtice brevemente e placa acima de um mililitro de vermes em uma placa média de crescimento de nematoide não semeada de 10 centímetros. Gire para garantir que o líquido se espalhe por toda a placa.Seque as placas em um armário limpo com as tampas desligada por 10 a 20 minutos ou até secar completamente antes de incubar a 21 graus Celsius por 72 horas. Às 72 horas após a infecção, examine as placas sob o microscópio dissecando. A placa com vermes infectados deve conter menos embriões do que as placas com vermes não infectados.Em seguida, lave os vermes das placas em um tubo de microcentrifuuge usando um mililitro M9 media. Se muitos vermes permanecerem nas placas, pelota os vermes por centrifugação a 1400 vezes G por 30 segundos. Remova o supernatante e realize lavagens adicionais de placas.Centrifugar a 1400 vezes G por 30 segundos à temperatura ambiente para pelotar os vermes e lavar duas vezes com um mililitro de mídia M9 ou até que o supernatante esteja limpo. Suspenda-o em um volume final de uma mídia M9 mililitro e misture bem por pipetação. Transfira 100 microliters dos vermes suspensos para um tubo fresco e alvejar os 900 microliters restantes para quebrar os vermes adultos e liberar embriões de F1 para testes.Realizar infecções com modificações. como mencionado no manuscrito. Às 72 horas após a infecção, examine as placas sob um microscópio dissecando.A placa com vermes ingênuos deve ser menor e conter menos embriões do que as placas com vermes preparados. Em seguida, inicie o processo de coloração e fixação de vermes lavando-os das placas em um tubo de microcentrifuuge usando um mililitro de 0,1%Tween 20 em mídia M9. Se muitos vermes permanecerem nas placas, pelotar os vermes por centrifugação a 1.400 vezes G durante 30 segundos em temperatura ambiente, remover o sobrenatante usando uma ponta de pipeta e realizar lavagens adicionais de placas.Depois de pelleting os vermes por centrifugação por 30 segundos a 1.400 vezes G à temperatura ambiente, lave duas vezes com um mililitro de mídia M9 contendo 0,1% Interpol 20 ou até que o supernante esteja claro. Remova o supernatante, adicione 700 microliters de acetona e deixe os vermes para fixar à temperatura ambiente por 10 minutos. Pellule esses vermes fixos por 30 segundos a 10.000 vezes G à temperatura ambiente e dê duas lavagens de um soro fisco tampão de fosfato mililitro contendo 0,1%Tween 20.Prepare 50 mililitros de solução de trabalho DY96, enrole o recipiente em papel alumínio e armazene-o em uma gaveta para evitar a exposição à luz. Adicione 500 microliters de solução de trabalho DY96 à pelota de minhoca e gire por 30 minutos à temperatura ambiente na escuridão. Centrifugar esta reação por 30 segundos a 10.000 vezes G à temperatura ambiente para pellet os vermes e remover o supernatante.Em seguida, adicione 15 microliters do meio de montagem com ou sem DAPI. Pipeta 10 microlitros desses vermes manchados em um slide de microscópio e coloque um deslizamento de cobertura por cima. Para analisar os worms manchados de DY96 montados em slides, realize imagens usando o canal GFP de um microscópio de fluorescência.Para determinar a aptidão das populações de vermes, use um objetivo 5X ou 10X para avaliar a gravididade de mais de 100 vermes por condição. Com 72 horas após a infecção, os animais de F1 foram fixados e manchados com DY96 para avaliar a resistência à microsporidia. Populações parentais infectadas e controles não infectados foram fixados em 72 horas após a infecção e manchados com DY96 para visualizar os embriões de vermes e esporos de microsporidia.Animais infectados são pequenos, contêm muitos esporos de microsporidia, e produzem menos embriões do que controles saudáveis e não infectados. A avaliação da gravididade dos vermes mostrou que aproximadamente 95% dos animais não infectados produziram descendentes, em comparação com os animais infectados, que eram inferiores a 80% Quantificações revelaram que aproximadamente 90% da população tratada com microsporidia foram infectadas, conforme determinado pelo número de vermes contendo esporos manchados de DY96. Quantificações desses animais fixos revelaram que os vermes preparados continham significativamente mais embriões do que seus homólogos ingênuos, indicando maior aptidão em face da infecção.Fiji ImageJ foi usado para determinar a carga de parasitas de vermes ingênuos e imunes individuais, que é a porcentagem do corpo preenchido com esporos fluorescentes n.parisii. Quantificações revelaram uma redução dramática da carga de parasitas de vermes que vieram de pais infectados. Além disso, os cálculos do tamanho individual do verme revelaram que os vermes preparados tinham uma vantagem significativa de crescimento sobre animais ingênuos em face da infecção por N.parisii.Estudos de imagem revelaram que, embora animais ingênuos tipicamente contiveam múltiplos esporos e várias células infectadas, os animais preparados tinham muito menos ou nenhum esporos e normalmente não havia esporosmas. Se populações de F1 não primed e primed têm números semelhantes de animais gravid e infectados, conte o número de ovos por animal, e analise tecido infectado com ImageJ para encontrar diferenças mais sutis. Enquanto o amarelo direto 96 manchas maduras esporos, fluorescência in situ hibridização pode revelar esporosmas dentro das células.Isso pode mostrar o número de células infectadas em vermes preparados e não-primitivos. Essas técnicas mostraram que a resposta transcricional dos pais pode ser fundamental para induzir a imunidade herdada na prole. Pesquisadores estão investigando a natureza dessa imunidade na prole.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

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Trichuris Muris Infecção: Um Modelo de imunidade do tipo 2 e inflamação no intestino

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Imunologia e Infecção

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

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Seleção de Plasmodium falciparum Parasitas para Cytoadhesion para células do cérebro humano endotelial

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

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Um fluxo de Adesão Ensaio para o Estudo de Recrutamento de leucócitos para hepáticas humanas senoidais endotélio sob condições de estresse de cisalhamento

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Um protocolo para infectar<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Com<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Isolamento de neutrófilos e análise para determinar seu papel na linfoma sensibilidade das células a agentes terapêuticos

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Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

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Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Aplicando Transferência de ressonância de fluorescência Energia (FRET) para examinar Eficiência Effector translocação pela<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA silenciamento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

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Modelos de mouse da infecção por Helicobacter e patologias gástricas

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

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Avaliando virulência e patogênese da infecção por Aeromonas em um modelo de Caenorhabditis elegans

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

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O modelo de infecção Waxworm Galleria mellonella para candidíase disseminada

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...