Name: ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal Grande Piano di Ricerca della National Natural Science Foundation of China (No. 91539111to JY), Key Project of Science and Technology of Hunan Province (No. 2020SK53420 to JY) e The Science and Technology Innovation Program of Hunan Province (2021RC2106 to CF).

Tutti gli esperimenti sugli animali in questo studio sono stati esaminati e approvati dal comitato etico del Secondo Xiangya Hospital della Central South University. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali e le attrezzature utilizzati in questo protocollo. Le tempistiche per l'iniezione cellulare, l'imaging e l'eutanasia sono le seguenti: t0- indurre infarto, t1 settimana- immagine e cellule implantari, t2 settimane- immagine e cellule implantari, t4 settimane - imagin...

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	<li>Leuschner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+monocyte+kinetics+in+acute+myocardial+infarction+are+sustained+by+extramedullary+monocytopoiesis.">Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).</li><li>L&#225;z&#225;r, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Davis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art:+cardiac+transplantation.">State of the art: cardiac transplantation.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).</li><li>Mancini, D., Colombo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+assist+devices:+A+rapidly+evolving+alternative+to+transplant.">Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant.</a> Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+myocardial+remuscularization.">Translating myocardial remuscularization.</a> Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+investigation+of+hypoxia-preconditioned+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+myocardial+repair+in+nonhuman+primates:+Paracrine+activity+without+remuscularization.">A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization.</a> Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).</li><li>Kempf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture.">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts.">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts.">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li><li>Nguyen, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+strategies+to+address+the+major+clinical+barriers+facing+stem+cell+regenerative+therapy+for+cardiovascular+disease:+A+review.">Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review.</a> JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remuscularization+of+the+failing+heart.">Remuscularization of the failing heart.</a> The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+hypoxia-preconditioned+mesenchymal+stem+cells+improves+infarcted+heart+function+via+enhanced+survival+of+implanted+cells+and+angiogenesis.">Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+improves+Sca-1++stem+cell+survival+and+directs+ischemic+cardiomyocytes+toward+a+prosurvival+phenotype+via+exosomal+transfer:+a+critical+role+for+HSF1/miR-34a/HSP70+pathway.">Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway.</a> Stem Cells. 32 (2), 462-472 (2014).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+CCND2-overexpressing+human+induced-pluripotent+stem+cells+repopulate+the+myocardial+scar+in+mice:+A+6-month+study.">Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+microvessels+improve+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocyte+engraftment+and+cardiac+function+after+infarction+in+rats.">Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats.</a> Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+echocardiography-guided+multiple+percutaneous+left+ventricular+intramyocardial+injection+of+hiPSC-CMs+after+myocardial+infarction.">Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+competent+DNA+damage-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+myocardial+repair.">Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair.</a> Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+preconditioning+enhances+transplantation+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction+mice.">Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice.</a> Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+engraftment+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+via+a+transient+inhibition+of+rho+kinase+activity.">Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+revisited:+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).</li><li>Rainer, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-specific+transforming+growth+factor+&#946;+suppression+blocks+neutrophil+infiltration,+augments+multiple+cytoprotective+cascades,+and+reduces+early+mortality+after+myocardial+infarction.">Cardiomyocyte-specific transforming growth factor &#946; suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocyte+therapy+in+mouse+permanent+ischemia+and+ischemia-reperfusion+models.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 167 (2019).</li><li>Iwanaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+G-CSF+on+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+swine.">Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).</li></ol>

Le fasi critiche di questo studio includono la coltura di hiPSC, la differenziazione dei cardiomiociti, la purificazione di hiPSC-CM e il trapianto di hiPSC-CM nel sito di infarto miocardico del topo. La chiave è utilizzare l'ecografia cardiaca per guidare transcutaneamente il trattamento verso il sito dell'infarto ai margini dell'infarto in cui sono stati iniettati gli hiPSC-CM nell'area.
Con il prolungamento del tempo di coltura, il fenotipo hiPSC-CM cambia nella morfologia (dimensioni cell...

Quando si verifica un'infarto miocardica acuta, le cellule del miocardio nell'area infartuata muoiono rapidamente a causa di ischemia e ipossia. Diversi fattori infiammatori vengono rilasciati dopo la morte e la rottura delle cellule, mentre le cellule infiammatorie si infiltrano nel sito infartuato per causare infiammazione1. Significativamente, i fibroblasti e il collagene, entrambi senza contrattilità e conduttività elettrica, sostituiscono le cellule miocardiche nel sito infartuato per formare tessuto cicatriziale. A causa della limitata capacità di rigenerazione dei cardiomiociti nei mammiferi adulti, il tessuto vitale formato dopo una vasta area di infarto di solito non è adeguato per mantenere una gittata cardiaca sufficiente2. L'infarto miocardico causa insufficienza cardiaca e, nei casi gravi di insufficienza cardiaca, i pazienti possono fare affidamento solo su trapianti di cuore o dispositivi di assistenza ventricolare per mantenere le normali funzioni cardiache 3,4.
Dopo l'infarto miocardico, la strategia di trattamento ideale è quella di sostituire i cardiomiociti morti con cardiomiociti di nuova formazione, formando accoppiamenti elettromeccanici con tessuti sani. Tuttavia, le opzioni di trattamento hanno tipicamente adottato il salvataggio miocardico piuttosto che la sostituzione. Attualmente, le terapie basate su cellule staminali e cellule progenitrici sono tra le strategie più promettenti per promuovere la riparazione miocardica dopo l'MI5. Tuttavia, il trapianto di queste cellule ha diversi problemi, in primo luogo l'incapacità delle cellule staminali adulte di differenziarsi in cardiomiociti e la loro breve durata di vita6.
Le questioni etiche relative all'uso di cellule staminali embrionali (ES) possono essere aggirate dalle iPSC, che sono una fonte promettente di cellule. Inoltre, le iPSC possiedono forti capacità di auto-rinnovamento e possono differenziarsi in cardiomiociti7. Gli studi hanno dimostrato che le hiPSC-CM trapiantate nel sito MI possono sopravvivere e formare giunzioni gap con le cellule ospiti 8,9. Tuttavia, poiché queste cellule trapiantate si trovano nel microambiente di ischemia e infiammazione, il loro tasso di sopravvivenza è estremamente basso10,11.
Sono stati stabiliti diversi metodi per migliorare il tasso di sopravvivenza delle cellule trapiantate, come il pretrattamento con ipossia e shock termico delle cellule trapiantate12,13, la modificazione genetica 14,15 e il trapianto simultaneo di cellule e capillari 16. Sfortunatamente, la maggior parte dei metodi sono limitati dalla complessità e dai costi elevati. Quindi, il presente studio propone un metodo di somministrazione hiPSC-CM riproducibile, conveniente, relativamente invasivo ed efficace.
L'iniezione di cellule intramiocardiche guidata da ultrasuoni può essere eseguita solo con una piccola ecografia veterinaria ad alta risoluzione e un microiniettore, indipendentemente dal sito. Sotto la guida ecografica, la consegna diretta delle cellule sotto il processo xifoideo dal pericardio al miocardio nei topi è un protocollo sicuro che evita danni al fegato e ai polmoni. Questo metodo può essere combinato contemporaneamente ad altre tecnologie per migliorare significativamente il tasso di sopravvivenza delle cellule trapiantate.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarcomeric alpha actinin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(minus insulin)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(serum free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17&#8211;504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SDHT10132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>CT99021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclosporin A</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-B0579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIRECT RED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>365548-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST GREEN FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green MasterMix kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound coupling agent</td>
			<td>CARENT</td>
			<td>22396269389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S6390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Real-Time PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluoresence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine anatomical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine dissecting forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>MATRX</td>
			<td>VMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system</td>
			<td>VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Product and Service Solutions</td>
			<td>IBM</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mitochondrial DNA primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the forward primer sequence</td>
			<td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the reverse primer sequence</td>
			<td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice

L'obiettivo chiave della terapia cellulare dopo infarto miocardico (IM) è quello di migliorare efficacemente il tasso di innesto cellulare e i cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC-CM) sono una fonte cellulare promettente per la riparazione cardiaca dopo danno ischemico. Tuttavia, un basso tasso di innesto è un ostacolo significativo per un'efficace rigenerazione del tessuto cardiaco dopo il trapianto. Questo protocollo mostra che più iniezioni percutanee guidate da ultrasuoni hiPSC-CM in un'area MI aumentano efficacemente i tassi di trapianto cellulare. Lo studio descrive anche l'intero processo di coltura hiPSC-CM, il pretrattamento e i metodi di somministrazione percutanea ecoguidati. Inoltre, l'uso del DNA mitocondriale umano aiuta a rilevare l'assenza di hiPSC-CM in altri organi del topo. Infine, questo articolo descrive i cambiamenti nella funzione cardiaca, nell'angiogenesi, nelle dimensioni delle cellule e nell'apoptosi nella zona di confine infartuato nei topi 4 settimane dopo il parto cellulare. Si può concludere che l'iniezione percutanea guidata dall'ecocardiografia del miocardio ventricolare sinistro è una terapia cellulare fattibile, relativamente invasiva, soddisfacente, ripetibile ed efficace.

L'ecocardiografia per la valutazione della funzione ventricolare sinistra dei topi in ciascun gruppo ha rivelato che le lesioni dell'infarto miocardico erano effettivamente invertite nel gruppo MD (Figura 2A). Rispetto al gruppo MI (MI), il gruppo SD ha mostrato un aumento della frazione di eiezione (EF) (dal 30% al 35%; Figura 2B) e accorciamento frazionario (FS) (dal 18% al 22%; Figura 2C) dopo MI. Tuttavia, è ancora più crucial...

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Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

La somministrazione cellulare guidata da ultrasuoni intorno al sito di infarto miocardico nei topi è un modo sicuro, efficace e conveniente di trapianto cellulare.

Impianto di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte ecoguidate in topi infartuati miocardici

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Questo è il primo rapporto che dimostra che l'iniezione intramiocardica percutanea guidata dall'ecocardiografia dei cardiomiociti migliora significativamente la proprietà riparativa dei cardiomiociti umani derivati da iPS. Questo metodo è fattibile, soddisfacente, ripetibile, meno invasivo ed efficace procedura per la somministrazione di cardiomiociti umani derivati da iPS. Riteniamo che la somministrazione intramiocardica percutanea sia un metodo sicuro ed efficiente per la somministrazione locale di farmaci per malattie tra cui cardiopatia ischemica, infarto miocardico e insufficienza cardiaca.Questo progetto è supervisionato dal professor Jinfu Yang e dal professor Jun Peng. A dimostrare la procedura saranno Xun Wu, Kele Qin e Kun Xiang, MD PhDs dal mio laboratorio e Di Wang, un dottorato di ricerca dal laboratorio chiave provinciale di Hunan di ricerca cardiovascolare. Per iniziare, aspirare sottovuoto il surnatante di coltura da una coltura di 60 giorni di hiPSC-CMs.Lavare le cellule con PBS tre volte. Quindi dissociare gli hiPSC-CM in singole cellule usando la miscela enzimatica di distacco cellulare a 37 gradi Celsius per tre-cinque minuti. Raccogliere le celle in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di RPMI più B27 mezzo e mescolare.Contare le celle e calcolare il numero totale di celle. Centrifugare la sospensione cellulare a 300G per due minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet nel mezzo di supporto dei cardiomiociti ad una concentrazione di 6 x 10 delle 4 cellule per microlitro.Posizionare il tubo a 37 gradi Celsius fino alla fase di iniezione. Dopo che il mouse è sufficientemente anestetizzato, fissare gli arti e la coda con del nastro adesivo. Quindi, fissare gli incisivi del mouse con un filo di seta 2/0 e del nastro adesivo.Sterilizzare il collo mediano e il torace sinistro con tre cicli alternati di betaina seguiti da alcol. Fai un'incisione mediana del collo usando forbici anatomiche sottili e pinze da dissezione fine. Tagliare alcuni muscoli cervicali anteriori per stabilizzare ed esporre completamente la trachea.Inserire un ago per puntura del catetere di calibro 20 come tubo tracheale attraverso la bocca. Collegare il tubo tracheale al ventilatore e controllare il movimento toracico per assicurarsi che entrambi i polmoni siano ben ventilati. Regola i parametri respiratori.Quindi, rifissare l'arto posteriore sinistro sul lato inferiore destro e allentare il nastro attorno all'arto superiore sinistro. Con sottili forbici e pinze da dissezione, eseguire una toracotomia nello spazio intercostale da tre a quattro del torace sinistro. Usando una pinza, staccare il pericardio e individuare l'arteria coronaria discendente anteriore sinistra.Utilizzare un filo di seta 6/0 per legare l'estremità prossimale dell'arteria. Per garantire che il modello di infarto miocardico acuto sia stabilito, attendere che il lato distale dell'arteria nel sito di legatura cambi da rosso a bianco. Chiudere il torace strato per strato e suturare la pelle con filo 4/0.Per il gruppo fittizio di animali, eseguire tutte le procedure chirurgiche ad eccezione della legatura. Nelle prime due settimane dopo l'infarto miocardico, posizionare i topi in una scatola per anestesia collegata con isofluorano al 5% ed eseguire l'intubazione tracheale. Tre giorni prima della somministrazione di hiPSC-CMs, iniettare ciclosporina A nella cavità intraperitoneale alla dose di 10 milligrammi per chilogrammo al giorno.Rimuovere i peli dal petto e dall'addome superiore del topo con crema depilatoria. Inalazione di alimentazione isofluorano fino a quando la frequenza cardiaca è mantenuta a 400 a 500 battiti al minuto. Fissare gli arti e la coda del mouse con del nastro adesivo sulla console di rilevamento e impostare la temperatura della piattaforma a 37 gradi Celsius.Applicare la gelatina ad ultrasuoni sulla parte superiore dell'addome. Utilizzando una sonda ecografica veterinaria ad alta risoluzione, ottenere immagini del fegato del topo. Utilizzando una micro siringa da cinque microlitri, aspirare circa 3 x 10 al 5 ° hiPSC-CMs.Tenere la siringa e inserire un ago da tre millimetri nel processo paraxifoideo sinistro. Sotto guida ecografica, seguire il bordo superiore del diaframma. Osservare il ritmo respiratorio e la gamma.Entra nel pericardio alla fine del cerchio espiratorio, evitando danni al fegato e ai polmoni. Quindi acquisire l'immagine dell'asse lungo parasternale del cuore del topo mediante ecocardiografia in modalità B. Sotto guida ultrasonica, iniettare 1 x 10 alle cellule 5th hiPSC-CMs in ciascuna delle tre aree marginali del sito di infarto.Rimuovere la sonda ad ultrasuoni e risciacquare la gelatina. Svezzare il topo dall'anestesia e riportarlo nella sua gabbia. Iniettare ciclosporina A continuamente per un mese dopo il trapianto.L'ecocardiogramma del ventricolo sinistro ha mostrato che le lesioni dovute all'infarto miocardico sono state invertite nel gruppo a dosi multiple. Il trapianto di hiPSC-CMs ha anche comportato un aumento della frazione di eiezione e un accorciamento della frazione. La misurazione dei parametri cardiaci utilizzando la colorazione Sirius Red e Fast Green ha mostrato che la dimensione dell'infarto e la frazione di volume del collagene sono diminuite, mentre lo spessore della parete anteriore ventricolare sinistra è aumentato dopo il trapianto.L'etichettatura per l'alfa actina non specifica in verde, DAPI in blu e troponina T specifica per l'uomo in rosso ha mostrato la presenza di cellule trapiantate nell'infarto e nell'area marginale dell'infarto. Il numero e la percentuale di cellule trapiantate erano più alti nel gruppo a dose multipla rispetto alla dose singola. 28 giorni dopo l'infarto miocardico, il gruppo a dosi multiple ha mostrato un aumento del numero di cellule che esprimono il marcatore delle cellule endoteliali, I-B4.L'agglutinina del germe di grano e la colorazione dell'alfa actinina sarcomerica sui cardiomiociti hanno mostrato una riduzione del diametro minimo della fibra. Un numero inferiore di nuclei di cardiomiociti positivi al tunnel nel gruppo a dose multipla ha indicato una riduzione dell'apoptosi. L'analisi PCR ha rilevato il DNA mitocondriale umano solo nel cuore, mostrando un trapianto specifico.Quando si inserisce l'ago, assicurarsi che entri nella cavità pericardica insieme al margine superiore del diaframma e alla fine del cerchio espiratorio per evitare lesioni al fegato o al polmone.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

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Ricerca

Medicina

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Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

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