Name: studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00
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Estamos agradecidos a Winnie Zhao y Yin Chen Wan por proporcionar comentarios útiles sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (Subvención # 522691522691).

El presente estudio utiliza la cepa N2 de C. elegans Bristol de tipo silvestre cultivada a 21 °C.
1. Preparación de los medios de comunicación
<ol><li>Preparar los medios M9 según el informe anterior21,22.</li>
	<li>Preparar el medio de crecimiento de nematodos (NGM) según el informe anterior21,22. Vierta 12 ml de NGM por placa de 6 cm o 30 ml p...

<ol>
	<li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates:+current+knowledge+and+future+prospects.">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).</li><li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome.">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li><li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics:+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model.">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li><li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+worm:+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity.">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li><li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+your+enemies:+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans.">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection.">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741 (2020).</li><li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+microsporidia:+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites.">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).</li><li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+host+cells+by+microsporidia.">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).</li><li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion,+proliferation+and+exit.">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).</li><li>Balla, K. M., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection.">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).</li><li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+discreet+escape:+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li><li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia.">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li><li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins.">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023 (2017).</li><li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans.">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).</li><li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans.">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring.">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans.">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458 (2022).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic,+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).</li><li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host.">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Rivera, D. E., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines.">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes.">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).</li><li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans.">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).</li><li>Troemel, E. R., F&#233;lix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barri&#232;re, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309 (2008).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved,+stress-specific,+and+have+deleterious+trade-offs.">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425 (2021).</li><li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery.">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).</li><li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube.">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li></ol>

El presente protocolo describe el estudio de los microsporidios y la inmunidad hereditaria en un modelo de infección por N. parisii -C. elegans simple y genéticamente tratable.
La preparación de esporas es un protocolo intensivo que generalmente produce suficientes esporas para 6 meses de experimentos, dependiendo de la productividad24. Es importante destacar que se debe determinar la infectividad para cada nuevo "lote" de esporas antes de usarlo pa...

La inmunidad hereditaria es un fenómeno epigenético por el cual la exposición de los padres a patógenos puede permitir la producción de descendencia resistente a las infecciones. Este tipo de memoria inmune se ha demostrado en muchos invertebrados que carecen de sistemas inmunes adaptativos y pueden proteger contra enfermedades virales, bacterianas yfúngicas 1. Si bien la inmunidad hereditaria tiene implicaciones importantes para comprender tanto la salud como la evolución, los mecanismos moleculares subyacentes a esta protección son en gran parte desconocidos. Esto se debe en parte a que muchos de los animales en los que se ha descrito la inmunidad heredada no son organismos modelo establecidos para la investigación. Por el contrario, los estudios en el nematodo transparente Caenorhabditis elegans se benefician de un extenso conjunto de herramientas genéticas y bioquímicas 2,3, un genoma altamente anotado 4,5 y un corto tiempo de generación. De hecho, la investigación en C. elegans ha permitido avances fundamentales en los campos de la epigenética y la inmunidad innata 6,7, y ahora es un modelo establecido para estudiar la memoria inmune 8,9.
Los microsporidios son patógenos fúngicos que infectan a casi todos los animales y causan infecciones letales en humanos inmunocomprometidos10. La infección comienza cuando una espora de microsporidios inyecta o "dispara" su contenido celular (esporoplasma) en una célula huésped utilizando una estructura llamada tubo polar. La replicación intracelular del parásito da como resultado la formación de merontes, que finalmente se diferencian en esporas maduras que pueden salir de la célula11,12. Si bien estos parásitos son perjudiciales tanto para la salud humana como para la seguridad alimentaria, aún queda mucho por aprender sobre su biología de la infección12. Nematocida parisii es un parásito microsporidio natural que se replica exclusivamente en las células intestinales de los gusanos, lo que resulta en una fecundidad reducida y, en última instancia, la muerte. El modelo de infección por N. parisii -C. elegans se ha utilizado para mostrar: (1) el papel de la autofagia en la eliminación de patógenos13, (2) cómo los microsporidios pueden salir de las células infectadas de forma no lítica14, (3) cómo los patógenos pueden propagarse de célula a célula mediante la formación de sincitia15, (4) las proteínas que N. parisii utiliza para interactuar con su huésped16, y (5) la regulación de la respuesta intracelular transcripcional del patógeno (IPR)17, 18.
Los protocolos para la infección de C. elegans se describen en el trabajo actual y se pueden utilizar para revelar la biología única de los microsporidios y diseccionar la respuesta del huésped a la infección. La microscopía de gusanos fijos teñidos con el tinte de unión a quitina Direct Yellow 96 (DY96) muestra la propagación de la infección de esporas de microsporidios que contienen quitina por todo el intestino. La tinción DY96 también permite la visualización de embriones de gusanos que contienen quitina para la evaluación simultánea de la gravedad del gusano (capacidad de producir embriones) como una lectura de la aptitud del huésped.
Trabajos recientes han revelado que C. elegans infectados con N. parisii producen descendencia que es robustamente resistente a la misma infección19. Esta inmunidad hereditaria dura una sola generación y depende de la dosis, ya que los hijos de padres más infectados son más resistentes a los microsporidios. Curiosamente, las crías preparadas con N. parisii también son más resistentes al patógeno intestinal bacteriano Pseudomonas aeruginosa, aunque no están protegidas contra el patógeno natural Virus Orsay19. El presente trabajo también muestra que la descendencia inmunoprimida limita la invasión de células huésped por microsporidios. El método también describe la colección de descendientes inmuno-cebados y cómo FISH se puede utilizar para detectar el ARN de N. parisii en las células intestinales para evaluar la invasión de la célula huésped y la activación de esporas20.
Juntos, estos protocolos proporcionan una base sólida para estudiar los microsporidios y la inmunidad hereditaria en C. elegans. Se espera que el trabajo futuro en este sistema modelo permita descubrimientos importantes en el campo naciente de la inmunidad heredada. También es probable que estas técnicas sean puntos de partida para investigar la inmunidad hereditaria inducida por microsporidios en otros organismos huéspedes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mm zirconia beads</td>
			<td>Biospec Products Inc.</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9FB893150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DRM600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Yellow 96</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S472409-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical rotor</td>
			<td>Thermo Sceintific</td>
			<td>415110 / 1834090806873</td>
			<td>Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB FISH probe</td>
			<td>Biosearch Technologies Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5&#39; modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Wild-type, Bristol strain</td>
			<td>Default strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (5 N)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>FLSS256500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution (6%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield + A16</td>
			<td>Biolynx</td>
			<td>VECTH1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection

La inmunidad hereditaria describe cómo algunos animales pueden transmitir el "recuerdo" de una infección previa a su descendencia. Esto puede aumentar la resistencia de los patógenos en su progenie y promover la supervivencia. Si bien se ha reportado inmunidad hereditaria en muchos invertebrados, los mecanismos subyacentes a este fenómeno epigenético son en gran parte desconocidos. La infección de Caenorhabditis elegans por el patógeno microsporidio natural Nematocida parisii da como resultado que los gusanos produzcan descendencia que es robustamente resistente a los microsporidios. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad intergeneracional en el modelo de infección simple y genéticamente tratable de N. parisii -C. elegans . El artículo actual describe métodos para infectar a C. elegans y generar descendencia inmuno-preparada. También se proporcionan métodos para evaluar la resistencia a la infección por microsporidios mediante la tinción de microsporidios y la visualización de la infección por microscopía. En particular, la inmunidad hereditaria previene la invasión de células huésped por microsporidios, y la hibridación fluorescente in situ (FISH) se puede utilizar para cuantificar los eventos de invasión. La cantidad relativa de esporas de microsporidios producidas en la descendencia inmunoprimida se puede cuantificar tiñendo las esporas con un tinte de unión a la quitina. Hasta la fecha, estos métodos han arrojado luz sobre la cinética y la especificidad del patógeno de la inmunidad hereditaria, así como los mecanismos moleculares subyacentes a ella. Estas técnicas, junto con las amplias herramientas disponibles para la investigación de C. elegans, permitirán importantes descubrimientos en el campo de la inmunidad hereditaria.

En el presente estudio, las poblaciones parentales de C. elegans (P0) se infectaron en la etapa L1 con una dosis baja de esporas de N. parisii . Estas condiciones de infección se utilizan típicamente para obtener un alto número de progenie F1 resistente a microsporidios a través del blanqueamiento de los padres. Las poblaciones parentales infectadas y los controles no infectados se fijaron en 72 hpi y se tiñeron con DY96 para visualizar los embriones de gusano y las esporas de microsporidios (<stro...

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Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

La infección de Caenorhabditis elegans por el parásito microsporidio Nematocida parisii permite a los gusanos producir descendencia que es altamente resistente al mismo patógeno. Este es un ejemplo de inmunidad hereditaria, un fenómeno epigenético poco conocido. El presente protocolo describe el estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de gusano genéticamente tratable.

Estudio de la inmunidad hereditaria en un modelo de Caenorhabditis elegans de infección por microsporidios

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Estos protocolos permiten el estudio de la inmunidad hereditaria a los microsporidios. Las técnicas explicadas aquí pueden ayudarnos a comprender cómo se transmite la inmunidad a través de las generaciones y las moléculas que determinan la inmunidad a los microsporidios en la descendencia. C.elegans es un modelo simple y genéticamente tratable con un corto tiempo de generación para el ensayo de la herencia.Las muchas herramientas disponibles para el gusano se pueden utilizar para descubrir los mecanismos moleculares de la inmunidad intergeneracional. Al infectar animales P0, use una dosis baja de esporas que no afecte significativamente la capacidad de los padres para producir progenie. Esto asegura que el blanqueamiento produzca suficientes animales F1 para experimentos aguas abajo Para comenzar, mueva el número requerido de placas de medio de crecimiento de nematodos no sembrados de 10 centímetros de cuatro grados Celsius a temperatura ambiente un día antes de las infecciones planificadas.Justo antes de la infección, peletizar aproximadamente 2, 500 gusanos L1 sincronizados en un tubo de microfuge a 1, 400 veces G durante 30 segundos. Retire el sobrenadante con una punta de pipeta para dejar gusanos en 50 microlitros de medios M9. Agregue un mililitro de la cepa OP50 de Escherichia coli 10X a los gusanos de 1 etapa y las esporas de N.parisii a la concentración deseada.Como control no infectado, prepare un tubo equivalente de L1 y OP50 con un volumen de medios M9 equivalente al volumen de preparación de esporas utilizado. Mezcle la muestra de gusano L1 vórtice brevemente y placa por encima de un mililitro de gusanos en una placa mediana de crecimiento de nematodos sin semilla de 10 centímetros. Gire para asegurar que el líquido se extienda por toda la placa.Seque las placas en un gabinete limpio con las tapas apagadas durante 10 a 20 minutos o hasta que se sequen completamente antes de incubar a 21 grados centígrados durante 72 horas. A las 72 horas después de la infección, examine las placas bajo el microscopio de disección. La placa con gusanos infectados debe contener menos embriones que las placas con gusanos no infectados.Luego lave los gusanos de las placas en un tubo de microcentrífuga con un medio M9 de mililitros. Si quedan muchos gusanos en las placas, peletizar los gusanos por centrifugación a 1400 veces G durante 30 segundos. Retire el sobrenadante y realice lavados de placas adicionales.Centrifugar a 1400 veces G durante 30 segundos a temperatura ambiente para granular los gusanos y lavar dos veces con un mililitro de medios M9 o hasta que el sobrenadante esté despejado. Vuelva a suspenderlo en un volumen final de un mililitro de medios M9 y mezcle bien mediante pipeteo. Transfiera 100 microlitros de los gusanos suspendidos a un tubo fresco y blanquee los 900 microlitros restantes para abrir los gusanos adultos y liberar embriones F1 para su análisis.Realizar infecciones con modificaciones. como se menciona en el manuscrito. A las 72 horas después de la infección, examine las placas bajo un microscopio de disección.La placa con gusanos ingenuos debe ser más pequeña y contener menos embriones que las placas con gusanos cebados. Luego, comience el proceso de tinción y fijación de gusanos lavándolos de las placas en un tubo de microcentrífuga usando un mililitro de 0.1% Tween 20 en medios M9. Si quedan muchos gusanos en las placas, peletice los gusanos por centrifugación a 1, 400 veces G durante 30 segundos a temperatura ambiente, retire el sobrenadante con una punta de pipeta y realice lavados de placa adicionales.Después de peletizar los gusanos centrifugando durante 30 segundos a 1, 400 veces G a temperatura ambiente, lavar dos veces con un mililitro de medios M9 que contengan 0.1% Tween 20 o hasta que el sobrenadante esté claro. Retire el sobrenadante, agregue 700 microlitros de acetona y deje que los gusanos se fijen a temperatura ambiente durante 10 minutos. Peletizar estos gusanos fijos durante 30 segundos a 10, 000 veces G a temperatura ambiente y dar dos lavados de un mililitro de solución salina tampón de fosfato que contiene 0.1% Tween 20.Prepare 50 mililitros de solución de trabajo DY96, envuelva el recipiente en papel de aluminio y guárdelo en un cajón para evitar la exposición a la luz. Agregue 500 microlitros de solución de trabajo DY96 al pellet de gusano y gire durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Centrifugar esta reacción durante 30 segundos a 10, 000 veces G a temperatura ambiente para granular los gusanos y eliminar el sobrenadante.Luego, agregue 15 microlitros del medio de montaje con o sin DAPI. Pipetee 10 microlitros de estos gusanos teñidos en un portaobjetos de microscopio y coloque un resbalón de cubierta sobre la parte superior. Para analizar los gusanos teñidos con DY96 montados en portaobjetos, realice imágenes utilizando el canal GFP de un microscopio de fluorescencia.Para determinar la aptitud de las poblaciones de gusanos, use un objetivo 5X o 10X para evaluar la gravedad de más de 100 gusanos por condición. A las 72 horas después de la infección, los animales F1 fueron fijados y teñidos con DY96 para evaluar la resistencia a los microsporidios. Las poblaciones parentales infectadas y los controles no infectados se fijaron a las 72 horas posteriores a la infección y se tiñeron con DY96 para visualizar los embriones de gusano y las esporas de microsporidios.Los animales infectados son pequeños, contienen muchas esporas de microsporidios y producen menos embriones que los controles sanos y no infectados. La evaluación de la gravedad del gusano mostró que aproximadamente el 95% de los animales no infectados produjeron descendencia, en comparación con los animales infectados, que eran menos del 80%Las cuantificaciones revelaron que aproximadamente el 90% de la población tratada con microsporidios estaba infectada, según lo determinado por el número de gusanos que contenían esporas teñidas con DY96. Las cuantificaciones de estos animales fijos revelaron que los gusanos cebados contenían significativamente más embriones que sus contrapartes ingenuas, lo que indica una mayor aptitud frente a la infección.Fiji ImageJ se utilizó para determinar la carga de parásitos de gusanos individuales ingenuos e inmunes, que es el porcentaje del cuerpo lleno de esporas fluorescentes de N.parisii. Las cuantificaciones revelaron una reducción dramática en la carga de parásitos de los gusanos que provenían de padres infectados. Además, los cálculos del tamaño individual del gusano revelaron que los gusanos cebados tenían una ventaja de crecimiento significativa sobre los animales ingenuos frente a la infección por N.parisii.Los estudios de imágenes revelaron que, si bien los animales ingenuos generalmente contenían múltiples esporas y varias células infectadas, los animales preparados tenían muchas menos o ninguna espora y, por lo general, no tenían esporoplasmas. Si las poblaciones de F1 no cebadas y cebadas tienen un número similar de animales grávidos e infectados, cuente el número de huevos por animal y analice el tejido infectado con ImageJ para encontrar diferencias más sutiles. Mientras que el amarillo directo 96 tiñe esporas maduras, la hibridación fluorescente in situ puede revelar esporoplasmas dentro de las células.Esto puede mostrarle el número de células infectadas en gusanos cebados y no cebados. Estas técnicas han demostrado que la respuesta transcripcional de los padres puede ser instrumental en la inducción de la inmunidad hereditaria en la descendencia. Los investigadores ahora están investigando la naturaleza de esta inmunidad en la descendencia.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

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Investigación

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