Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

يشكر المؤلفون الدكتورة آن بيتون وجميع أعضاء المختبر على مدخلاتهم في المخطوطة. نتوجه بشكر خاص إلى الدكاترة توم ريه وجوليا بولاك وروس تايلور على تقديم ثقافات MG الأولية كأداة فحص ل S.G.W. خلال تدريب ما بعد الدكتوراه في جامعة واشنطن في سياتل. تم تمويل الدراسة من خلال منحة برنامج Empire Innovation Program (EIP) إلى S.G.W. وصناديق بدء التشغيل من SUNY Optometry إلى S.G.W. ، بالإضافة إلى جائزة R01EY032532 من المعهد الوطني للعيون (NEI) إلى S.G.W.

تمت الموافقة على الإجراءات التي تنطوي على مواضيع حيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في كلية البصريات بجامعة ولاية نيويورك.
ملاحظة: يتكون بروتوكول الثقافة هذا من ثلاث مراحل: مرحلة النمو والنقل والتحويل. ويرد في الشكل 1 ملخص للبروتو...

يصف هذا البروتوكول كيفية نمو MG من شبكية العين الفأرية المنفصلة لإعادة برمجة الدراسات باستخدام miRNAs. كما هو موضح ومؤكد في مجموعة متنوعة من الدراسات السابقة ، فإن الغالبية العظمى (80٪ -90٪) من الخلايا الموجودة في هذه الثقافات هي MG20,23,24. هذه الطر...

دبقية مولر (MG) هي الدبقية السائدة في شبكية العين العصبية. لديهم وظائف مماثلة مقارنة بالدبقية الأخرى في أجزاء أخرى من الجهاز العصبي المركزي مثل الحفاظ على توازن الماء والأيونات ، وتغذية الخلايا العصبية ، وحماية الأنسجة. تتمتع MG بميزة رائعة أخرى: على الرغم من أنها دبقية ناضجة ، إلا أنها لا تزال تعبر عن العديد من الجينات التي يتم التعبير عنها في الخلايا السلفية للشبكية (RPCs) خلال التطور المتأخر 1,2. يفترض أن هذا التشابه هو السبب في التجديد العصبي القائم على MG الذي يحدث بشكل طبيعي في شبكية العين بعد تلف الشبكية 3,4. خلال هذه العملية ، تعيد MG الدخول في دورة الخلية وإلغاء التمايز إلى RPCs التي تتمايز بعد ذلك إلى جميع الأنواع الستة من الخلايا العصبية الشبكية. على الرغم من أن هذه الظاهرة تحدث بشكل طبيعي في الأسماك ، إلا أن الثدييات MG لا تتحول إلى خلايا عصبية 5,6. ومع ذلك، يمكن إعادة برمجتها. وقد ثبت أن مجموعة متنوعة من العوامل تعيد برمجة MG في RPCs / الخلايا العصبية. من بين هذه العوامل عامل النسخ الحلزوني الحلزوني الأساسي (bHLH) المتجانس 1 (Ascl1) الذي يشارك في تجديد الأسماك 7,8. في الفئران ، يتم التعبير عن Ascl1 فقط في RPCs أثناء تكوين الشبكية ولكنه غائب في MG الناضجة أو الخلايا العصبية الشبكية9.
إن إعادة برمجة الخلايا مباشرة في الجسم الحي ليست تحديا منهجيا فحسب ، بل تتطلب أيضا موافقة لجنة مؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها. للحصول على الموافقة ، يلزم الحصول على بيانات أولية حول العامل (العوامل) المستخدمة أو المعدلة ، والتركيزات ، والآثار غير المستهدفة ، والآليات الأساسية ، والسمية ، والكفاءة. تسمح أنظمة زراعة الخلايا باختبار هذه المعايير قبل استخدامها في نماذج الجسم الحي. علاوة على ذلك ، نظرا لأن MG لا تشكل سوى حوالي 5٪ من إجمالي عدد خلايا الشبكية 10 ، فإن مزارع MG تسمح بدراسة وظيفتها11 وكذلك سلوكها ، بما في ذلك الهجرة12,13 ، الانتشار14 ، رد فعل الإجهاد على الإصابة / التلف15,16 ، تفاعلها مع أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الدبقية الصغيرة17 أو خلايا العقدة الشبكية (RGCs)18 ، أو إمكاناتها العصبية19،20،21. يستخدم العديد من الباحثين خطوط الخلايا الخالدة لدراساتهم لأن لديهم إمكانات تكاثرية غير محدودة ويمكن الحفاظ عليها ونقلها بسهولة. ومع ذلك ، فإن الخلايا الأولية أفضل للفحوصات ذات الصلة بيولوجيا من الخلايا المخلدة لأنها تتمتع بخصائص خلية حقيقية (التعبير الجيني والبروتيني) ، والأهم من ذلك ، أنها تمثل مرحلة معينة من التطور وبالتالي لديها "عمر". يعد عمر الحيوان (وبالتالي الخلايا التي تم الحصول عليها من الحيوان) عاملا حاسما بشكل خاص في إعادة البرمجة الخلوية لأن لدونة الخلية تقل مع تقدم مرحلة التطور22.
يصف هذا البروتوكول بالتفصيل كيفية إعادة برمجة MG الأساسي باستخدام miRNAs كطريقة حالية في المختبر لدراسة التجديد. تم إنشاء نموذج الاستزراع الأولي MG هذا في عام 2012 لتقييم خصائص تكاثر الخلايا من MG في الفئران الضربة القاضية P53 (trp53-/- الفئران)23. وقد تبين أن MG المستزرعة تحافظ على ميزاتها الدبقية (أي التعبير عن بروتينات S100β و Pax6 و Sox2 التي تم تقييمها عن طريق وضع العلامات المناعية الفلورية) ، وأنها تشبه في الجسم الحي MG (microarray من MG المنقى FACS)23. بعد ذلك بوقت قصير، تم التحقق من صحة الحمض النووي الريبوزي المرسال الدبقي والتعبير عن البروتين وتأكيدهما في نهج مختلف باستخدام النواقل الفيروسية20. بعد بضع سنوات ، تم التأكيد على أن الغالبية العظمى من الخلايا الموجودة في هذه الثقافات هي MG باستخدام Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl مراسل الفأر24 الخاص ب MG. وعلاوة على ذلك، أظهر التقدير الكمي لمجموعة الحمض النووي الريبوزي المرسال في كل من MG المنقى من قبل FACS-و MG الأولي المستزرع أن مستويات MG miRNAs (mGLiomiRs) لا تختلف كثيرا في MG المستزرعة خلال مرحلة النمو. ومع ذلك ، فإن فترات الاستزراع الممدودة تسبب تغيرات في مستويات miRNA وبالتالي في مستويات mRNA والتعبير عن البروتين لأن miRNAs هي منظمات انتقالية25.
في عام 2013 ، تم استخدام نموذج ثقافة MG هذا لاختبار مجموعة متنوعة من عوامل النسخ فيما يتعلق بقدرتها على إعادة برمجة MG إلى خلايا عصبية شبكية20. تم العثور على Ascl1 ليكون عامل إعادة برمجة قوي جدا وموثوق به. الإفراط في التعبير عن Ascl1 عن طريق النواقل الفيروسية الناجمة عن التغيرات المورفولوجية ، والتعبير عن علامات الخلايا العصبية ، واكتساب الخصائص الكهروفسيولوجية العصبية. والأهم من ذلك، تم نقل الرؤى والنتائج التي تم الحصول عليها من هذه التجارب المختبرية الأولى بنجاح إلى التطبيقات في الجسم الحي22,26 مما يدل على أن مزارع MG الأولية تمثل أداة صلبة وموثوقة لفحص العوامل الأولية وتقييم الميزات الدبقية قبل التنفيذ في الجسم الحي.
قبل بضع سنوات ، تبين أن miRNA miR-124 المخصب بالدماغ ، والذي يتم التعبير عنه أيضا بشكل كبير في الخلايا العصبية الشبكية ، يمكن أن يحفز تعبير Ascl1 في MG21 المستزرعة. تم تصور تعبير Ascl1 في الخلايا الحية عبر ماوس مراسل Ascl1 (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl). فأر المراسل هو فأر مهندس وراثيا يحتوي على جين مراسل مدرج في حمضه النووي. يشفر جين المراسل هذا لبروتين المراسل ، وهو في هذه الدراسة tdTomato، وهو بروتين فلورسنت أحمر. هذا البروتين المراسل تقارير التعبير عن جين من الاهتمام، في هذه الحالة، Ascl1. بمعنى آخر ، ستتحول الخلايا التي تعبر عن Ascl1 إلى اللون الأحمر. نظرا لأن Ascl1 يتم التعبير عنه فقط في RPCs9 ، فإن ماوس Ascl1 CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl يسمح بتتبع تحويل MG إلى Ascl1 يعبر عن RPCs ، مما يعني أن الخلايا المحولة ستعبر عن بروتين مراسل tdTomato الفلورسنت الأحمر. هذا هو وضع العلامات التي لا رجعة فيها منذ تغيير الحمض النووي لهذه الخلايا. وبالتالي ، سيتم تصور أي تمايز عصبي لاحق لأن تسمية tdTomato تبقى في الخلايا المتباينة. إذا كان Ascl1 الذي يعبر عن RPCs المشتقة من MG (مع تسمية tdTomato) يتمايز إلى خلايا عصبية ، فستظل هذه الخلايا العصبية تحمل علامتها الحمراء. وبالتالي ، فإن هذا الماوس لا يسمح فقط بوضع علامات على RPCs المشتقة من MG لتصوير الخلايا الحية ولكن يسمح أيضا برسم خرائط المصير وتتبع النسب لهذه RPCs المشتقة من MG (الحمراء). في الآونة الأخيرة ، تم تحديد مجموعة من miRNAs في RPCs وتم استخدام ثقافات MG من Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter الفئران لفحص واختبار تأثير هذه miRNAs على قدرة إعادة البرمجة والكفاءة27. تم العثور على مرشح واحد ، RPC-miRNA miR-25 ، قادر على إعادة برمجة MG المستزرعة في خلايا Ascl1 المعبرة (Ascl1-Tomato+). تعتمد هذه الخلايا المعاد برمجتها ميزات عصبية بمرور الوقت ، بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا العصبية (سوماتا صغيرة وإما عمليات دقيقة قصيرة أو طويلة) ، والتعبير عن النسخ العصبية التي تم قياسها عبر scRNA-Seq ، بالإضافة إلى التعبير عن البروتينات العصبية التي تم التحقق منها عبر وضع العلامات المناعيةالفلورية 27.
هنا ، يوضح البروتوكول بالتفصيل كيفية زراعة ونقل MG من الفئران P12 المقتبسة من العمل السابق 21،24،27. تم اختيار miRNA miR-25 المذكور أعلاه لهذا البروتوكول ، وهو miRNA يتم التعبير عنه بشكل كبير في RPCs ، مع انخفاض مستويات التعبير في MG أو الخلايا العصبية الشبكية. من أجل المبالغة في التعبير عن miR-25 ، يحاكي miR-25 الفئران ، أي يتم استخدام جزيئات miRNA الاصطناعية. كعنصر تحكم ، يتم اختيار محاكاة miRNA من Caenorhabditis elegans ، والتي ليس لها وظيفة في خلايا الثدييات. تم إنجاز تصور تحويل MG إلى RPCs عبر ماوس مراسل RPC (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl) ، وهو ماوس ذو خلفية مختلطة (سلالات C57BL/6 و S129 و ICR). ومع ذلك ، يمكن إجراء هذه الثقافة مع جميع سلالات الفئران ، بما في ذلك السلالات البرية. في السنوات القليلة الماضية ، تم تعديل البروتوكول الأصلي لتقليل مدة مرحلة النمو وفترة الثقافة الشاملة وضمان حالة خلايا دبقية أكثر قوة وتقليل درجة التنكس الخلوي ، الذي يحدث في فترات الاستزراع الطويلة. كما تم تمديد النافذة الزمنية العادية للنقل من 3 ساعات إلى 2 أيام. كما ذكرنا من قبل ، على الرغم من أن البروتوكول الحالي يصف ثقافات MG كأداة لدراسات التجديد ، فإن الطريقة ليست مفيدة فقط لاختبار عوامل إعادة البرمجة ، ولكن يمكن أيضا تكييفها لتطبيقات أخرى ، بما في ذلك الدراسات حول السلوك المهاجر أو التكاثري MG ، والنماذج المتعلقة بالإصابة / تلف الخلايا ، و / أو تحديد الآليات والمسارات الأساسية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

دبقية مولر (MG) هي الدبقية السائدة في شبكية العين العصبية ويمكن أن تعمل كمصدر متجدد للخلايا العصبية الشبكية. في الفقاريات السفلى مثل الأسماك ، يحدث التجديد المدفوع ب MG بشكل طبيعي. ومع ذلك ، في الثدييات ، يلزم التحفيز بعوامل معينة أو التلاعب الوراثي / اللاجيني. نظرا لأن MG لا تشكل سوى 5٪ من عدد خلايا الشبكية ، فهناك حاجة إلى أنظمة نموذجية تسمح بدراسة مجموعة الخلايا هذه حصريا. أحد هذه الأنظمة النموذجية هو مزارع MG الأولية القابلة للتكرار ويمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما في ذلك فحص وتحديد الجزيئات / العوامل ، واختبار المركبات أو العوامل ، ومراقبة الخلايا ، و / أو الاختبارات الوظيفية. يستخدم هذا النموذج لدراسة إمكانات الفئران MG للتحول إلى خلايا عصبية شبكية العين بعد مكملات أو تثبيط الحمض النووي الريبي الميكروي (miRNAs) عن طريق نقل الحمض النووي الريبوزي المرسال الاصطناعي أو مثبطاتها. أكد استخدام الفئران الصحفية الخاصة ب MG بالاقتران مع وضع العلامات المناعية الفلورية وتسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) أن 80٪ -90٪ من الخلايا الموجودة في هذه الثقافات هي MG. باستخدام هذا النموذج ، تم اكتشاف أن miRNAs يمكنها إعادة برمجة MG إلى خلايا سلف شبكية العين (RPCs) ، والتي تتمايز لاحقا إلى خلايا تشبه الخلايا العصبية. مزايا هذه التقنية هي أنه يمكن اختبار مرشحي miRNA لكفاءتهم ونتائجهم قبل استخدامهم في تطبيقات الجسم الحي .

يصف هذا البروتوكول كيفية زراعة MG من شبكية العين الفأرة P12 وكيفية إعادة برمجة هذه الخلايا مع miR-25 إلى خلايا عصبية شبكية العين باستخدام الماوس مراسل Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC. تم استخدام هذه الطريقة في تقارير العمل السابقة بالتفصيل عن miRNAs المناسبة الأخرى (تحاكي أو مثبطات ، كجزيئات...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

تمثل مزارع مولر الدبقية الأولية التي تم الحصول عليها من شبكية العين الفأرية أداة قوية وموثوقة للغاية لدراسة التحويل الدبقي إلى خلايا سلف شبكية العين بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي. يمكن اختبار جزيئات أو تركيبات مفردة قبل تطبيقها اللاحق للنهج في الجسم الحي .

مزارع الخلايا الأولية لدراسة إمكانات تجديد مورين مولر غليا بعد علاج الحمض النووي الريبي الميكروي

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

يسمح هذا البروتوكول بدراسة إمكانات وقدرة دبقية مولر على التحول إلى خلايا سلف شبكية العين بعد العلاج بعوامل محددة مثل الحمض النووي الريبي الميكروي. ميزة هذه التقنية هي أنه يمكن اختبار مرشحي الحمض النووي الريبي الميكروي لكفاءتهم ونتائجهم قبل استخدامهم في تطبيقات الجسم الحي. سيساعد في إثبات الإجراء سيويونغ كانغ ، طالب الدكتوراه من مختبر ستيفاني وول.أولا ، اغمس مقلة العين التي تمت إزالتها لفترة وجيزة في أنبوب به إيثانول لتجنب ترحيل البكتيريا من الحيوان. ثم اغسل مقلة العين لفترة وجيزة في طبق بتري الذي يبلغ طوله 10 سنتيمترات قبل وضعه في طبق البئر المكون من 24 بئرا على الجليد. بمجرد إزالة مقل العيون وتنظيفها ، ضع عين واحدة في طبق التشريح الموضوع تحت مجهر تشريح مع مصدر ضوء.الآن قم بإصلاح مقلة عين واحدة عن طريق الإمساك بالعصب البصري والنسيج الضام المحيط حول الصلبة باستخدام ملقط Dumont 5 الناعم والضغط عليه بعناية ضد طبق التشريح. بعد ذلك ، قم بعمل ثقب في مركز القرنية باستخدام إبرة قياس 30 للسماح بوصول أسهل للمقص الوريدي. ثم ، قم بتشريح القرنية حول الجسم الهدبي باستخدام مقص وريدي وقم بإزالة القرنية والعدسة والقزحية والجسم الزجاجي بعناية باستخدام ملقط Dumont 5 الدقيق.في وقت لاحق تشريح الصلبة مع مقص وريدي حتى يتم الوصول إلى العصب البصري واستخراج بعناية شبكية العين باستخدام ملقط دومون 5 دقيقة. الآن استخدم ملقط Dumont 5 الناعم الثاني للدفع ضد شبكية العين وإزالة الجسم الزجاجي بالكامل. نقل الشبكية قطع حوالي 2.5 سم من طرف ماصة نقل معقمة لتكبير القطر.الآن باستخدام هذه النصيحة ، التقط شبكية العين بأكملها دون إتلاف الأنسجة وانقل الشبكية إلى طبق بتري معقم جديد مع HBSS البارد وهز الطبق. بعد ذلك ، باستخدام ماصة نقل معقمة جديدة ، ادفع الشبكية بعناية لغسل الخلايا الظهارية الصباغية الشبكية. ضع شبكية العين المعزولة على الفور في بئر نظيفة جديدة من صفيحة البئر 24 المملوءة بملليلتر واحد من HBSS مع الحفاظ على صفيحة البئر 24 على الجليد أثناء التشريح.تحضير خليط التفكك الصبغي DNase I كما هو موضح في المخطوطة. الآن مع ماصة نقل طرف مكبرة ، التقط شبكية العين. انتظر حتى تستقر الشبكية في الجزء السفلي من الطرف وحرر الشبكية دون HBSS المفرط في الأنبوب الذي يحتوي على خليط Papain DNase I.بعد ذلك ، ضع الأنبوب على جوزة في الحاضنة واحتضنها لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية ومع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك ، قم بفصل الخلايا عن طريق السحب بعناية لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة ملليلتر واحدة. بعد انفصال الخلايا ، أضف 275 ميكرولتر من مثبط الأنزيم البروتيني البويضي من مجموعة تفكك Papain لتحييد Papain وتخلط بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.ضع الأنابيب في جهاز طرد مركزي وتدور عند أربع درجات مئوية لمدة ثماني دقائق بقوة طرد مركزي نسبية تبلغ 300. أضف عامل نمو البشرة إلى الحجم المحسوب لمتوسط النمو الذي تم تسخينه مسبقا عند 37 درجة مئوية. قم بإزالة الأنابيب بعناية من جهاز الطرد المركزي.دون لمس الكريات الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب ، قم بإزالة supernatant بعناية وبشكل كامل. الآن إعادة تعليق بيليه الخلية مع 500 ميكرولتر من عامل نمو البشرة تكملة وسط النمو. ثم ، انقل تعليق الخلية إلى بئر واحد من لوحة البئر 12 الموسومة.شطف الأنبوب مع 500 ميكرولتر أخرى من عامل نمو البشرة تكملة وسط النمو وإضافته إلى البئر. صخرة لوحة البئر بعناية ثم ضع الصفيحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع ثاني أكسيد الكربون. ابدأ بالتحقق من التقاء الخلايا بنسبة 90٪ إلى 100٪.بعد ذلك ، قم بإزالة الوسط وإضافة ملليلتر واحد من HBSS البارد لغسل البئر. هز اللوحة بلطف وإزالة HBSS دون أي آثار متبقية. في وقت لاحق ، أضف 500 ميكرولتر من محلول يحتوي على التربسين المسخن مسبقا لفصل الخلايا عن البئر.صخرة بلطف وحضانة لمدة دقيقتين في حاضنة 37 درجة مئوية. بعد نقل اللوحة من الحاضنة إلى خزانة السلامة الحيوية ، قم بشفط المحلول الذي يحتوي على التربسين أثناء الإمالة. قم بتفريقها بعناية وببطء فوق البئر عدة مرات حتى تنفصل الخلايا تماما.بعد ذلك ، انقل تعليق الخلية هذا إلى أنبوب معقم سعة 1.5 ملليلتر وضع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي. تدور في 300 مرة غرام لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية وتعيد الأنابيب إلى خزانة السلامة الحيوية. إزالة supernatant دون لمس الكرية.الآن أعد تعليق حبيبات الخلية بعناية عن طريق إضافة 600 ميكرولتر من وسط النمو المسخن مسبقا والسحب لأعلى ولأسفل حوالي 30 إلى 40 مرة. أخيرا ، بذور 100 ميكرولتر من تعليق الخلية الذي تم الحصول عليه في وسط ست زلات غطاء مغلفة من لوحة البئر 24. ضع الصفيحة على الحاضنة واترك الخلايا تستقر على النقل اللاحق باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير الذي يقلد.يوضح الشكل ظروف التحكم بعد خمسة أيام من النقل مع وجود عدد قليل من الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato. بعد علاج miR-25 ، تم العثور على العديد من الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato. وكشف القياس الكمي عن زيادة أربعة أضعاف في عدد الخلايا الإيجابية للطماطم Ascl1-Tomato في الآبار المعالجة miR-25 مقارنة بالضوابط.الأهم من ذلك ، أن الغالبية العظمى من الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato الموجودة في الآبار المعالجة riR-25 تبنت مورفولوجيا عصبية. وشملت ملامح هذا التشكل العصبي انخفاض حجم سوما الخلية، وتطوير العمليات الدقيقة وتشكيل شبكات صغيرة. كشف القياس الكمي أن حوالي 70٪ من جميع الخلايا الإيجابية ل Ascl1-Tomato لها ميزات عصبية.يظهر وضع العلامات المناعية الفلورية أن الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato ذات المورفولوجيا العصبية تعبر عن العلامات العصبية OTX2 و MAP2 ، مما يؤكد الهوية العصبية. كشف القياس الكمي لهذه الخلايا أنه بعد الإفراط في التعبير عن miR-25 ، يوجد حوالي 40 خلية عصبية إيجابية Ascl1-Tomato لكل حقل مقارنة بخمس خلايا عصبية لكل حقل في الضوابط. تشكل الخلايا العصبية المحددة حوالي 70٪ من إجمالي عدد الخلايا الإيجابية Ascl1-Tomato للعينات المعالجة miR-25.علاوة على ذلك ، أظهر التقدير الكمي للعدد المطلق للخلايا العصبية المشتركة OTX2 و MAP2 أنه بعد علاج miR-25 ، تم العثور على حوالي 60 خلية عصبية لكل حقل مقارنة ب 10 خلايا عصبية لكل مجال في الضوابط. من الضروري العمل في بيئة نظيفة ومعقمة بأدوات نظيفة ومعقمة والعمل بعناية من خلال تجنب أي معاملة قاسية. يمكن أن تكون التطبيقات النهائية على سبيل المثال ، تحديد كمية البروتين ، أو تحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي ، أو الدراسات الكهروفسيولوجية.ساعدتنا هذه التقنية على استكشاف الأسئلة الأولية حول إعادة البرمجة النووية التي تنتمي إلى مجال الطب التجديدي. وهناك مجموعة طويلة من العوامل والظروف التي يمكن اختبارها من أجل استكشاف أسئلة جديدة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

التمايز من العصبية البشرية خط الخلايا الجذعية على الثقافات الثلاث الأبعاد، تحليل الجينات الرنا الميكروي، واعتبارا الهدف

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

تذرية الكبدية محددة في الزرد لدراسة يحركها صفراوية تجديد الكبد

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

تعظيم الاستفادة من الفحص الجرح خدش للكشف عن تغيرات في الفئران الوسيطة اللحمية الهجرة الخلية بعد الأضرار التي كتبها القابلة للذوبان استخراج دخان السجائر

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

وسيلة فعالة للحصول على خلايا Dedifferentiated الدهون

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

الإنسان الأرومة الغاذية الابتدائية خلية ثقافة نموذج لدراسة تأثيرات واقية من الميلاتونين ضد نقص الأكسجة / الناجم عن عودة التأكسج تعطيل

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

باستخدام الثقافات Neurosphere الأولية لدراسة الابتدائية سيليا

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

صمام عزل وتوصيف للفئران الابتدائي الخلايا الخلالي: نموذج جديد لدراسة تكلس الصمام الابهري

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

أساليب لدراسة التجديد في ستنتور

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...