Name: ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר העיקרית של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '91539111ל JY), פרויקט מפתח של מדע וטכנולוגיה של מחוז הונאן (מס '2020SK53420 ל- JY) ותוכנית החדשנות במדע וטכנולוגיה של מחוז הונאן (2021RC2106 עד CF).

כל הניסויים בבעלי חיים במחקר זה נבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים השני שיאנגיה באוניברסיטת מרכז דרום. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות כל החומרים והציוד המשמשים בפרוטוקול זה. לוחות הזמנים להזרקת תאים, הדמיה והמתת חסד הם כדלקמן: t0- לגרום אוטם, t1 שבוע- תמונה ותאי שתל, ...

<ol>
	<li>Leuschner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+monocyte+kinetics+in+acute+myocardial+infarction+are+sustained+by+extramedullary+monocytopoiesis.">Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).</li><li>L&#225;z&#225;r, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Davis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art:+cardiac+transplantation.">State of the art: cardiac transplantation.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).</li><li>Mancini, D., Colombo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+assist+devices:+A+rapidly+evolving+alternative+to+transplant.">Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant.</a> Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+myocardial+remuscularization.">Translating myocardial remuscularization.</a> Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+investigation+of+hypoxia-preconditioned+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+myocardial+repair+in+nonhuman+primates:+Paracrine+activity+without+remuscularization.">A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization.</a> Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).</li><li>Kempf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture.">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts.">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts.">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li><li>Nguyen, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+strategies+to+address+the+major+clinical+barriers+facing+stem+cell+regenerative+therapy+for+cardiovascular+disease:+A+review.">Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review.</a> JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remuscularization+of+the+failing+heart.">Remuscularization of the failing heart.</a> The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+hypoxia-preconditioned+mesenchymal+stem+cells+improves+infarcted+heart+function+via+enhanced+survival+of+implanted+cells+and+angiogenesis.">Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+improves+Sca-1++stem+cell+survival+and+directs+ischemic+cardiomyocytes+toward+a+prosurvival+phenotype+via+exosomal+transfer:+a+critical+role+for+HSF1/miR-34a/HSP70+pathway.">Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway.</a> Stem Cells. 32 (2), 462-472 (2014).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+CCND2-overexpressing+human+induced-pluripotent+stem+cells+repopulate+the+myocardial+scar+in+mice:+A+6-month+study.">Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+microvessels+improve+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocyte+engraftment+and+cardiac+function+after+infarction+in+rats.">Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats.</a> Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+echocardiography-guided+multiple+percutaneous+left+ventricular+intramyocardial+injection+of+hiPSC-CMs+after+myocardial+infarction.">Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+competent+DNA+damage-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+myocardial+repair.">Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair.</a> Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+preconditioning+enhances+transplantation+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction+mice.">Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice.</a> Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+engraftment+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+via+a+transient+inhibition+of+rho+kinase+activity.">Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+revisited:+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).</li><li>Rainer, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-specific+transforming+growth+factor+&#946;+suppression+blocks+neutrophil+infiltration,+augments+multiple+cytoprotective+cascades,+and+reduces+early+mortality+after+myocardial+infarction.">Cardiomyocyte-specific transforming growth factor &#946; suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocyte+therapy+in+mouse+permanent+ischemia+and+ischemia-reperfusion+models.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 167 (2019).</li><li>Iwanaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+G-CSF+on+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+swine.">Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).</li></ol>

השלבים הקריטיים של מחקר זה כוללים תרבית hiPSC, התמיינות קרדיומיוציטים, טיהור hiPSC-CM והשתלת hiPSC-CM באתר אוטם שריר הלב של עכבר. המפתח הוא להשתמש באולטרסאונד לב כדי לכוון את הטיפול באופן טרנסעורי לכיוון אתר האוטם בקצה האוטם שבו הוזרקו לאזור hiPSC-CMs.
עם התארכות זמן התרבית, הפנוטיפ hiPSC-CM ?...

כאשר MI חריפה מתרחשת, תאי שריר הלב באזור אוטם למות במהירות עקב איסכמיה היפוקסיה. מספר גורמים דלקתיים משתחררים לאחר מוות וקרע של תאים, בעוד שתאי דלקת חודרים לאתר האוטם וגורמים לדלקת1. באופן משמעותי, פיברובלסטים וקולגן, הן ללא התכווצות והן מוליכות חשמלית, מחליפים את תאי שריר הלב באתר האוטם ויוצרים רקמת צלקת. בשל יכולת ההתחדשות המוגבלת של קרדיומיוציטים ביונקים בוגרים, רקמה בת קיימא הנוצרת לאחר שטח גדול של אוטם אינה מספקת בדרך כלל לשמירה על תפוקת לב מספקת2. MI גורם לאי ספיקת לב, ובמקרים חמורים של אי ספיקת לב, חולים יכולים להסתמך רק על השתלות לב או מכשירי סיוע חדריים כדי לשמור על תפקודי לב תקינים 3,4.
לאחר MI, אסטרטגיית הטיפול האידיאלית היא להחליף את cardiomyocytes מת עם cardiomyocytes שזה עתה נוצרו, יצירת צימוד אלקטרומכני עם רקמות בריאות. עם זאת, אפשרויות הטיפול אימצו בדרך כלל הצלת שריר הלב ולא החלפה. נכון לעכשיו, טיפולים מבוססי תאי גזע ותאי אב הם בין האסטרטגיות המבטיחות ביותר לקידום תיקון שריר הלב לאחר MI5. עם זאת, להשתלה של תאים אלה יש מספר בעיות, בעיקר חוסר היכולת של תאי גזע בוגרים להתמיין לקרדיומיוציטים ותוחלת החיים הקצרה שלהם6.
ניתן לעקוף את הסוגיות האתיות הקשורות לשימוש בתאי גזע עובריים (ES) על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים מוגנים, שהם מקור מבטיח לתאים. בנוסף, iPSCs הם בעלי יכולות התחדשות עצמית חזקות ויכולים להתמיין לקרדיומיוציטים7. מחקרים הראו כי hiPSC-CMs המושתלים באתר MI יכולים לשרוד וליצור צמתים מרווחים עם תאים מארחים 8,9. עם זאת, מכיוון שתאים מושתלים אלה ממוקמים במיקרו-סביבה של איסכמיה ודלקת, שיעור ההישרדות שלהם נמוך ביותר10,11.
מספר שיטות הוקמו כדי לשפר את שיעור ההישרדות של תאים מושתלים, כגון היפוקסיה והלם חום טיפול מקדים של תאים מושתלים 12,13, שינוי גנטי 14,15, והשתלה בו זמנית של תאים ונימים 16. למרבה הצער, רוב השיטות מוגבלות על ידי מורכבות ועלות גבוהה. לפיכך, המחקר הנוכחי מציע שיטת מתן hiPSC-CM ניתנת לשחזור, נוחה, פולשנית יחסית ויעילה.
הזרקת תאים תוך שריר הלב מונחה אולטרסאונד יכולה להתבצע רק עם מכשיר אולטרסאונד וטרינרי קטן ברזולוציה גבוהה ומיקרו-מזרק, ללא קשר לאתר. בהנחיית אולטרסאונד, העברה ישירה של תאים בתהליך הקסיפואיד מקרום הלב אל שריר הלב בעכברים היא פרוטוקול בטוח המונע נזק לכבד ולריאות. שיטה זו יכולה להיות משולבת בו זמנית עם טכנולוגיות אחרות כדי לשפר באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של תאים מושתלים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarcomeric alpha actinin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(minus insulin)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(serum free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17&#8211;504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SDHT10132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>CT99021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclosporin A</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-B0579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIRECT RED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>365548-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST GREEN FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green MasterMix kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound coupling agent</td>
			<td>CARENT</td>
			<td>22396269389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S6390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Real-Time PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluoresence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine anatomical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine dissecting forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>MATRX</td>
			<td>VMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system</td>
			<td>VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Product and Service Solutions</td>
			<td>IBM</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mitochondrial DNA primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the forward primer sequence</td>
			<td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the reverse primer sequence</td>
			<td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice

המטרה העיקרית של טיפול תאי לאחר אוטם שריר הלב (MI) היא לשפר ביעילות את קצב השתלת התא, וקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC-CMs) הם מקור תאים מבטיח לתיקון לב לאחר נזק איסכמי. עם זאת, שיעור השתלות נמוך מהווה מכשול משמעותי להתחדשות יעילה של רקמת הלב לאחר ההשתלה. פרוטוקול זה מראה כי מספר זריקות מלעוריות מונחות אולטרסאונד hiPSC-CM לאזור MI מגדילות ביעילות את שיעורי השתלת התאים. המחקר מתאר גם את כל תהליך תרבית hiPSC-CM, טיפול מקדים ושיטות לידה מלעורית מונחות אולטרסאונד. בנוסף, השימוש בדנ"א מיטוכונדריאלי אנושי עוזר לזהות היעדר hiPSC-CMs באיברי עכבר אחרים. לבסוף, מאמר זה מתאר את השינויים בתפקוד הלב, אנגיוגנזה, גודל התא ואפופטוזיס באזור הגבול האוטם בעכברים 4 שבועות לאחר מסירת התא. ניתן להסיק כי הזרקה מלעורית מונחית אקוקרדיוגרפיה של שריר הלב של החדר השמאלי היא טיפול תאי אפשרי, פולשני יחסית, משביע רצון, חוזר ויעיל.

אקוקרדיוגרפיה להערכת תפקוד החדר השמאלי של העכברים בכל קבוצה גילתה שפציעות MI התהפכו ביעילות בקבוצת MD (איור 2A). בהשוואה לקבוצת MI, קבוצת SD הראתה מקטע פליטה מוגבר (EF) (מ -30% ל -35%; איור 2B) וקיצור שברים (FS) (מ-18% ל-22%; איור 2C) אחרי MI. עם זאת, חשוב עוד יותר לצ...

Watch this Scientific Journal Video about Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice at JoVE.com

Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

העברת תאים מונחית אולטרסאונד סביב האתר של אוטם שריר הלב בעכברים היא דרך בטוחה, יעילה ונוחה להשתלת תאים.

השתלת קרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אולטרסאונד בעכברים עם אוטם שריר הלב

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

זהו הדו"ח הראשון המוכיח כי הזרקה תוך-שרירית מלעורית מונחית אקוקרדיוגרפיה של קרדיומיוציטים משפרת באופן משמעותי את המאפיין המתקן של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPS אנושי. שיטה זו אפשרית, משביעת רצון, חוזרת על עצמה הליך פחות פולשני ויעיל למתן טיפול קרדיומיוציטים הנגזרים מ- iPS אנושי. אנו מאמינים כי מתן תוך שריר הלב מלעורית היא שיטה בטוחה ויעילה למתן תרופות מקומיות למחלות כולל מחלת לב איסכמית, אוטם שריר הלב ואי ספיקת לב.פרויקט זה מפוקח על ידי פרופסור ג'ינפו יאנג ופרופסור ג'ון פנג. הדגמת ההליך תהיה שון וו, קייל צ'ין וקון שיאנג, MD PhDs מהמעבדה שלי ודי וואנג, דוקטורט ממעבדת המפתח המחוזית של הונאן לחקר הלב וכלי הדם. בתור התחלה, ואקום שואפים את הסופרנאטנט התרבותי מתרבות של 60 יום של hiPSC-CMs.שטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים. לאחר מכן נתקו את hiPSC-CMs לתאים בודדים באמצעות תערובת אנזימי ניתוק התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. לאסוף את התאים בצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של RPMI בתוספת B27 בינוני ולערבב.ספור את התאים וחשב את מספר התאים הכולל. צנטריפוגו את מתלה התא ב-300G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה במדיום התמיכה בקרדיומיוציטים לריכוז של 6X10 מהתאים ה-4 למיקרוליטר.מניחים את הצינורית על 37 מעלות צלזיוס עד שלב ההזרקה. לאחר העכבר הוא מורדם מספיק, לתקן את הגפיים ואת הזנב עם קלטת. לאחר מכן, תקן את חותכות העכבר עם חוט משי 2/0 קלטת.לעקר את הצוואר החציוני ואת החזה השמאלי עם שלושה סיבובים לסירוגין של בטאין ואחריו אלכוהול. בצע חתך צוואר חציוני באמצעות מספריים אנטומיים עדינים ומלקחיים מנתחים עדינים. חתכו כמה שרירי צוואר הרחם הקדמיים כדי לייצב ולחשוף באופן מלא את קנה הנשימה.הכנס מחט ניקוב צנתר 20 מד כצינור קנה הנשימה דרך הפה. חבר את צינור קנה הנשימה למכונת ההנשמה ובדוק את תנועת בית החזה כדי לוודא ששתי הריאות מאווררות היטב. התאימו את פרמטרי הנשימה.לאחר מכן, תקן את הגפה האחורית השמאלית לצד הימני התחתון ושחרר את הסרט סביב הגפה העליונה השמאלית. בעזרת מספריים ומלקחיים מנתחים עדינים, בצעו כריתת בית החזה בחלל הבין-קוסטלי של בית החזה השמאלי. בעזרת מלקחיים, מקלפים את קרום הלב ומאתרים את העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי.השתמש בחוט משי 6/0 כדי לקשור את הקצה הפרוקסימלי של העורק. כדי להבטיח שמודל אוטם שריר הלב החריף יוקם, יש להמתין עד שהצד הדיסטלי של העורק באתר הקשירה ישתנה מאדום ללבן. סגור את החזה שכבה אחר שכבה ותפר את העור בחוט 4/0.עבור קבוצת בעלי החיים המזויפים, בצע את כל ההליכים הכירורגיים למעט קשירה. בשבועיים הראשונים לאחר אוטם שריר הלב, יש להכניס את העכברים לקופסת הרדמה המחוברת לאיזופלואורן 5% ולבצע אינטובציה בקנה הנשימה. שלושה ימים לפני מתן hiPSC-CMs, להזריק cyclosporine A לתוך חלל intraperitoneal במינון של 10 מיליגרם לק"ג ליום.הסר את השיער מן החזה ואת הבטן העליונה של העכבר עם קרם depilatory. ספק איזופלואורן שאיפה עד שקצב הלב נשמר על 400 עד 500 פעימות לדקה. תקן את גפיים וזנב העכבר עם סרט על קונסולת האיתור ולהגדיר את טמפרטורת הפלטפורמה על 37 מעלות צלזיוס.החל את ג'לי אולטרסאונד על הבטן העליונה. באמצעות בדיקת אולטרסאונד וטרינרית ברזולוציה גבוהה, להשיג תמונות כבד עכבר. באמצעות מזרק מיקרו חמישה מיקרוליטר, לצייר כ 3 x 10 כדי hiPSC-CMs 5.החזק את המזרק והכנס מחט שלושה מילימטר בתהליך הפרקסיפואיד השמאלי. תחת הנחיית אולטרסאונד, עקוב אחר הקצה העליון של הסרעפת. שימו לב לקצב הנשימה ולטווח.הזן את קרום הלב בסוף מעגל expiratory, הימנעות נזק לכבד ולריאות. לאחר מכן לרכוש את תמונת הציר הארוך parasternal של לב העכבר על ידי אקוקרדיוגרפיה במצב B. תחת הנחיה קולית, להזריק 1 x 10 לתאי hiPSC-CMs 5th לתוך כל אחד משלושת האזורים השוליים של אתר האוטם.הסר את בדיקת האולטרסאונד ושטוף את הג'לי. גמלו את העכבר מההרדמה והחזירו אותו לכלוב. להזריק cyclosporine A ברציפות במשך חודש לאחר ההשתלה.אקו לב של החדר השמאלי הראה כי הפציעות עקב אוטם שריר הלב היו הפוכות בקבוצת המינון המרובים. השתלת hiPSC-CMs הביאה גם להגדלת מקטע הפליטה והתקצרות השברים. מדידת פרמטרים לבביים באמצעות צביעת סיריוס אדום וירוק מהיר הראתה כי גודל האוטם ומקטע נפח הקולגן ירדו, בעוד שעובי דופן החדר השמאלי הקדמי גדל לאחר ההשתלה.תיוג עבור אלפא אקטין לא ספציפי בירוק, DAPI בכחול, וטרופונין T ספציפי לאדם באדום הראה נוכחות של תאים מושתלים באוטם ובאזור אוטם שולי. מספר התאים המושתלים ושיעורם היו גבוהים יותר בקבוצת המנות המרובות בהשוואה למנה בודדת. 28 ימים לאחר אוטם שריר הלב, קבוצת המינונים המרובים הראתה עלייה במספר התאים המבטאים את סמן תאי האנדותל, I-B4.צביעת אגלוטינין של נבט חיטה וצביעת אלפא אקטינין סרקומרית על קרדיומיוציטים הראתה ירידה בקוטר הסיבים המינימלי. מספר נמוך יותר של גרעיני קרדיומיוציטים חיוביים בקבוצת המינונים המרובים הצביע על אפופטוזיס מופחת. בדיקת PCR זיהתה את הדנ"א המיטוכונדריאלי האנושי רק בלב, והראתה השתלה ספציפית.בעת החדרת המחט, יש לוודא שהיא נכנסת לחלל קרום הלב יחד עם השוליים העליונים של הסרעפת ובקצה מעגל התפוגה כדי למנוע פגיעה בכבד או בריאה.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

השרשה של קאף הראש מפעילה שאר מתח טרשת עורקים המושרה עכברים

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

הזרקת Transthoracic Intramyocardial אולטרסאונד מונחה בעכברים

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Substernal בלוטת התריס הביופסיה באמצעות מחט Transbronchial איפה מודרכת אולטראסאונד Endobronchial

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

טיפול ממוקד, סלקטיבי של Teratomas נגזר תאי גזע Pluripotent באמצעות קרינה חיצוני קרן במודל של חיית-קטן

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

מודל לפציעה בהקפאה לחקור אוטם שריר הלב בעכבר

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

קיצור סרקומר של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Endoscopic Ultrasound-Guided Biliary Drainage: Endoscopic Ultrasound-Guided Hepaticogastrostomy in Malignant Biliary Obstruction

ניקוז מרה אנדוסקופי מודרך אולטרסאונד: אנדוסקופי אולטרסאונד מונחה Hepaticogastrostomy בחסימת מרה ממאירה

Patients with unresectable malignant biliary obstruction often require biliary drainage to decompress the biliary system. Endoscopic Retrograde ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

השראת אוטם שריר הלב ופגיעה באיסכמיה של שריר הלב בעכברים

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

יישומים טכניים של מערך מיקרו-אלקטרודות והקלטות מהדקי טלאים על קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על-ידי בני אדם

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...