Name: ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo Plano de Pesquisa Principal da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 91539111to JY), Projeto Chave de Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (No. 2020SK53420 para JY) e pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia da Província de Hunan (2021RC2106 para CF).

Todos os experimentos com animais neste estudo foram revisados e aprovados pelo comitê de ética do Segundo Hospital Xiangya da Universidade Central Sul. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais e equipamentos utilizados neste protocolo. Os prazos para injeção celular, imagem e eutanásia são os seguintes: t0- induzir infarto, t1 semana- imagem e implante de células, t2 semanas- imagem e implante de células, t4 semanas- imagem final, eutanásia e coleta de tecido....

<ol>
	<li>Leuschner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+monocyte+kinetics+in+acute+myocardial+infarction+are+sustained+by+extramedullary+monocytopoiesis.">Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).</li><li>L&#225;z&#225;r, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Davis, M. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+myocardial+remuscularization.">Translating myocardial remuscularization.</a> Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+investigation+of+hypoxia-preconditioned+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+myocardial+repair+in+nonhuman+primates:+Paracrine+activity+without+remuscularization.">A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization.</a> Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).</li><li>Kempf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture.">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts.">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts.">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li><li>Nguyen, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+strategies+to+address+the+major+clinical+barriers+facing+stem+cell+regenerative+therapy+for+cardiovascular+disease:+A+review.">Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review.</a> JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remuscularization+of+the+failing+heart.">Remuscularization of the failing heart.</a> The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+hypoxia-preconditioned+mesenchymal+stem+cells+improves+infarcted+heart+function+via+enhanced+survival+of+implanted+cells+and+angiogenesis.">Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+improves+Sca-1++stem+cell+survival+and+directs+ischemic+cardiomyocytes+toward+a+prosurvival+phenotype+via+exosomal+transfer:+a+critical+role+for+HSF1/miR-34a/HSP70+pathway.">Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway.</a> Stem Cells. 32 (2), 462-472 (2014).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+CCND2-overexpressing+human+induced-pluripotent+stem+cells+repopulate+the+myocardial+scar+in+mice:+A+6-month+study.">Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+microvessels+improve+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocyte+engraftment+and+cardiac+function+after+infarction+in+rats.">Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats.</a> Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+echocardiography-guided+multiple+percutaneous+left+ventricular+intramyocardial+injection+of+hiPSC-CMs+after+myocardial+infarction.">Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+competent+DNA+damage-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+myocardial+repair.">Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair.</a> Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+preconditioning+enhances+transplantation+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction+mice.">Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice.</a> Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+engraftment+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+via+a+transient+inhibition+of+rho+kinase+activity.">Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+revisited:+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).</li><li>Rainer, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-specific+transforming+growth+factor+&#946;+suppression+blocks+neutrophil+infiltration,+augments+multiple+cytoprotective+cascades,+and+reduces+early+mortality+after+myocardial+infarction.">Cardiomyocyte-specific transforming growth factor &#946; suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocyte+therapy+in+mouse+permanent+ischemia+and+ischemia-reperfusion+models.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 167 (2019).</li><li>Iwanaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+G-CSF+on+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+swine.">Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).</li></ol>

As etapas críticas deste estudo incluem cultura de hiPSC, diferenciação de cardiomiócitos, purificação de hiPSC-CM e transplante de hiPSC-CM no local do infarto do miocárdio de camundongos. A chave é usar o ultrassom cardíaco para guiar transcutaneamente o tratamento em direção ao local do infarto na borda do infarto, onde os MC-hiPSC foram injetados na área.
Com o prolongamento do tempo de cultura, o fenótipo hiPSC-CM muda na morfologia (maior tamanho celular), estrutura (múscul...

Quando ocorre IAM agudo, as células miocárdicas na área infartada morrem rapidamente devido à isquemia e hipóxia. Vários fatores inflamatórios são liberados após a morte e ruptura celular, enquanto as células inflamatórias infiltram o local do infarto para causar inflamação1. Significativamente, fibroblastos e colágeno, ambos sem contratilidade e condutividade elétrica, substituem as células miocárdicas no local infartado para formar tecido cicatricial. Devido à limitada capacidade de regeneração dos cardiomiócitos em mamíferos adultos, o tecido viável formado após uma grande área de infarto geralmente não é adequado para manter débito cardíaco suficiente2. O IM causa insuficiência cardíaca e, em casos graves de insuficiência cardíaca, os pacientes só podem contar com transplantes cardíacos ou dispositivos de assistência ventricular para manter as funções cardíacas normais 3,4.
Após o IM, a estratégia ideal de tratamento é substituir os cardiomiócitos mortos por cardiomiócitos neoformados, formando acoplamento eletromecânico com tecidos normais. No entanto, as opções de tratamento têm tipicamente adotado o salvamento miocárdico em vez da reposição. Atualmente, as terapias baseadas em células-tronco e células progenitoras estão entre as estratégias mais promissoras para promover o reparo miocárdico após oIM5. Entretanto, o transplante dessas células apresenta vários problemas, principalmente a incapacidade das células-tronco adultas de se diferenciarem em cardiomiócitos e seu curto tempo de vida6.
As questões éticas relacionadas ao uso de células-tronco embrionárias (ES) podem ser contornadas pelas iPSCs, que são uma fonte promissora de células. Além disso, as iPSCs possuem forte capacidade de autorrenovação e podem se diferenciar em cardiomiócitos7. Estudos têm demonstrado que os MC-hiPSC transplantados para o sítio do IM podem sobreviver e formar junções comunicantes com as células do hospedeiro 8,9. Entretanto, como essas células transplantadas estão localizadas no microambiente de isquemia e inflamação, sua taxa de sobrevida é extremamentebaixa10,11.
Vários métodos têm sido estabelecidos para melhorar a sobrevida das células transplantadas, como o pré-tratamento com hipóxia e choque térmico das células transplantadas12,13, a modificação genética 14,15 e o transplante simultâneo de células e capilares 16. Infelizmente, a maioria dos métodos é limitada pela complexidade e alto custo. Assim, o presente estudo propõe um método de administração de hiPSC-CM reprodutível, conveniente, relativamente invasivo e eficaz.
A injeção intramiocárdica de células intramiocárdicas guiada por ultrassom pode ser realizada apenas com um pequeno aparelho de ultrassom veterinário de alta resolução e um microinjetor, independentemente do local. Sob orientação ultrassonográfica, a entrega direta de células sob o processo xifoide do pericárdio para o miocárdio em camundongos é um protocolo seguro que evita danos hepáticos e pulmonares. Este método pode ser combinado simultaneamente com outras tecnologias para melhorar significativamente a taxa de sobrevivência das células transplantadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarcomeric alpha actinin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(minus insulin)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(serum free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17&#8211;504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SDHT10132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>CT99021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclosporin A</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-B0579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIRECT RED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>365548-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST GREEN FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green MasterMix kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound coupling agent</td>
			<td>CARENT</td>
			<td>22396269389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S6390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Real-Time PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluoresence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine anatomical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine dissecting forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>MATRX</td>
			<td>VMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system</td>
			<td>VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Product and Service Solutions</td>
			<td>IBM</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mitochondrial DNA primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the forward primer sequence</td>
			<td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the reverse primer sequence</td>
			<td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice

O principal objetivo da terapia celular após o infarto do miocárdio (IM) é aumentar efetivamente a taxa de enxertos celulares, e os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) são uma fonte promissora de células para reparo cardíaco após dano isquêmico. No entanto, uma baixa taxa de enxertos é um obstáculo significativo para a regeneração efetiva do tecido cardíaco após o transplante. Esse protocolo mostra que múltiplas injeções percutâneas guiadas por ultrassom hiPSC-CM em uma área de IM efetivamente aumentam as taxas de transplante celular. O estudo também descreve todo o processo de cultura de hiPSC-CM, pré-tratamento e métodos de parto percutâneo guiados por ultrassom. Além disso, o uso de DNA mitocondrial humano ajuda a detectar a ausência de hiPSC-CMs em outros órgãos de camundongos. Finalmente, este trabalho descreve as alterações na função cardíaca, angiogênese, tamanho celular e apoptose na zona borda infartada em camundongos 4 semanas após a entrega celular. Pode-se concluir que a injeção percutânea do miocárdio ventricular esquerdo guiada por ecocardiografia é uma terapia celular factível, relativamente invasiva, satisfatória, repetível e eficaz.

O ecocardiograma para avaliação da função ventricular esquerda dos camundongos de cada grupo revelou que as lesões do IM foram efetivamente revertidas no grupo DM (Figura 2A). Em comparação com o grupo IM, o grupo SD apresentou aumento da fração de ejeção (FE) (de 30% para 35%; Figura 2B) e fração de encurtamento (EF) (de 18% para 22%; Figura 2C) após IM. No entanto, é ainda mais crucial notar que múltiplas injeçõe...

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Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

A entrega celular guiada por ultrassom ao redor do local do infarto do miocárdio em camundongos é uma maneira segura, eficaz e conveniente de transplante de células.

Implante de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos por Ultrassom em Camundongos Infartados do Miocárdio

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Este é o primeiro relato demonstrando que a injeção intramiocárdica percutânea de cardiomiócitos guiada por ecocardiografia aumenta significativamente a propriedade reparadora dos cardiomiócitos humanos derivados de iPS. Este método é factível, satisfatório, repetível, menos invasivo e eficaz para administrar terapia humana com cardiomiócitos derivados de iPS. Acreditamos que a administração intramiocárdica percutânea é um método seguro e eficaz para a administração local de drogas para doenças que incluem cardiopatia isquêmica, infarto do miocárdio e insuficiência cardíaca.Este projeto é supervisionado pelo Professor Jinfu Yang e pelo Professor Jun Peng. Demonstrando o procedimento estarão Xun Wu, Kele Qin e Kun Xiang, MD PhDs do meu laboratório e Di Wang, PhD do Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research. Para começar, aspirar a vácuo o sobrenadante da cultura a partir de uma cultura de 60 dias de hiPSC-CMs.Lave as células com PBS três vezes. Em seguida, dissociar os hiPSC-CMs em células individuais usando a mistura de enzimas de desprendimento celular a 37 graus Celsius por três a cinco minutos. Recolher as células num tubo de 15 mililitros contendo cinco mililitros de RPMI mais meio B27 e misturar.Conte as células e calcule o número total de células. Centrifugar a suspensão celular a 300G por dois minutos à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em meio suporte de cardiomiócitos até uma concentração de 6 x 10 das 4ª células por microlitro.Coloque o tubo a 37 graus Celsius até a etapa de injeção. Depois que o camundongo estiver suficientemente anestesiado, fixe os membros e a cauda com fita adesiva. Em seguida, fixe os incisivos do mouse com um fio de seda 2/0 e fita.Esterilizar a região mediana do pescoço e tórax esquerdo com três rodadas alternadas de betaína seguidas de álcool. Faça uma incisão cervical mediana usando tesoura anatômica fina e pinça dissecante fina. Corte alguns músculos cervicais anteriores para estabilizar e expor totalmente a traqueia.Insira uma agulha de punção com cateter de calibre 20 como um tubo traqueal pela boca. Conecte o tubo traqueal ao ventilador e verifique se há movimento torácico para garantir que ambos os pulmões estejam bem ventilados. Ajuste os parâmetros respiratórios.Em seguida, refixe o membro posterior esquerdo para o lado inferior direito e solte a fita ao redor do membro superior esquerdo. Com tesoura e pinça dissecante fina, realizar toracotomia nos três a quatro espaços intercostais do tórax esquerdo. Com o uso de pinças, descascar o pericárdio e localizar a artéria coronária descendente anterior.Use um fio de seda 6/0 para ligar a extremidade proximal da artéria. Para garantir que o modelo de infarto agudo do miocárdio seja estabelecido, aguarde até que o lado distal da artéria no local da ligadura mude de vermelho para branco. Fechar o tórax camada por camada e suturar a pele com fio 4/0.Para o grupo de animais simulados, realizar todos os procedimentos cirúrgicos, exceto a ligadura. Nas duas primeiras semanas após o infarto do miocárdio, coloque os camundongos em uma caixa de anestesia conectada com isofluorano a 5% e realize a intubação traqueal. Três dias antes da administração de hiPSC-CMs, injetar ciclosporina A na cavidade intraperitoneal na dose de 10 miligramas por quilograma por dia.Retire os pelos do peito e abdômen superior do rato com creme depilatório. Fornecimento de isofluorano inalatório até que a frequência cardíaca seja mantida em 400 a 500 batimentos por minuto. Fixe os membros e a cauda do mouse com fita adesiva no console de detecção e defina a temperatura da plataforma em 37 graus Celsius.Aplique a geleia de ultrassom na parte superior do abdômen. Usando uma sonda de ultrassom veterinário de alta resolução, obtenha imagens do fígado de camundongos. Com uma microseringa de cinco microlitros, sorteie aproximadamente 3 x 10 até o 5º hiPSC-CMs.Segure a seringa e insira uma agulha de três milímetros no processo paraxifóide esquerdo. Sob orientação ultrassonográfica, siga a borda superior do diafragma. Observe o ritmo e a amplitude respiratória.Entre no pericárdio no final do círculo expiratório, evitando danos ao fígado e ao pulmão. Em seguida, adquira a imagem paraesternal do eixo longo do coração de camundongos por ecocardiografia modo B. Sob orientação ultra-sônica, injetar 1 x 10 nas células do 5º hiPSC-CMs em cada uma das três áreas marginais do local do infarto.Retire a sonda de ultrassom e enxágue a geleia. Desmame o rato da anestesia e devolva-o à sua gaiola. Injetar ciclosporina A continuamente por um mês após o transplante.O ecocardiograma do ventrículo esquerdo mostrou que as lesões por infarto do miocárdio foram revertidas no grupo de dose múltipla. O transplante de MC-hiPSC também resultou em aumento da fração de ejeção e encurtamento da fração. A mensuração dos parâmetros cardíacos pelas colorações Sirius Red e Fast Green mostrou que o tamanho do infarto e a fração de volume de colágeno diminuíram, enquanto a espessura da parede anterior do ventrículo esquerdo aumentou após o transplante.A marcação para alfa actina inespecífica em verde, DAPI em azul e troponina T específica para humanos em vermelho mostrou a presença de células transplantadas na área de infarto e infarto marginal. O número e a porcentagem de células transplantadas foram maiores no grupo de dose múltipla em comparação com a dose única. 28 dias após o infarto do miocárdio, o grupo de dose múltipla apresentou aumento no número de células expressando o marcador de células endoteliais, I-B4.A coloração de aglutinina do germe de trigo e alfa actinina sarcomérica nos cardiomiócitos mostrou redução no diâmetro mínimo da fibra. Menor número de núcleos de cardiomiócitos túnel positivos no grupo de dose múltipla indicou redução da apoptose. A análise por PCR detectou o DNA mitocondrial humano apenas no coração, mostrando transplante específico.Ao inserir a agulha, certifique-se de que ela entre na cavidade pericárdica junto com a margem superior do diafragma e no final do círculo expiratório para evitar a lesão no fígado ou no pulmão.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantação de um Cuff Carotid para Triggering Shear-estresse aterosclerose induzida em camundongos

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Medicina

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Isolamento dos núcleos dos cardiomiócitos a partir de Post-mortem de tecidos

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Guiada por ultra-som transtorácica intramiocárdico Injection em Ratos

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Substernal Tireóide Biópsia Usando endobrônquica guiada por ultrassom transbrônquica Punção Aspirativa por Agulha

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Tratamento orientado e seletivo de Teratomas células-tronco derivadas de pluripotentes usando radiação de feixe externo em um modelo animal de pequeno

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

Um modelo Crioferimento para estudar infarto do miocárdio no mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Encurtamento sarcomere de Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes usando Proteínas Sarcomere marcadas por fluorescentes.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Endoscopic Ultrasound-Guided Biliary Drainage: Endoscopic Ultrasound-Guided Hepaticogastrostomy in Malignant Biliary Obstruction

Drenagem biliar guiada por ultrassom endoscópico: Hepaticogastrostomia Guiada por Ultrassom Endoscópico em Obstrução Biliar Maligna

Patients with unresectable malignant biliary obstruction often require biliary drainage to decompress the biliary system. Endoscopic Retrograde ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Indução de Infarto do Miocárdio e Lesão de Isquemia-Reperfusão Miocárdica em Camundongos

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...