Name: studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection
Uploaded: 2022-04-06T14:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

Vi är tacksamma för Winnie Zhao och Yin Chen Wan för att ge användbara kommentarer till manuskriptet. Detta arbete stöddes av Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).

Den föreliggande studien använder vildtyp C. elegans Bristol stam N2 odlad vid 21 ° C.
1. Förberedelse av media
<ol><li>Förbered M9-media enligt tidigare rapport 21,22.</li>
	<li>Förbered nematodtillväxtmedium (NGM) enligt tidigare rapport 21,22. Häll 12 ml NGM per 6 cm platta eller 30 ml per 10 cm platta.</li>
	<li>Förbered Escherichia ...

<ol>
	<li>Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-generational+immune+priming+in+invertebrates:+current+knowledge+and+future+prospects.">Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).</li><li>Au, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+methodology+for+the+generation+of+knockout+deletions+in+Caenorhabditis+elegans.">CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).</li><li>Kamath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans.">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li><li>The C. elegans Sequencing Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans:+a+platform+for+investigating+biology.">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li><li>Yoshimura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recompleting+the+Caenorhabditis+elegans+genome.">Recompleting the Caenorhabditis elegans genome.</a> Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).</li><li>Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+as+an+emerging+model+system+in+environmental+epigenetics:+C.+elegans+as+an+environmental+epigenetics+model.">Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model.</a> Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).</li><li>Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+the+worm:+the+C.+elegans+model+for+innate+immunity.">Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity.</a> Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).</li><li>Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remembering+your+enemies:+mechanisms+of+within-generation+and+multigenerational+immune+priming+in+Caenorhabditis+elegans.">Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans.</a> TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine+synthases+CYSL-1+and+CYSL-2+mediate+C.+elegans+heritable+adaptation+to+P.+vranovensis+infection.">Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection.</a> Nature Communications. 11, 1741 (2020).</li><li>Wadi, L., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+microsporidia:+an+extremely+successful+group+of+eukaryotic+intracellular+parasites.">Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).</li><li>Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+host+cells+by+microsporidia.">Invasion of host cells by microsporidia.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).</li><li>Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+host-microsporidia+interactions+during+invasion,+proliferation+and+exit.">The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit.</a> Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).</li><li>Balla, K. M., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+variation+in+the+roles+of+C.+elegans+autophagy+components+during+microsporidia+infection.">Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection.</a> PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).</li><li>Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+discreet+escape:+Microsporidia+reorganize+host+cytoskeleton+prior+to+non-lytic+exit+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells.</a> Worm. 1 (4), 207-211 (2012).</li><li>Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+of+microsporidia+causes+Caenorhabditis+elegans+organs+to+form+syncytia.">Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia.</a> Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).</li><li>Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+microsporidia+host-exposed+proteins+reveals+a+repertoire+of+rapidly+evolving+proteins.">Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins.</a> Nature Communications. 8, 14023 (2017).</li><li>Bakowski, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin-mediated+response+to+microsporidia+and+virus+infection+in+C.+elegans.">Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans.</a> PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).</li><li>Reddy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intracellular+pathogen+response+pathway+promotes+proteostasis+in+C.+elegans.">An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans.</a> Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).</li><li>Willis, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+parental+transcriptional+response+to+microsporidia+infection+induces+inherited+immunity+in+offspring.">A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring.</a> Science Advances. 7 (19), (2021).</li><li>Tamim El Jarkass, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intestinally+secreted+host+factor+promotes+microsporidia+invasion+of+C.+elegans.">An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans.</a> eLife. 11, 72458 (2022).</li><li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates.">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic,+actin-based+exit+of+intracellular+parasites+from+C.+elegans+intestinal+cells.">Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells.</a> PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).</li><li>Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+intracellular+development+relies+on+myc+interaction+network+transcription+factors+in+the+host.">Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host.</a> G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).</li><li>Corsi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Transparent+window+into+biology:+A+primer+on+Caenorhabditis+elegans.">A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans.</a> WormBook. , 1-31 (2015).</li><li>Rivera, D. E., La&#382;eti&#263;, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+fluorescence+in+situ+hybridization+(FISH)+to+visualize+microbial+colonization+and+infection+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestines.">RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+collection+of+novel+nematode-infecting+microsporidia+and+their+diverse+interactions+with+Caenorhabditis+elegans+and+other+related+nematodes.">A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes.</a> PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).</li><li>Luallen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+natural+microsporidian+pathogen+with+a+broad+tissue+tropism+in+Caenorhabditis+elegans.">Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).</li><li>Troemel, E. R., F&#233;lix, M. -. A., Whiteman, N. K., Barri&#232;re, A., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsporidia+are+natural+intracellular+parasites+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biology. 6, 309 (2008).</li><li>Burton, N. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+adaptations+to+stress+are+evolutionarily+conserved,+stress-specific,+and+have+deleterious+trade-offs.">Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs.</a> eLife. 10, 73425 (2021).</li><li>Jaroenlak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+organization+and+dynamics+of+the+microsporidian+polar+tube+invasion+machinery.">3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery.</a> PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).</li><li>Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-membrane+interaction+is+essential+to+normal+assembly+of+the+microsporidian+spore+invasion+tube.">Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube.</a> The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).</li></ol>

Det föreliggande protokollet beskriver studien av mikrosporidier och ärftlig immunitet i en enkel och genetiskt dragbar N. parisii -C. elegans infektionsmodell .
Sporberedning är ett intensivt protokoll som vanligtvis ger tillräckligt med sporer för 6 månaders experiment, beroende på produktivitet24. Viktigt är att smittsamheten måste bestämmas för varje nytt spore "parti" innan den används för experimenten. På grund av variationen i smit...

Ärftlig immunitet är ett epigenetiskt fenomen där föräldrarnas exponering för patogener kan möjliggöra produktion av infektionsresistenta avkommor. Denna typ av immunminne har visats hos många ryggradslösa djur som saknar adaptiva immunförsvar och kan skydda mot virus-, bakterie- och svampsjukdomar1. Medan ärftlig immunitet har viktiga konsekvenser för att förstå både hälsa och evolution, är de molekylära mekanismerna bakom detta skydd i stort sett okända. Detta beror delvis på att många av de djur där ärftlig immunitet har beskrivits inte är etablerade modellorganismer för forskning. Däremot drar studier i den transparenta nematoden Caenorhabditis elegans nytta av en omfattande genetisk och biokemisk verktygslåda 2,3, ett mycket kommenterat genom 4,5 och en kort generationstid. Faktum är att forskning i C. elegans har möjliggjort grundläggande framsteg inom områdena epigenetik och medfödd immunitet 6,7, och det är nu en etablerad modell för att studera immunminne 8,9.
Mikrosporidier är svamppatogener som infekterar nästan alla djur och orsakar dödliga infektioner hos immunförsvagade människor10. Infektion börjar när en mikrosporidispore injicerar eller "avfyrar" sitt cellulära innehåll (sporoplasm) i en värdcell med hjälp av en struktur som kallas ett polärt rör. Intracellulär replikation av parasiten resulterar i bildandet av meronter, som i slutändan differentieras till mogna sporer som kan lämna cellen11,12. Även om dessa parasiter är skadliga för både människors hälsa och livsmedelssäkerhet, finns det mycket kvar att lära sig om deras infektionsbiologi12. Nematocida parisii är en naturlig mikrosporidisk parasit som replikerar uteslutande i tarmcellerna hos maskar, vilket resulterar i minskad fecunditet och i slutändan döden. Infektionsmodellen N. parisii -C. elegans har använts för att visa: (1) autofagiens roll i patogenclearance13, (2) hur mikrosporidier kan lämna infekterade celler icke-lytiskt14, (3) hur patogener kan spridas från cell till cell genom att bilda syncytia15, (4) proteinerna N. parisii använder för att interagera med dess värd16, och (5) regleringen av det transkriptionella intracellulära patogensvaret (IPR)17, 18.
Protokoll för infektion av C. elegans beskrivs i det aktuella arbetet och kan användas för att avslöja den unika mikrosporidibiologin och dissekera värdens svar på infektion. Mikroskopin av fasta maskar färgade med det kitinbindande färgämnet Direct Yellow 96 (DY96) visar infektionsspridningen av kitinhaltiga mikrosporidier i hela tarmen. DY96-färgning möjliggör också visualisering av kitinhaltiga maskembryon för samtidig bedömning av maskens graviditet (förmåga att producera embryon) som en avläsning av värdkonditionen.
Nytt arbete har avslöjat att C. elegans infekterade med N. parisii producerar avkommor som är robust resistenta mot samma infektion19. Denna ärftliga immunitet varar en enda generation och är dosberoende, eftersom avkommor från mer infekterade föräldrar är mer resistenta mot mikrosporidier. Intressant nog är N. parisii-grundade avkommor också mer resistenta mot den bakteriella tarmpatogenen Pseudomonas aeruginosa, även om de inte är skyddade mot den naturliga patogenen Orsay-virus19. Det föreliggande arbetet visar också att immunprimerade avkommor begränsar värdcellsinvasion av mikrosporidier. Metoden beskriver också insamlingen av immunprimerade avkommor och hur FISH kan användas för att detektera N. parisii RNA i tarmceller för att analysera värdcellsinvasion och sporbränning20.
Tillsammans ger dessa protokoll en solid grund för att studera mikrosporidier och ärftlig immunitet i C. elegans. Förhoppningen är att framtida arbete i detta modellsystem kommer att möjliggöra viktiga upptäckter inom det framväxande området ärftlig immunitet. Dessa tekniker kommer sannolikt också att vara utgångspunkter för att undersöka mikrosporidiinducerad ärftlig immunitet hos andra värdorganismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2.0 mm zirconia beads</td>
			<td>Biospec Products Inc.</td>
			<td>11079124ZX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1482613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLSV025LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Imager 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench</td>
			<td>Baker</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V</td>
			<td>Global Industrial</td>
			<td>T9FB893150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DRM600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct Yellow 96</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S472409-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EverBrite Mounting Medium without DAPI</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>23002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/downloads</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mechanical rotor</td>
			<td>Thermo Sceintific</td>
			<td>415110 / 1834090806873</td>
			<td>Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroB FISH probe</td>
			<td>Biosearch Technologies Inc.</td>
			<td>-</td>
			<td>Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5&#39; modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2</td>
			<td>Wild-type, Bristol strain</td>
			<td>Default strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L3771-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (5 N)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>FLSS256500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite solution (6%)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SS290-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stemi 508 Stereo Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td>For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield + A16</td>
			<td>Biolynx</td>
			<td>VECTH1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

studying inherited immunity in a caenorhabditis elegans model of microsporidia infection

Ärftlig immunitet beskriver hur vissa djur kan vidarebefordra "minnet" av en tidigare infektion till sina avkommor. Detta kan öka patogenresistensen hos deras avkomma och främja överlevnad. Medan ärftlig immunitet har rapporterats hos många ryggradslösa djur, är mekanismerna bakom detta epigenetiska fenomen i stort sett okända. Infektionen av Caenorhabditis elegans av den naturliga mikrosporidiska patogenen Nematocida parisii resulterar i att maskarna producerar avkommor som är robust resistenta mot mikrosporidier. Det föreliggande protokollet beskriver studiet av immunitet mellan generationer i den enkla och genetiskt lätthanterliga N. parisii -C. elegans-infektionsmodellen . Den aktuella artikeln beskriver metoder för att infektera C. elegans och generera immunprimerade avkommor. Metoder ges också för att analysera resistens mot mikrosporidiinfektion genom färgning för mikrosporidier och visualisering av infektion genom mikroskopi. I synnerhet förhindrar ärftlig immunitet värdcellinvasion av mikrosporidier, och fluorescens in situ hybridisering (FISH) kan användas för att kvantifiera invasionshändelser. Den relativa mängden mikrosporidier som produceras i de immunprimerade avkommorna kan kvantifieras genom att färga sporerna med ett kitinbindande färgämne. Hittills har dessa metoder belyst kinetiken och patogenspecificiteten hos ärftlig immunitet, liksom de molekylära mekanismerna bakom den. Dessa tekniker, tillsammans med de omfattande verktyg som finns tillgängliga för C. elegans forskning, kommer att möjliggöra viktiga upptäckter inom ärftlig immunitet.

I den aktuella studien infekterades föräldrapopulationer av C. elegans (P0) i L1-stadiet med en låg dos av N. parisii-sporer . Dessa infektionsförhållanden används vanligtvis för att erhålla ett stort antal mikrosporidiresistenta F1-avkommor genom blekning av föräldrarna. Infekterade föräldrapopulationer och oinfekterade kontroller fixerades till 72 hpi och färgades med DY96 för att visualisera maskembryon och mikrosporidisporerna (Figur 1A). Infekterade djur ...

Watch this Scientific Journal Video about Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection at JoVE.com

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Infektionen av Caenorhabditis elegans av den mikrosporidiska parasiten Nematocida parisii gör det möjligt för maskarna att producera avkommor som är mycket resistenta mot samma patogen. Detta är ett exempel på ärftlig immunitet, ett dåligt förstått epigenetiskt fenomen. Det föreliggande protokollet beskriver studien av ärftlig immunitet i en genetiskt dragbar maskmodell.

Studera ärftlig immunitet i en Caenorhabditis elegans-modell av mikrosporidiinfektion

Inherited immunity describes how some animals can pass on the "memory" of a previous infection to their offspring. This can boost pathogen resistance in ...

Dessa protokoll möjliggör studier av ärftlig immunitet mot mikrosporidier. Tekniker som förklaras här kan hjälpa oss att förstå hur immunitet överförs över generationer och molekylerna bestämmer immunitet mot mikrosporidier hos avkommor. C.elegans är en enkel och genetiskt lätthanterlig modell med kort generationstid för att analysera arv.De många verktyg som finns tillgängliga för masken kan användas för att avslöja molekylära mekanismer för immunitet mellan generationer. Vid infektion av P0-djur, använd en låg spordos som inte signifikant påverkar förälderns förmåga att producera avkomma. Detta säkerställer att blekning ger tillräckligt med F1-djur för nedströms experiment För att börja, flytta det önskade antalet 10 centimeter oseedade nematodtillväxtmedelplattor från fyra grader Celsius till rumstemperatur en dag före planerade infektioner.Strax före infektionen pelleterade ner cirka 2 500 synkroniserade L1-maskar i ett mikrofugerör vid 1400 gånger G i 30 sekunder. Ta bort supernatanten med en pipettspets för att lämna maskar i 50 mikroliter M9-media. Tillsätt en milliliter 10X Escherichia coli-stam OP50 till 1-stegsmaskarna och N.parisii-sporer till önskad koncentration.Som en oinfekterad kontroll, förbered ett ekvivalent rör av L1s och OP50 med en volym M9-media som motsvarar volymen av sporberedning som används. Blanda L1-maskprovet genom att virvla kort och platta över en milliliter maskar på en 10-centimeter ogenerad nematodtillväxtmedelplatta. Virvla för att säkerställa att vätskan sprider sig över hela plattan.Torka plattorna i ett rent skåp med locken av i 10 till 20 minuter eller tills de är helt torra innan de inkuberar vid 21 grader Celsius i 72 timmar. Vid 72 timmar efter infektion, undersök plattorna under dissekeringsmikroskopet. Plattan med infekterade maskar bör innehålla färre embryon än plattorna med oinfekterade maskar.Tvätta sedan maskarna från plattorna i ett mikrocentrifugrör med ett milliliter M9-media. Om många maskar finns kvar på plattorna, pelletera maskarna genom centrifugering vid 1400 gånger G i 30 sekunder. Ta bort supernatanten och utför ytterligare platttvättar.Centrifug vid 1400 gånger G i 30 sekunder vid rumstemperatur för att pelletera maskarna och tvätta två gånger med en milliliter M9-media eller tills supernatanten är klar. Häng upp den igen i en slutlig volym på en milliliter M9-media och blanda väl genom pipettering. Överför 100 mikroliter av de suspenderade maskarna till ett nytt rör och blek de återstående 900 mikroliter för att bryta upp de vuxna maskarna och släppa F1-embryon för testning.Utför infektioner med modifieringar. som nämns i manuskriptet. Vid 72 timmar efter infektion, undersök plattorna under ett dissekerande mikroskop.Plattan med naiva maskar bör vara mindre och innehålla mindre embryon än plattorna med grundade maskar. Starta sedan färgnings- och fixeringsprocessen av maskar genom att tvätta dem från plattorna i ett mikrocentrifugrör med en milliliter 0,1% Tween 20 i M9-media. Om många maskar finns kvar på plattorna, pelletera maskarna genom centrifugering vid 1400 gånger G i 30 sekunder vid rumstemperatur, ta bort supernatanten med en pipettspets och utför ytterligare platttvättar.Efter pelletering av maskarna genom centrifugering i 30 sekunder vid 1 400 gånger G vid rumstemperatur, tvätta två gånger med en milliliter M9-media innehållande 0,1% Tween 20 eller tills supernatanten är klar. Ta bort supernatanten, tillsätt 700 mikroliter aceton och låt maskarna fixeras vid rumstemperatur i 10 minuter. Pelletera ut dessa fasta maskar i 30 sekunder vid 10 000 gånger G vid rumstemperatur och ge två tvättar av en milliliter fosfatbuffertsaltlösning innehållande 0,1% Tween 20.Förbered 50 ml DY96 arbetslösning, linda behållaren i folie och förvara den i en låda för att förhindra exponering för ljus. Tillsätt 500 mikroliter DY96 arbetslösning till maskpelleten och rotera i 30 minuter vid rumstemperatur i mörker. Centrifugera denna reaktion i 30 sekunder vid 10 000 gånger G vid rumstemperatur för att pelletera maskarna och ta bort supernatanten.Tillsätt sedan 15 mikroliter av monteringsmediet med eller utan DAPI. Pipettera 10 mikroliter av dessa färgade maskar på en mikroskopglidning och placera en täckglidning över toppen. För att analysera de DY96-färgade maskarna monterade på bilder, utför avbildning med GFP-kanalen i ett fluorescensmikroskop.För att bestämma maskpopulationernas lämplighet, använd ett 5X eller 10X mål för att analysera graviditetiteten hos mer än 100 maskar per tillstånd. Vid 72 timmar efter infektionen fixerades F1-djuren och färgades med DY96 för att bedöma mikrosporidiresistens. Infekterade föräldrapopulationer och oinfekterade kontroller fixerades vid 72 timmar efter infektion och färgades med DY96 för att visualisera maskembryon och mikrosporidisporerna.Infekterade djur är små, innehåller många mikrosporidier sporer och producerar färre embryon än friska, oinfekterade kontroller. Bedömning av maskens graviditet visade att cirka 95 % av de oinfekterade djuren producerade avkomma, jämfört med de infekterade djuren, vilka var mindre än 80 % Kvantifieringar visade att cirka 90 % av den mikrosporidibehandlade populationen var infekterad, vilket bestämdes av antalet maskar som innehöll DY96-färgade sporer. Kvantifieringar av dessa fasta djur avslöjade att de grundade maskarna innehöll betydligt fler embryon än deras naiva motsvarigheter, vilket indikerar större kondition inför infektion.Fiji ImageJ användes för att bestämma parasitbördan hos enskilda naiva och immunprimerade maskar, vilket är procentandelen av kroppen fylld med fluorescerande N.parisii-sporer. Kvantifieringar avslöjade en dramatisk minskning av parasitbördan hos maskar som kom från infekterade föräldrar. Vidare avslöjade beräkningarna av individuell maskstorlek att grundade maskar hade en signifikant tillväxtfördel jämfört med naiva djur inför N.parisii-infektion.Avbildningsstudier visade att medan naiva djur vanligtvis innehöll flera sporer och flera infekterade celler, hade de grundade djuren mycket färre eller inga sporer och vanligtvis inga sporoplasmer. Om ogrundade och grundade F1-populationer har liknande antal gravida och infekterade djur, räkna antalet ägg per djur och analysera infekterad vävnad med ImageJ för att hitta mer subtila skillnader. Medan direkt gul 96 fläckar mogna sporer, kan fluorescens in situ hybridisering avslöja sporoplasmer i celler.Detta kan visa dig antalet infekterade celler i grundade och ogrundade maskar. Dessa tekniker har visat att föräldrarnas transkriptionssvar kan vara avgörande för att inducera ärftlig immunitet hos avkommor. Forskare undersöker nu arten av denna immunitet hos avkommor.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris muris Infection: A Model of Type 2 Immunity and Inflammation in the Gut

Trichuris Muris Infektion: En modell av typ 2 Immunitet och inflammation i tarmen

Trichuris muris is a natural pathogen of mice and is biologically and antigenically similar to species of Trichuris that 
infect humans and livestock1. ...

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Val av Plasmodium falciparum Parasiter för Cytoadhesion till Human Brain endotelceller

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Vidhäftning analys för att studera Leucocyte Rekrytering till Human lever Sinus Endothelium under förhållanden av skjuvspänning

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

Ett protokoll för att infektera<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Med<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents

Neutrofil Isolering och analys för att fastställa deras roll i lymfom Cell Känslighet för terapeutiska medel

Neutrophils are the most abundant (40% to 75%) type of white blood cells and among the first inflammatory cells to migrate towards the site of ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Bioluminescence Imaging för att upptäcka sent stadium Infektion av afrikansk sömnsjuka

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Tillämpa Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) för att undersöka Effector Trans Effektivitet av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Under siRNA Ljuddämpning

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Musmodeller av Helicobacter -infektion och Gastric patologier

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

Utvärderande virulens och patogenesen av Aeromonas infektion i Caenorhabditis elegans modell

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

The Galleria mellonella Waxworm Infection Model for Disseminated Candidiasis

Galleria mellonella Waxworm infektion modell för disseminerad Candidiasis

Candida species are common fungal commensals of humans colonizing the skin, mucosal surfaces, and gastrointestinal tract. Under certain conditions, ...