Name: ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice
Uploaded: 2022-03-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el Plan de Investigación Principal de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 91539111a JY), el Proyecto Clave de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Hunan (No. 2020SK53420 a JY) y el Programa de Innovación Científica y Tecnológica de la Provincia de Hunan (2021RC2106 a CF).

Todos los experimentos con animales en este estudio fueron revisados y aprobados por el comité de ética del Segundo Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales y equipos utilizados en este protocolo. Los plazos para la inyección celular, la imagen y la eutanasia son los siguientes: t0- inducir infarto, t1 semana- imagen y células de implante, t2 semanas- imagen y células de implante, t4 semanas- imagen final, eu...

<ol>
	<li>Leuschner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+monocyte+kinetics+in+acute+myocardial+infarction+are+sustained+by+extramedullary+monocytopoiesis.">Rapid monocyte kinetics in acute myocardial infarction are sustained by extramedullary monocytopoiesis.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (1), 123-137 (2012).</li><li>L&#225;z&#225;r, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte+renewal+in+the+human+heart:+insights+from+the+fall-out.">Cardiomyocyte renewal in the human heart: insights from the fall-out.</a> European Heart Journal. 38 (30), 2333-2342 (2017).</li><li>Davis, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State+of+the+art:+cardiac+transplantation.">State of the art: cardiac transplantation.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. 24 (8), 341-349 (2014).</li><li>Mancini, D., Colombo, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Left+ventricular+assist+devices:+A+rapidly+evolving+alternative+to+transplant.">Left ventricular assist devices: A rapidly evolving alternative to transplant.</a> Journal of the American College of Cardiology. 65 (23), 2542-2555 (2015).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+myocardial+remuscularization.">Translating myocardial remuscularization.</a> Circulation Research. 120 (2), 278-281 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large-scale+investigation+of+hypoxia-preconditioned+allogeneic+mesenchymal+stem+cells+for+myocardial+repair+in+nonhuman+primates:+Paracrine+activity+without+remuscularization.">A large-scale investigation of hypoxia-preconditioned allogeneic mesenchymal stem cells for myocardial repair in nonhuman primates: Paracrine activity without remuscularization.</a> Circulation Research. 118 (6), 970-983 (2016).</li><li>Kempf, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+scalable+suspension+culture.">Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells in scalable suspension culture.</a> Nature Protocols. 10 (9), 1345-1361 (2015).</li><li>Chong, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic-stem-cell-derived+cardiomyocytes+regenerate+non-human+primate+hearts.">Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts.</a> Nature. 510 (7504), 273-277 (2014).</li><li>Shiba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allogeneic+transplantation+of+iPS+cell-derived+cardiomyocytes+regenerates+primate+hearts.">Allogeneic transplantation of iPS cell-derived cardiomyocytes regenerates primate hearts.</a> Nature. 538 (7625), 388-391 (2016).</li><li>Nguyen, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+strategies+to+address+the+major+clinical+barriers+facing+stem+cell+regenerative+therapy+for+cardiovascular+disease:+A+review.">Potential strategies to address the major clinical barriers facing stem cell regenerative therapy for cardiovascular disease: A review.</a> JAMA Cardiology. 1 (8), 953-962 (2016).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remuscularization+of+the+failing+heart.">Remuscularization of the failing heart.</a> The Journal of Physiology. 595 (12), 3685-3690 (2017).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+hypoxia-preconditioned+mesenchymal+stem+cells+improves+infarcted+heart+function+via+enhanced+survival+of+implanted+cells+and+angiogenesis.">Transplantation of hypoxia-preconditioned mesenchymal stem cells improves infarcted heart function via enhanced survival of implanted cells and angiogenesis.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 135 (4), 799-808 (2008).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+improves+Sca-1++stem+cell+survival+and+directs+ischemic+cardiomyocytes+toward+a+prosurvival+phenotype+via+exosomal+transfer:+a+critical+role+for+HSF1/miR-34a/HSP70+pathway.">Heat shock improves Sca-1+ stem cell survival and directs ischemic cardiomyocytes toward a prosurvival phenotype via exosomal transfer: a critical role for HSF1/miR-34a/HSP70 pathway.</a> Stem Cells. 32 (2), 462-472 (2014).</li><li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocytes+from+CCND2-overexpressing+human+induced-pluripotent+stem+cells+repopulate+the+myocardial+scar+in+mice:+A+6-month+study.">Cardiomyocytes from CCND2-overexpressing human induced-pluripotent stem cells repopulate the myocardial scar in mice: A 6-month study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 137, 25-33 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplanted+microvessels+improve+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocyte+engraftment+and+cardiac+function+after+infarction+in+rats.">Transplanted microvessels improve pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte engraftment and cardiac function after infarction in rats.</a> Science Translational Medicine. 12 (562), (2020).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+repair+with+echocardiography-guided+multiple+percutaneous+left+ventricular+intramyocardial+injection+of+hiPSC-CMs+after+myocardial+infarction.">Cardiac repair with echocardiography-guided multiple percutaneous left ventricular intramyocardial injection of hiPSC-CMs after myocardial infarction.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 768873 (2021).</li><li>Kannappan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+competent+DNA+damage-free+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+for+myocardial+repair.">Functionally competent DNA damage-free induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for myocardial repair.</a> Circulation. 140 (6), 520-522 (2019).</li><li>Lou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-cadherin+overexpression+enhances+the+reparative+potency+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+myocytes+in+infarcted+mouse+hearts.">N-cadherin overexpression enhances the reparative potency of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocytes in infarcted mouse hearts.</a> Cardiovascular Research. 116 (3), 671-685 (2020).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Y-27632+preconditioning+enhances+transplantation+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+in+myocardial+infarction+mice.">Y-27632 preconditioning enhances transplantation of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in myocardial infarction mice.</a> Cardiovascular Research. 115 (2), 343-356 (2019).</li><li>Zhao, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+the+engraftment+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+via+a+transient+inhibition+of+rho+kinase+activity.">Enhancing the engraftment of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes via a transient inhibition of rho kinase activity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59452 (2019).</li><li>O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+and+analysis+of+cell+counting+procedures+using+ImageJ+plugins.">Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719 (2016).</li><li>Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+revisited:+inflammation+versus+resolution+of+inflammation+following+myocardial+infarction.">Inflammation revisited: inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction.</a> Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).</li><li>Rainer, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiomyocyte-specific+transforming+growth+factor+&#946;+suppression+blocks+neutrophil+infiltration,+augments+multiple+cytoprotective+cascades,+and+reduces+early+mortality+after+myocardial+infarction.">Cardiomyocyte-specific transforming growth factor &#946; suppression blocks neutrophil infiltration, augments multiple cytoprotective cascades, and reduces early mortality after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 114 (8), 1246-1257 (2014).</li><li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocyte+therapy+in+mouse+permanent+ischemia+and+ischemia-reperfusion+models.">Human embryonic stem cell-derived cardiomyocyte therapy in mouse permanent ischemia and ischemia-reperfusion models.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 167 (2019).</li><li>Iwanaga, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+G-CSF+on+cardiac+remodeling+after+acute+myocardial+infarction+in+swine.">Effects of G-CSF on cardiac remodeling after acute myocardial infarction in swine.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 325 (4), 1353-1359 (2004).</li></ol>

Los pasos críticos de este estudio incluyen cultivo de hiPSC, diferenciación de cardiomiocitos, purificación de hiPSC-CM y trasplante de hiPSC-CM en el sitio de infarto de miocardio de ratón. La clave es usar ultrasonido cardíaco para guiar transcutáneamente el tratamiento hacia el sitio del infarto en el borde del infarto donde se inyectaron hiPSC-CM en el área.
Con la prolongación del tiempo de cultivo, el fenotipo hiPSC-CM cambia en morfología (mayor tamaño celular), estructura (m...

Cuando se produce un infarto agudo de miocardio, las células del miocardio en el área infartada mueren rápidamente debido a la isquemia y la hipoxia. Varios factores inflamatorios se liberan después de la muerte celular y la ruptura, mientras que las células inflamatorias se infiltran en el sitio infartado para causar inflamación1. Significativamente, los fibroblastos y el colágeno, ambos sin contractilidad y conductividad eléctrica, reemplazan las células miocárdicas en el sitio infartado para formar tejido cicatricial. Debido a la limitada capacidad de regeneración de los cardiomiocitos en mamíferos adultos, el tejido viable formado después de una gran área de infarto generalmente no es adecuado para mantener un gasto cardíaco suficiente2. El IM causa insuficiencia cardíaca, y en casos severos de insuficiencia cardíaca, los pacientes solo pueden confiar en trasplantes cardíacos o dispositivos de asistencia ventricular para mantener las funciones cardíacas normales 3,4.
Después del IM, la estrategia de tratamiento ideal es reemplazar los cardiomiocitos muertos con cardiomiocitos recién formados, formando acoplamiento electromecánico con tejidos sanos. Sin embargo, las opciones de tratamiento generalmente han adoptado el rescate miocárdico en lugar del reemplazo. Actualmente, las terapias basadas en células madre y células progenitoras se encuentran entre las estrategias más prometedoras para promover la reparación del miocardio después de la MI5. Sin embargo, el trasplante de estas células tiene varios problemas, principalmente la incapacidad de las células madre adultas para diferenciarse en cardiomiocitos y su corta vidaútil 6.
Las cuestiones éticas relacionadas con el uso de células madre embrionarias (ES) pueden ser eludidas por las iPSC, que son una fuente prometedora de células. Además, las iPSCs poseen fuertes capacidades de auto-renovación y pueden diferenciarse en cardiomiocitos7. Los estudios han demostrado que los hiPSC-CM trasplantados en el sitio IM pueden sobrevivir y formar uniones de brecha con las células huésped 8,9. Sin embargo, debido a que estas células trasplantadas se encuentran en el microambiente de la isquemia y la inflamación, su tasa de supervivencia es extremadamente baja10,11.
Se han establecido varios métodos para mejorar la tasa de supervivencia de las células trasplantadas, como el pretratamiento de hipoxia y choque térmico de células trasplantadas12,13, la modificación genética 14,15 y el trasplante simultáneo de células y capilares 16. Desafortunadamente, la mayoría de los métodos están limitados por la complejidad y el alto costo. Por lo tanto, el presente estudio propone un método de administración de hiPSC-CM reproducible, conveniente, relativamente invasivo y efectivo.
La inyección de células intramiocárdicas guiada por ultrasonido se puede llevar a cabo solo con una pequeña máquina de ultrasonido veterinario de alta resolución y un microinyector, independientemente del sitio. Bajo la guía de ultrasonido, la entrega directa de células bajo el proceso xifoide desde el pericardio al miocardio en ratones es un protocolo seguro que evita el daño hepático y pulmonar. Este método se puede combinar simultáneamente con otras tecnologías para mejorar significativamente la tasa de supervivencia de las células trasplantadas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 555)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human cardiac troponin T</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab91605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B4</td>
			<td>Vector</td>
			<td>FL-1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarcomeric alpha actinin</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab9465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat germ agglutinin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>00-4555-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(minus insulin)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1895601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement(serum free)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17&#8211;504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bouin&#39;s solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SDHT10132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>CT99021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclosporin A</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-B0579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DIRECT RED</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>365548-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNeasy Blood &#38; Tissue Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FAST GREEN FCF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;F7252-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose-free RPMI 1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11879020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IWR1</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S7086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>BD356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O.C.T. Compound</td>
			<td>SAKURA</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerUP SYBR Green MasterMix kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A25742</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11875119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdif Cardiomyocyte Freezing Medium/STEMdiff</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEMdiff Cardiomyocyte Support Medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasound coupling agent</td>
			<td>CARENT</td>
			<td>22396269389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S6390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and Supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>7500 Real-Time PCR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluoresence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine anatomical scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine dissecting forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7633</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small animal anesthesia machine</td>
			<td>MATRX</td>
			<td>VMR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-high resolution small animal ultrasound imaging system</td>
			<td>VisualSonics</td>
			<td>Vevo 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical Product and Service Solutions</td>
			<td>IBM</td>
			<td>21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>NIH</td>
			<td>1.48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mitochondrial DNA primers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the forward primer sequence</td>
			<td>CCGCTACCATAATCATCGCTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>the reverse primer sequence</td>
			<td>TGCTAATACAATGCCAGTCAGG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ultrasound-guided induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte implantation in myocardial infarcted mice

El objetivo clave de la terapia celular después del infarto de miocardio (IM) es mejorar eficazmente la tasa de injerto celular, y los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) son una fuente celular prometedora para la reparación cardíaca después del daño isquémico. Sin embargo, una tasa baja de injertos es un obstáculo significativo para la regeneración efectiva del tejido cardíaco después del trasplante. Este protocolo muestra que múltiples inyecciones percutáneas guiadas por ultrasonido hiPSC-CM en un área de IM aumentan efectivamente las tasas de trasplante celular. El estudio también describe todo el proceso de cultivo de hiPSC-CM, el pretratamiento y los métodos de administración percutánea guiados por ultrasonido. Además, el uso de ADN mitocondrial humano ayuda a detectar la ausencia de hiPSC-CMs en otros órganos de ratón. Por último, este artículo describe los cambios en la función cardíaca, la angiogénesis, el tamaño celular y la apoptosis en la zona fronteriza infartada en ratones 4 semanas después de la entrega celular. Se puede concluir que la inyección percutánea guiada por ecocardiografía del miocardio ventricular izquierdo es una terapia celular factible, relativamente invasiva, satisfactoria, repetible y efectiva.

La ecocardiografía para la evaluación de la función ventricular izquierda de los ratones en cada grupo reveló que las lesiones de IM se revirtieron efectivamente en el grupo de DM (Figura 2A). En comparación con el grupo IM, el grupo SD mostró un aumento de la fracción de eyección (FE) (del 30% al 35%; Figura 2B) y acortamiento de fracciones (FS) (del 18% al 22%; Figura 2C) después de MI. Sin embargo, es aún más crucial t...

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Ultrasound-Guided Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocyte Implantation in Myocardial Infarcted Mice

La administración de células guiadas por ultrasonido alrededor del sitio del infarto de miocardio en ratones es una forma segura, efectiva y conveniente de trasplante de células.

Implantación de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducida por ultrasonido en ratones con infartado de miocardio

The key objective of cell therapy after myocardial infarction (MI) is to effectively enhance the cell grafted rate, and human induced pluripotent stem ...

Este es el primer informe que demuestra que la inyección intramiocárdica percutánea guiada por ecocardiografía de cardiomiocitos mejora significativamente la propiedad reparadora de los cardiomiocitos humanos derivados de iPS. Este método es un procedimiento factible, satisfactorio, repetible, menos invasivo y efectivo para administrar terapia de cardiomiocitos derivados de iPS humanos. Creemos que la administración intramiocárdica percutánea es un método seguro y eficiente para la administración local de medicamentos para enfermedades como la cardiopatía isquémica, el infarto de miocardio y la insuficiencia cardíaca.Este proyecto está supervisado por el profesor Jinfu Yang y el profesor Jun Peng. demostrando el procedimiento estarán Xun Wu, Kele Qin y Kun Xiang, MD PhDs de mi laboratorio y Di Wang, PhD del Laboratorio Provincial Provincial Clave de Investigación Cardiovascular de Hunan. Para comenzar, aspirar al vacío el sobrenadante de cultivo de un cultivo de 60 días de hiPSC-CMs.Lave las celdas con PBS tres veces. Luego disocie los hiPSC-CM en células individuales usando la mezcla de enzimas de desprendimiento celular a 37 grados centígrados durante tres a cinco minutos. Recoja las células en un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de RPMI más B27 medio y mezcle.Cuente las celdas y calcule el número total de celdas. Centrifugar la suspensión celular a 300G durante dos minutos a temperatura ambiente. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en medio de soporte de cardiomiocitos a una concentración de 6 x 10 de las 4ª células por microlitro.Coloque el tubo a 37 grados centígrados hasta el paso de inyección. Después de que el ratón esté suficientemente anestesiado, fije las extremidades y la cola con cinta adhesiva. Luego, fije los incisivos del mouse con un hilo de seda 2/0 y cinta adhesiva.Esterilice el cuello mediano y el pecho izquierdo con tres rondas alternas de betaína seguidas de alcohol. Haga una incisión mediana en el cuello usando tijeras anatómicas finas y pinzas de disección finas. Corte algunos músculos cervicales anteriores para estabilizar y exponer completamente la tráquea.Inserte una aguja de punción con catéter de calibre 20 como un tubo traqueal a través de la boca. Conecte el tubo traqueal al ventilador y verifique el movimiento torácico para asegurarse de que ambos pulmones estén bien ventilados. Ajuste los parámetros de respiración.A continuación, vuelva a fijar la extremidad posterior izquierda al lado inferior derecho y afloje la cinta alrededor de la extremidad superior izquierda. Con tijeras y fórceps de disección fina, realice una toracotomía en el espacio intercostal de tres a cuatro del tórax izquierdo. Con fórceps, despegue el pericardio y localice la arteria coronaria descendente anterior izquierda.Use un hilo de seda 6/0 para ligar el extremo proximal de la arteria. Para asegurarse de que se establece el modelo de infarto agudo de miocardio, espere hasta que el lado distal de la arteria en el sitio de ligadura cambie de rojo a blanco. Cierra el pecho capa por capa y sutura la piel con hilo 4/0.Para el grupo simulado de animales, realice todos los procedimientos quirúrgicos excepto la ligadura. En las primeras dos semanas después del infarto de miocardio, coloque a los ratones en una caja de anestesia conectada con isofluorano al 5% y realice la intubación traqueal. Tres días antes de administrar hiPSC-CMs, inyecte ciclosporina A en la cavidad intraperitoneal a una dosis de 10 miligramos por kilogramo por día.Retire el vello del pecho y la parte superior del abdomen del ratón con crema depilatoria. Suministre isofluorano por inhalación hasta que la frecuencia cardíaca se mantenga en 400 a 500 latidos por minuto. Fije las extremidades y la cola del ratón con cinta adhesiva en la consola de detección y ajuste la temperatura de la plataforma a 37 grados centígrados.Aplique la jalea de ultrasonido en la parte superior del abdomen. Usando una sonda de ultrasonido veterinario de alta resolución, obtenga imágenes de hígado de ratón. Usando una microjeringa de cinco microlitros, extraiga aproximadamente 3 x 10 a los 5º hiPSC-CM.Sostenga la jeringa e inserte una aguja de tres milímetros en el proceso paraxifoide izquierdo. Bajo la guía de ultrasonido, siga el borde superior del diafragma. Observe el ritmo respiratorio y el rango.Ingrese al pericardio al final del círculo espiratorio, evitando daños en el hígado y el pulmón. Luego adquiera la imagen paraesternal de eje largo del corazón del ratón mediante ecocardiografía en modo B. Bajo guía ultrasónica, inyecte 1 x 10 a las 5ª células hiPSC-CMs en cada una de las tres áreas marginales del sitio del infarto.Retire la sonda de ultrasonido y enjuague la gelatina. Destete al ratón de la anestesia y devuélvelo a su jaula. Inyecte ciclosporina A continuamente durante un mes después del trasplante.El ecocardiograma del ventrículo izquierdo mostró que las lesiones debidas al infarto de miocardio se revirtieron en el grupo de dosis múltiples. El trasplante de hiPSC-CM también dio lugar a un aumento de la fracción de eyección y el acortamiento de la fracción. La medición de los parámetros cardíacos mediante tinción Sirius Red y Fast Green mostró que el tamaño del infarto y la fracción de volumen de colágeno disminuyeron, mientras que el grosor de la pared anterior del ventrículo izquierdo aumentó después del trasplante.El etiquetado de la alfa actina no específica en verde, DAPI en azul y troponina T específica para humanos en rojo mostró la presencia de células trasplantadas en el infarto y el área marginal del infarto. El número y el porcentaje de células trasplantadas fueron mayores en el grupo de dosis múltiple en comparación con la dosis única. 28 días después del infarto de miocardio, el grupo de dosis múltiples mostró un aumento en el número de células que expresan el marcador de células endoteliales, I-B4.La aglutinina de germen de trigo y la tinción de alfa actinina sarcomérica en cardiomiocitos mostraron una reducción en el diámetro mínimo de fibra. Un menor número de núcleos de cardiomiocitos positivos para túnel en el grupo de dosis múltiples indicó una reducción de la apoptosis. El análisis de PCR detectó el ADN mitocondrial humano solo en el corazón, mostrando un trasplante específico.Al insertar la aguja, asegúrese de que entre en la cavidad pericárdica junto con el margen superior del diafragma y al final del círculo espiratorio para evitar la lesión en el hígado o el pulmón.

Research

JoVE Journal

Medicine

Implantation of a Carotid Cuff for Triggering Shear-stress Induced Atherosclerosis in Mice

Implantación de un manguito de la carótida para provocar esfuerzo cortante aterosclerosis inducida en ratones

It is widely accepted that alterations in vascular shear stress trigger the expression of inflammatory genes in endothelial cells and thereby induce ...

Investigación

Medicina

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Ultrasound-guided Transthoracic Intramyocardial Injection in Mice

Guiada por ecografía transtorácica intramiocárdica inyección en ratones

Murine models of cardiovascular disease are important for investigating pathophysiological mechanisms and exploring potential regenerative therapies. ...

Substernal Thyroid Biopsy Using Endobronchial Ultrasound-guided Transbronchial Needle Aspiration

Subesternal tiroides Biopsia Usando guiada por ecografía endobronquial punción transbronquial

Substernal thyroid goiter (STG) represents about 5.8% of all mediastinal lesions1. There is a wide variation in the published incidence rates due to the ...

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Tratamiento específicos y selectivo de los Teratomas derivados de células madre pluripotentes utilizando radiación de haz externo en un modelo animal de pequeño

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

Un modelo de criolesiones para estudiar el infarto de miocardio en el ratón

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarcómero acortamiento De Cardiomiocitos Derivados De Células Madre Pluripotentes Usando Proteínas De Sarcómero Marcado Con Fluorescentes.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Endoscopic Ultrasound-Guided Biliary Drainage: Endoscopic Ultrasound-Guided Hepaticogastrostomy in Malignant Biliary Obstruction

Drenaje biliar guiado por ultrasonido endoscópico: hepaticogastrostomía endoscópica guiada por ultrasonido en la obstrucción biliar maligna

Patients with unresectable malignant biliary obstruction often require biliary drainage to decompress the biliary system. Endoscopic Retrograde ...

Induction of Myocardial Infarction and Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Mice

Inducción de infarto de miocardio y lesión por isquemia-reperfusión miocárdica en ratones

Acute myocardial infarction is a common cardiovascular disease with high mortality. Myocardial reperfusion injury can counteract the beneficial effects of ...

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...