Name: ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch den großen Forschungsplan der National Natural Science Foundation of China (Nr. 91539111to JY), das Schlüsselprojekt für Wissenschaft und Technologie der Provinz Hunan (Nr. 2020SK53420 bis JY) und das Wissenschafts- und Technologieinnovationsprogramm der Provinz Hunan (2021RC2106 bis CF) unterstützt.

Alle Tierversuche in dieser Studie wurden von der Ethikkommission des Zweiten Xiangya-Krankenhauses der Central South University überprüft und genehmigt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Materialien und Geräten, die in diesem Protokoll verwendet werden. Die Zeitpläne für Zellinjektion, Bildgebung und Euthansie sind wie folgt: t0- Induktion des Infarkts, t1 Woche - Bild- und Implantatzellen, t2 Wochen - Bild- und Implantatzellen, t4 Wochen - endgültige Bildgebung, Euthanasie u...

<ol>
	<li>Leuschner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+monocyte+kinetics+in+acute+myocardial+infarction+are+sustained+by+extramedullary+monocytopoiesis.">Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).</li><li>L&#225;z&#225;r, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Davis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art:+cardiac+transplantation.">State of the art: cardiac transplantation.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).</li><li>Mancini, D., Colombo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+assist+devices:+A+rapidly+evolving+alternative+to+transplant.">Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant.</a> Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+myocardial+remuscularization.">Translating myocardial remuscularization.</a> Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+investigation+of+hypoxia-preconditioned+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+myocardial+repair+in+nonhuman+primates:+Paracrine+activity+without+remuscularization.">A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization.</a> Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).</li><li>Kempf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture.">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts.">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts.">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li><li>Nguyen, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+strategies+to+address+the+major+clinical+barriers+facing+stem+cell+regenerative+therapy+for+cardiovascular+disease:+A+review.">Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review.</a> JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remuscularization+of+the+failing+heart.">Remuscularization of the failing heart.</a> The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+hypoxia-preconditioned+mesenchymal+stem+cells+improves+infarcted+heart+function+via+enhanced+survival+of+implanted+cells+and+angiogenesis.">Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+improves+Sca-1++stem+cell+survival+and+directs+ischemic+cardiomyocytes+toward+a+prosurvival+phenotype+via+exosomal+transfer:+a+critical+role+for+HSF1/miR-34a/HSP70+pathway.">Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway.</a> Stem Cells. 32 (2), 462-472 (2014).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+CCND2-overexpressing+human+induced-pluripotent+stem+cells+repopulate+the+myocardial+scar+in+mice:+A+6-month+study.">Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+microvessels+improve+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocyte+engraftment+and+cardiac+function+after+infarction+in+rats.">Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats.</a> Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+echocardiography-guided+multiple+percutaneous+left+ventricular+intramyocardial+injection+of+hiPSC-CMs+after+myocardial+infarction.">Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+competent+DNA+damage-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+myocardial+repair.">Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair.</a> Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+preconditioning+enhances+transplantation+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction+mice.">Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice.</a> Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+engraftment+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+via+a+transient+inhibition+of+rho+kinase+activity.">Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+revisited:+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).</li><li>Rainer, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-specific+transforming+growth+factor+&#946;+suppression+blocks+neutrophil+infiltration,+augments+multiple+cytoprotective+cascades,+and+reduces+early+mortality+after+myocardial+infarction.">Cardiomyocyte-specific transforming growth factor &#946; suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocyte+therapy+in+mouse+permanent+ischemia+and+ischemia-reperfusion+models.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 167 (2019).</li><li>Iwanaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+G-CSF+on+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+swine.">Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).</li></ol>

Zu den kritischen Schritten dieser Studie gehören die hiPSC-Kultur, die Differenzierung der Kardiomyozyten, die hiPSC-CM-Aufreinigung und die hiPSC-CM-Transplantation in die Myokardinfarktstelle der Maus. Der Schlüssel liegt darin, Herzultraschall zu verwenden, um die Behandlung transkutan zur Infarktstelle am Rand des Infarkts zu führen, wo hiPSC-CMs in den Bereich injiziert wurden.
Mit der Verlängerung der Kulturzeit ändert sich der hiPSC-CM-Phänotyp in der Morphologie (größere Zellg...

Wenn akuter MI auftritt, sterben Myokardzellen im Infarktbereich aufgrund von Ischämie und Hypoxie schnell ab. Mehrere Entzündungsfaktoren werden nach Zelltod und Ruptur freigesetzt, während Entzündungszellen die Infarktstelle infiltrieren, um eine Entzündung zu verursachen1. Bezeichnenderweise ersetzen Fibroblasten und Kollagen, sowohl ohne Kontraktilität als auch ohne elektrische Leitfähigkeit, die Myokardzellen an der Infarktstelle, um Narbengewebe zu bilden. Aufgrund der begrenzten Regenerationsfähigkeit von Kardiomyozyten bei erwachsenen Säugetieren ist lebensfähiges Gewebe, das nach einem großen Infarktbereich gebildet wird, in der Regel nicht ausreichend, um ein ausreichendes Herzzeitvolumen aufrechtzuerhalten2. MI verursacht Herzinsuffizienz, und in schweren Fällen von Herzinsuffizienz können sich die Patienten nur auf Herztransplantationen oder Herzunterstützungssysteme verlassen, um eine normale Herzfunktion aufrechtzuerhalten 3,4.
Nach MI besteht die ideale Behandlungsstrategie darin, die toten Kardiomyozyten durch neu gebildete Kardiomyozyten zu ersetzen und eine elektromechanische Kopplung mit gesundem Gewebe zu bilden. Die Behandlungsoptionen haben jedoch in der Regel eher eine myokardiale Rettung als einen Ersatz übernommen. Derzeit gehören stammzell- und vorläuferzellbasierte Therapien zu den vielversprechendsten Strategien zur Förderung der Myokardreparatur nach MI5. Die Transplantation dieser Zellen hat jedoch mehrere Probleme, vor allem die Unfähigkeit adulter Stammzellen, sich in Kardiomyozyten zu differenzieren, und ihre kurze Lebensdauer6.
Die ethischen Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) können durch iPS-Zellen umgangen werden, die eine vielversprechende Quelle für Zellen darstellen. Darüber hinaus besitzen iPS-Zellen eine starke Selbsterneuerungsfähigkeit und können sich zu Kardiomyozytendifferenzieren 7. Studien haben gezeigt, dass hiPSC-CMs, die in die MI-Stelle transplantiert werden, überleben und Gap Junctions mit Wirtszellen bildenkönnen 8,9. Da sich diese transplantierten Zellen jedoch in der Mikroumgebung von Ischämie und Entzündung befinden, ist ihre Überlebensrate extrem niedrig10,11.
Es wurden mehrere Methoden etabliert, um die Überlebensrate transplantierter Zellen zu verbessern, wie z. B. Hypoxie und Hitzeschock-Vorbehandlung transplantierter Zellen12,13, genetische Modifikation 14,15 und die gleichzeitige Transplantation von Zellen und Kapillaren 16. Leider sind die meisten Methoden durch Komplexität und hohe Kosten begrenzt. Daher schlägt die vorliegende Studie eine reproduzierbare, bequeme, relativ invasive und effektive hiPSC-CM-Verabreichungsmethode vor.
Die ultraschallgesteuerte intramyokardiale Zellinjektion kann unabhängig von der Stelle nur mit einem hochauflösenden kleinen veterinärmedizinischen Ultraschallgerät und einem Mikroinjektor durchgeführt werden. Unter Ultraschallführung ist die direkte Abgabe von Zellen unter dem Xiphoid-Prozess vom Perikard in das Myokard bei Mäusen ein sicheres Protokoll, das Leber- und Lungenschäden vermeidet. Diese Methode kann gleichzeitig mit anderen Technologien kombiniert werden, um die Überlebensrate transplantierter Zellen deutlich zu verbessern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarcomeric alpha actinin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(minus insulin)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(serum free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17&#8211;504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SDHT10132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>CT99021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclosporin A</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-B0579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIRECT RED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>365548-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST GREEN FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green MasterMix kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound coupling agent</td>
			<td>CARENT</td>
			<td>22396269389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S6390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Real-Time PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluoresence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine anatomical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine dissecting forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>MATRX</td>
			<td>VMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system</td>
			<td>VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Product and Service Solutions</td>
			<td>IBM</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mitochondrial DNA primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the forward primer sequence</td>
			<td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the reverse primer sequence</td>
			<td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice

Das Hauptziel der Zelltherapie nach Myokardinfarkt (MI) ist es, die Zelltransplantationsrate effektiv zu erhöhen, und humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) sind eine vielversprechende Zellquelle für die Herzreparatur nach ischämischen Schäden. Eine niedrige Transplantatrate ist jedoch ein erhebliches Hindernis für eine effektive Regeneration des Herzgewebes nach der Transplantation. Dieses Protokoll zeigt, dass mehrere ultraschallgesteuerte perkutane Injektionen in einen MI-Bereich die Zelltransplantationsraten effektiv erhöhen. Die Studie beschreibt auch den gesamten hiPSC-CM-Kulturprozess, die Vorbehandlung und die ultraschallgesteuerten perkutanen Verabreichungsmethoden. Darüber hinaus hilft die Verwendung menschlicher mitochondrialer DNA, das Fehlen von hiPSC-CMs in anderen Mausorganen nachzuweisen. Schließlich beschreibt dieser Artikel die Veränderungen der Herzfunktion, der Angiogenese, der Zellgröße und der Apoptose an der infarktierten Grenzzone bei Mäusen 4 Wochen nach der Zellentbindung. Daraus kann geschlossen werden, dass die echokardiographiegesteuerte perkutane Injektion des linksventrikulären Myokards eine machbare, relativ invasive, zufriedenstellende, wiederholbare und wirksame Zelltherapie ist.

Die Echokardiographie zur Beurteilung der linksventrikulären Funktion der Mäuse in jeder Gruppe zeigte, dass die MI-Verletzungen in der MD-Gruppe effektiv rückgängig gemacht wurden (Abbildung 2A). Im Vergleich zur MI-Gruppe zeigte die SD-Gruppe eine erhöhte Ejektionsfraktion (EF) (von 30% auf 35%; Abbildung 2B) und Fraktionsverkürzung (FS) (von 18 % auf 22 %; Abbildung 2C) nach MI. Es ist jedoch noch wichtiger zu beachten, das...

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Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

Die ultraschallgesteuerte Zellabgabe um die Stelle des Myokardinfarkts bei Mäusen ist eine sichere, effektive und bequeme Art der Zelltransplantation.

Ultraschallgesteuerte induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Kardiomyozyten-Implantation bei myokardinfarktierten Mäusen

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Dies ist der erste Bericht, der zeigt, dass die echokardiographiegesteuerte, perkutane intramyokardiale Injektion von Kardiomyozyten die reparative Eigenschaft von humanen iPS-abgeleiteten Kardiomyozyten signifikant verbessert. Diese Methode ist ein praktikables, zufriedenstellendes, wiederholbares, weniger invasives und wirksames Verfahren zur Verabreichung einer humanen iPS-abgeleiteten Kardiomyozytentherapie. Wir glauben, dass die perkutane intramyokardiale Verabreichung eine sichere und effiziente Methode zur lokalen Verabreichung von Medikamenten für Krankheiten wie ischämische Herzkrankheit, Myokardinfarkt und Herzinsuffizienz ist.Dieses Projekt wird von Professor Jinfu Yang und Professor Jun Peng betreut. Xun Wu, Kele Qin und Kun Xiang, MD PhDs aus meinem Labor und Di Wang, ein PhD vom Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research, demonstrieren das Verfahren. Um zu beginnen, saugen Sie den Kulturüberstand aus einer 60-Tage-Kultur von hiPSC-CMs ab.Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS. Anschließend werden die hiPSC-CMs mit der Zellablösungsenzymmischung bei 37 Grad Celsius drei bis fünf Minuten lang in einzelne Zellen dissoziiert. Sammeln Sie die Zellen in einem 15-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter RPMI plus B27-Medium enthält, und mischen Sie.Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 G für zwei Minuten bei Raumtemperatur. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in Kardiomyozyten-Trägermedium auf eine Konzentration von 6 x 10 der 4. Zellen pro Mikroliter.Stellen Sie das Röhrchen bis zum Injektionsschritt auf 37 Grad Celsius. Nachdem die Maus ausreichend betäubt ist, fixieren Sie die Gliedmaßen und den Schwanz mit Klebeband. Befestigen Sie dann die Schneidezähne der Maus mit einem 2/0-Seidenfaden und Klebeband.Sterilisieren Sie den mittleren Hals und die linke Brust mit drei abwechselnden Runden Betain, gefolgt von Alkohol. Machen Sie einen mittleren Halsschnitt mit einer feinen anatomischen Schere und einer feinen Präparierzange. Schneiden Sie einige vordere Halsmuskeln ab, um die Luftröhre zu stabilisieren und vollständig freizulegen.Führen Sie eine 20-Gauge-Katheterpunktionsnadel als Trachealtubus durch den Mund ein. Schließen Sie den Trachealtubus an das Beatmungsgerät an und überprüfen Sie die Bewegung des Brustkorbs, um sicherzustellen, dass beide Lungen gut belüftet sind. Passen Sie die Atemparameter an.Befestigen Sie anschließend das linke Hinterbein wieder an der unteren rechten Seite und lösen Sie das Klebeband um das linke obere Glied. Führen Sie mit einer feinen Präparierschere und Pinzette eine Thorakotomie im drei bis vier Interkostalraum des linken Brustkorbs durch. Ziehen Sie mit einer Pinzette das Perikard ab und lokalisieren Sie die linke vordere absteigende Koronararterie.Verwenden Sie einen 6/0-Seidenfaden, um das proximale Ende der Arterie zu ligieren. Um sicherzustellen, dass das Modell des akuten Myokardinfarkts etabliert ist, warten Sie, bis sich die distale Seite der Arterie an der Ligaturstelle von rot nach weiß ändert. Schließen Sie die Brust Schicht für Schicht und vernähen Sie die Haut mit 4/0 Faden.Führen Sie bei der Scheingruppe von Tieren alle chirurgischen Eingriffe mit Ausnahme der Ligatur durch. Legen Sie die Mäuse in den ersten zwei Wochen nach dem Myokardinfarkt in eine Anästhesiebox, die mit 5% Isofluoran verbunden ist, und führen Sie eine Trachealintubation durch. Drei Tage vor der Verabreichung von hiPSC-CMs injizieren Sie Ciclosporin A in einer Dosis von 10 Milligramm pro Kilogramm pro Tag in die intraperitoneale Höhle.Entfernen Sie die Haare von Brust und Oberbauch der Maus mit Enthaarungscreme. Die Zufuhr von Inhalationsisofluoran bis zur Herzfrequenz wird bei 400 bis 500 Schlägen pro Minute gehalten. Befestigen Sie die Gliedmaßen und den Schwanz der Maus mit Klebeband an der Erkennungskonsole und stellen Sie die Plattformtemperatur auf 37 Grad Celsius ein.Tragen Sie das Ultraschallgelee auf den Oberbauch auf. Erhalten Sie mit einer hochauflösenden veterinärmedizinischen Ultraschallsonde Bilder der Mausleber. Ziehen Sie mit einer Fünf-Mikroliter-Mikrospritze ca. 3 x 10 zu den 5. hiPSC-CMs.Halten Sie die Spritze fest und führen Sie eine drei Millimeter lange Nadel in den linken Paraxiphoid-Prozess ein. Folgen Sie unter Ultraschallkontrolle der Oberkante der Membran. Beobachten Sie den Atemrhythmus und die Reichweite.Betreten Sie das Perikard am Ende des Exspirationskreises, um Schäden an Leber und Lunge zu vermeiden. Erfassen Sie dann das parasternale Langachsenbild des Mausherzens durch B-Mode-Echokardiographie. Unter Ultraschallkontrolle injizieren Sie 1 x 10 in die 5. hiPSC-CMs-Zellen in jeden der drei Randbereiche der Infarktstelle.Entfernen Sie die Ultraschallsonde und spülen Sie das Gelee ab. Entwöhnen Sie die Maus von der Anästhesie und bringen Sie sie in ihren Käfig zurück. Injizieren Sie Ciclosporin A kontinuierlich für einen Monat nach der Transplantation.Das Echokardiogramm des linken Ventrikels zeigte, dass die Verletzungen aufgrund eines Myokardinfarkts in der Mehrfachdosisgruppe rückgängig gemacht wurden. Die Transplantation von hiPSC-CMs führte auch zu einer erhöhten Ejektionsfraktion und Fraktionsverkürzung. Die Messung der kardialen Parameter mittels Sirius-Rot- und Fast-Green-Färbung zeigte, dass die Infarktgröße und der Kollagenvolumenanteil abnahmen, während die linksventrikuläre Vorderwanddicke nach der Transplantation zunahm.Die Markierung für unspezifisches Alpha-Aktin in Grün, DAPI in Blau und humanspezifisches Troponin T in Rot zeigte das Vorhandensein von transplantierten Zellen im Infarkt- und Randinfarktbereich. Die Anzahl und der Prozentsatz der transplantierten Zellen waren in der Mehrfachdosisgruppe höher als in der Einzeldosis. 28 Tage nach dem Myokardinfarkt zeigte die Mehrfachdosisgruppe einen Anstieg der Anzahl der Zellen, die den Endothelzellmarker I-B4 exprimierten.Die Färbung von Weizenkeim-Agglutinin und sarkomerem Alpha-Actinin auf Kardiomyozyten zeigte eine Verringerung des minimalen Faserdurchmessers. Eine geringere Anzahl tunnelpositiver Kardiomyozytenkerne in der Mehrfachdosisgruppe deutete auf eine verminderte Apoptose hin. Die PCR-Analyse wies die menschliche mitochondriale DNA nur im Herzen nach und zeigte eine spezifische Transplantation.Achten Sie beim Einführen der Nadel darauf, dass sie zusammen mit dem oberen Zwerchfellrand und am Ende des Exspirationskreises in die Perikardhöhle eindringt, um eine Verletzung der Leber oder der Lunge zu vermeiden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantation einer Karotis Cuff für Triggering Shear-Stress-Induced Arteriosklerose bei Mäusen

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Forschung

Medizin

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolierung von Kardiomyozyten Kerne von Post-mortem Gewebe

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Ultraschall-geführte Transthorakale intramyokardiale Injection in Mäuse

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Substernalen Schilddrüse Biopsie Mit Endobronchial Ultraschall-gesteuerte Transbronchiale Needle Aspiration

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Gezielte und selektive Behandlung von pluripotenten Stammzellen abgeleitet darum mit externen Strahl Strahlung in einem kleinen Tier-Modell

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

Ein Cryoinjury-Modell zur Untersuchung des Myokardinfarkts in der Maus

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarkomere-Verkürzung von pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten unter Verwendung fluoreszierender Sarkomere-Proteine.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Endoscopic Ultrasound-Guided Biliary Drainage: Endoscopic Ultrasound-Guided Hepaticogastrostomy in Malignant Biliary Obstruction

Endoskopische ultraschallgeführte Gallendrainage: Endoskopische ultraschallgeführte Hepaticogastrostomie bei maligner Gallenobstruktion

Patients with unresectable malignant biliary obstruction often require biliary drainage to decompress the biliary system. Endoscopic Retrograde ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Induktion von Myokardinfarkt und myokardialer Ischämie-Reperfusionsschädigung bei Mäusen

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Technische Anwendungen von Mikroelektrodenarray- und Patch-Clamp-Aufnahmen an humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...