Name: studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

Мы благодарны Винни Чжао и Инь Чэнь Вану за полезные комментарии к рукописи. Эта работа была поддержана Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (грант No 522691522691).

В настоящем исследовании используется штамм C. elegans Bristol N2 дикого типа, выращенный при 21 °C.
1. Подготовка СМИ
<ol><li>Подготовка носителей M9 в соответствии с предыдущим отчетом21,22.</li>
	<li>Подготовьте питательную среду нематоды (NGM), ?...

<ol>
	<li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates:+current+knowledge+and+future+prospects.">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).</li><li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome.">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li><li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics:+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model.">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li><li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+worm:+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity.">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li><li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+your+enemies:+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans.">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection.">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741 (2020).</li><li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+microsporidia:+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites.">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).</li><li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+host+cells+by+microsporidia.">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).</li><li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion,+proliferation+and+exit.">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).</li><li>Balla, K. M., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection.">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).</li><li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+discreet+escape:+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li><li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia.">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li><li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins.">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023 (2017).</li><li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans.">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).</li><li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans.">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring.">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans.">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458 (2022).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic,+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).</li><li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host.">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Rivera, D. E., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines.">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes.">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).</li><li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans.">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).</li><li>Troemel, E. R., F&#233;lix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barri&#232;re, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309 (2008).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved,+stress-specific,+and+have+deleterious+trade-offs.">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425 (2021).</li><li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery.">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).</li><li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube.">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li></ol>

Настоящий протокол описывает изучение микроспоридии и наследственного иммунитета в простой и генетически поддающейся лечению модели инфекции N. parisii -C. elegans .
Подготовка спор представляет собой интенсивный протокол, который обычно дает достаточно спор в течени...

Наследственный иммунитет является эпигенетическим явлением, при котором родительское воздействие патогенов может обеспечить производство устойчивого к инфекции потомства. Этот тип иммунной памяти был показан у многих беспозвоночных, у которых отсутствует адаптивная иммунная система и которые могут защитить от вирусных, бактериальных и грибковых заболеваний1. В то время как унаследованный иммунитет имеет важные последствия для понимания как здоровья, так и эволюции, молекулярные механизмы, лежащие в основе этой защиты, в значительной степени неизвестны. Отчасти это связано с тем, что многие животные, у которых был описан унаследованный иммунитет, не являются установленными модельными организмами для исследований. Напротив, исследования прозрачной нематоды Caenorhabditis elegans извлекают выгоду из обширного генетического и биохимического инструментария 2,3, высоко аннотированного генома 4,5 и короткого времени генерации. Действительно, исследования c. elegans позволили добиться фундаментальных успехов в области эпигенетики и врожденного иммунитета 6,7, и в настоящее время это установленная модель для изучения иммунной памяти 8,9.
Микроспоридия являются грибковыми патогенами, которые заражают почти всех животных и вызывают смертельные инфекции у людей с ослабленным иммунитетом10. Инфекция начинается, когда спора микроспоридии вводит или «запускает» свое клеточное содержимое (спороплазму) в клетку-хозяина, используя структуру, называемую полярной трубкой. Внутриклеточная репликация паразита приводит к образованию меронтов, которые в конечном итоге дифференцируются в зрелые споры, которые могут выходить из клетки11,12. Хотя эти паразиты наносят ущерб как здоровью человека, так и продовольственной безопасности, еще многое предстоит узнать об их биологии инфекции12. Nematocida parisii – это естественный микроспоридиальный паразит, который реплицируется исключительно в кишечных клетках червей, что приводит к снижению плодовитости и, в конечном счете, гибели. Модель инфекции N. parisii -C. elegans была использована, чтобы показать: (1) роль аутофагии в клиренсе патогена13, (2) как микроспоридия может выходить из инфицированных клеток нелитически14, (3) как патогены могут распространяться от клетки к клетке, образуя синцитию15, (4) белки, используемые N. parisii для взаимодействия со своим хозяином16, и (5) регуляцию транскрипционного внутриклеточного ответа патогена (IPR)17, 18.
Протоколы заражения C. elegans описаны в текущей работе и могут быть использованы для выявления уникальной биологии микроспоридии и препарирования реакции хозяина на инфекцию. Микроскопия неподвижных червей, окрашенных хитин-связывающим красителем Direct Yellow 96 (DY96), показывает распространение инфекции хитинсодержащими спорами микроспоридий по всему кишечнику. Окрашивание DY96 также позволяет визуализировать хитинсодержащие эмбрионы червей для одновременной оценки гравидности червя (способности производить эмбрионы) в качестве считывания пригодности хозяина.
Недавняя работа показала, что C. elegans , инфицированные N. parisii , производят потомство, которое устойчиво устойчиво к той же инфекции19. Этот унаследованный иммунитет длится одно поколение и зависит от дозы, так как потомство от более сильно инфицированных родителей более устойчиво к микроспоридиям. Интересно, что потомство N. parisii-primed также более устойчиво к бактериальному кишечному патогену Pseudomonas aeruginosa, хотя они не защищены от естественного патогена вируса Orsay19. Настоящая работа также показывает, что иммунно-праймированное потомство ограничивает инвазию клеток хозяина микроспоридиями. Метод также описывает сбор иммунно-праймированного потомства и то, как FISH может быть использован для обнаружения N. parisii RNA в клетках кишечника для анализа инвазии клеток хозяина и сжигания спор20.
Вместе эти протоколы обеспечивают прочную основу для изучения микроспоридии и наследственного иммунитета у C. elegans. Есть надежда, что будущая работа в этой модельной системе позволит сделать важные открытия в зарождающейся области унаследованного иммунитета. Эти методы также, вероятно, станут отправными точками для исследования наследственного иммунитета, вызванного микроспоридией, у других организмов-хозяев.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mm zirconia beads</td>
			<td>Biospec Products Inc.</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9FB893150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DRM600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Yellow 96</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S472409-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical rotor</td>
			<td>Thermo Sceintific</td>
			<td>415110 / 1834090806873</td>
			<td>Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB FISH probe</td>
			<td>Biosearch Technologies Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5&#39; modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Wild-type, Bristol strain</td>
			<td>Default strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (5 N)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>FLSS256500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution (6%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield + A16</td>
			<td>Biolynx</td>
			<td>VECTH1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection

Наследственный иммунитет описывает, как некоторые животные могут передать «память» о предыдущей инфекции своему потомству. Это может повысить устойчивость патогенов в их потомстве и способствовать выживанию. В то время как наследственный иммунитет был зарегистрирован у многих беспозвоночных, механизмы, лежащие в основе этого эпигенетического явления, в значительной степени неизвестны. Заражение Caenorhabditis elegans естественным микроспоридиевым патогеном Nematocida parisii приводит к тому, что черви производят потомство, которое устойчиво устойчиво к микроспоридиям. Настоящий протокол описывает изучение межпоколенческого иммунитета в простой и генетически поддающейся лечению модели инфекции N. parisii -C. elegans . В настоящей статье описаны методы заражения C. elegans и получения иммуно-праймированного потомства. Также приведены методы анализа устойчивости к микроспоридиозной инфекции путем окрашивания на микроспоридию и визуализации инфекции с помощью микроскопии. В частности, унаследованный иммунитет предотвращает инвазию клеток-хозяев микроспоридиями, а флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) может быть использована для количественной оценки событий инвазии. Относительное количество спор микроспоридии, продуцируемых в иммунно-праймированном потомстве, может быть количественно определено путем окрашивания спор хитин-связывающим красителем. На сегодняшний день эти методы пролили свет на кинетику и патогенную специфичность унаследованного иммунитета, а также на молекулярные механизмы, лежащие в его основе. Эти методы, наряду с обширными инструментами, доступными для исследований C. elegans , позволят сделать важные открытия в области унаследованного иммунитета.

В настоящем исследовании родительские популяции C. elegans (P0) были инфицированы на стадии L1 низкой дозой спор N. parisii . Эти инфекционные состояния обычно используются для получения большого количества микроспоридиа-резистентного потомства F1 путем отбеливания родителей. Инфициро?...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Заражение Caenorhabditis elegans микроспоридийным паразитом Nematocida parisii позволяет червям производить потомство, которое обладает высокой устойчивостью к одному и тому же патогену. Это пример унаследованного иммунитета, плохо изученного эпигенетического явления. Настоящий протокол описывает изучение унаследованного иммунитета в генетически податливой модели червя.

Изучение наследственного иммунитета в модели caenorhabditis elegans инфекции microsporidia

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Эти протоколы позволяют изучать наследственный иммунитет к микроспоридиям. Методы, описанные здесь, могут помочь нам понять, как иммунитет передается через поколения и молекулы, определяющие иммунитет к микроспоридиям у потомства. C.elegans - это простая и генетически поддающаяся лечению модель с коротким временем генерации для анализа наследования.Многие инструменты, доступные для червя, могут быть использованы для раскрытия молекулярных механизмов межпоколенческого иммунитета. При заражении животных P0 используйте низкую дозу спор, которая существенно не влияет на способность родителя производить потомство. Это гарантирует, что отбеливание дает достаточное количество животных F1 для последующих экспериментов Чтобы начать, переместите необходимое количество 10-сантиметровых несеянных пластин среды роста нематоды от четырех градусов Цельсия до комнатной температуры за день до запланированных инфекций.Непосредственно перед заражением гранулируют примерно 2 500 синхронизированных червей L1 в микрофьюжную трубку в 1 400 раз G в течение 30 секунд. Удалите супернатант кончиком пипетки, чтобы оставить червей в 50 микролитрах среды M9. Добавьте один миллилитр 10X штамма Escherichia coli OP50 к 1-ступенчатым червям и споры N.parisii до нужной концентрации.В качестве неинфицированного контроля готовят эквивалентную трубку L1s и OP50 с объемом среды M9, эквивалентным объему используемого спорового препарата. Смешайте образец червя L1, кратковременно вихрев и нанесите пластину выше одного миллилитра червей на 10-сантиметровую несеянную пластину среды роста нематоды. Закрутите, чтобы жидкость растеклась по всей тарелке.Высушите пластины в чистом шкафу со снятыми крышками в течение 10-20 минут или до полного высыхания перед инкубацией при 21 градусе Цельсия в течение 72 часов. Через 72 часа после заражения исследуйте пластины под рассекающим микроскопом. Пластина с инфицированными червями должна содержать меньше эмбрионов, чем пластины с неинфицированными червями.Затем смойте червей с пластин в микроцентрифужную трубку, используя один миллилитр среды M9. Если на пластинах остается много червей, гранулируйте червей центрифугированием в 1400 раз G в течение 30 секунд. Удалите супернатант и выполните дополнительные промывки пластин.Центрифугу при 1400 раз G в течение 30 секунд при комнатной температуре гранулируют червей и дважды промывают одним миллилитром среды M9 или до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным. Повторно суспендируйте его в конечном объеме в один миллилитр среды M9 и хорошо перемешайте путем пипетирования. Переложите 100 микролитров взвешенных червей в свежую трубку и отбелите оставшиеся 900 микролитров, чтобы вскрыть взрослых червей и выпустить эмбрионы F1 для тестирования.Выполняйте инфекции с модификациями. как указано в рукописи. Через 72 часа после заражения исследуйте пластины под рассекающим микроскопом.Пластина с наивными червями должна быть меньше и содержать меньше эмбрионов, чем пластины с праймированными червями. Затем начните процесс окрашивания и фиксации червей, смыв их с пластин в микроцентрифужную трубку, используя один миллилитр 0,1% Tween 20 в среде M9. Если на пластинах остается много червей, гранулируйте червей центрифугированием в 1, 400 раз G в течение 30 секунд при комнатной температуре, удалите супернатант с помощью наконечника пипетки и выполните дополнительные промывки пластин.После гранулирования червей центрифугированием в течение 30 секунд при 1, 400 раз G при комнатной температуре дважды промыть одним миллилитрами среды M9, содержащей 0,1% Tween 20 или до тех пор, пока супернатант не станет прозрачным. Удалите супернатант, добавьте 700 микролитров ацетона и оставьте червей зафиксировать при комнатной температуре на 10 минут. Гранулируют этих неподвижных червей в течение 30 секунд при 10 000 G при комнатной температуре и дают две промывки одного миллилитра фосфатного буферного физиологического раствора, содержащего 0,1% Tween 20.Подготовьте 50 миллилитров рабочего раствора DY96, заверните контейнер в фольгу и храните его в ящике, чтобы предотвратить воздействие света. Добавьте 500 микролитров рабочего раствора DY96 к червячной грануле и вращайте в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Центрифугируйте эту реакцию в течение 30 секунд при 10 000 G при комнатной температуре, чтобы гранулировать червей и удалить супернатант.Затем добавьте 15 микролитров монтажного носителя с DAPI или без него. Пипетка 10 микролитров этих окрашенных червей на предметное стекло микроскопа и поместите крышку сверху. Чтобы проанализировать окрашенных DY96 червей, установленных на слайдах, выполните визуализацию с использованием канала GFP флуоресцентного микроскопа.Чтобы определить пригодность популяций червей, используйте объектив 5X или 10X для анализа серьезности более 100 червей на состояние. Через 72 часа после заражения животных F1 фиксировали и окрашивали DY96 для оценки устойчивости к микроспоридиям. Инфицированные родительские популяции и неинфицированные контрольные группы были зафиксированы через 72 часа после заражения и окрашены DY96 для визуализации эмбрионов червей и спор микроспоридии.Инфицированные животные маленькие, содержат много спор микроспоридий и производят меньше эмбрионов, чем здоровые, неинфицированные контрольные группы. Оценка червячности показала, что примерно 95% неинфицированных животных произвели потомство, по сравнению с инфицированными животными, которые были менее 80% Количественные оценки показали, что примерно 90% популяции, обработанной микроспоридиями, были инфицированы, что определяется количеством червей, содержащих споры, окрашенные DY96. Количественная оценка этих фиксированных животных показала, что праймированные черви содержали значительно больше эмбрионов, чем их наивные собратья, что указывает на большую приспособленность перед лицом инфекции.Fiji ImageJ был использован для определения паразитарной нагрузки отдельных наивных и иммунных червей, которая представляет собой процент тела, заполненного флуоресцентными спорами N.parisii. Количественные оценки показали резкое снижение паразитарного бремени червей, которые пришли от инфицированных родителей. Кроме того, расчеты размера отдельных червей показали, что праймированные черви имели значительное преимущество в росте перед наивными животными перед лицом инфекции N.parisii.Исследования изображений показали, что в то время как наивные животные обычно содержали несколько спор и несколько инфицированных клеток, у праймированных животных было гораздо меньше или вообще не было спор и, как правило, не было спороплазм. Если незагрунтованные и праймированные популяции F1 имеют одинаковое количество гравидных и инфицированных животных, подсчитайте количество яиц на животное и проанализируйте инфицированную ткань с помощью ImageJ, чтобы найти более тонкие различия. В то время как прямые желтые 96 пятен созревают спорами, флуоресцентная гибридизация in situ может выявить спороплазмы внутри клеток.Это может показать вам количество инфицированных клеток у праймированных и незагрунтованных червей. Эти методы показали, что родительский транскрипционный ответ может играть важную роль в индуцировании наследственного иммунитета у потомства. В настоящее время исследователи исследуют природу этого иммунитета у потомства.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Инфекция: Модель Тип 2 иммунитет и воспаление в кишечнике

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Выбор Plasmodium тропической Паразиты для Cytoadhesion для мозга человека эндотелиальных клеток

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Расход Адгезия Анализ по изучению лейкоцитов набора на человека печеночных синусоидальных эндотелия в условиях напряжения сдвига

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Протокол заразить<em&gt; Caenorhabditis Элеганс</em&gt; С<em&gt; Сальмонелла Typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Нейтрофильная Выделение и анализ для определения их роли в клеточной лимфомы чувствительность к терапевтических агентов

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Биолюминесценции визуализации для обнаружения поздней стадии инфекции африканского трипаносомоза

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Применение флуоресцентного резонанса переноса энергии (FRET) для изучения Эффектор транслокации эффективности путем<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Во время миРНК Глушащий

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Модели мыши инфекции Helicobacter и патологий желудка

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Оценки вирулентности и патогенез Aeromonas инфекции в Caenorhabditis elegans модели

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella Waxworm инфекции модель для распространения кандидоз

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...