Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

作者感谢Ann Beaton博士和所有实验室成员对手稿的意见。特别感谢Tom Reh博士，朱莉娅·波拉克博士和Russ Taylor博士在西雅图华盛顿大学的博士后培训期间将MG主要文化作为筛选工具介绍给S.G.W.。该研究由帝国创新计划（EIP）资助给S.G.W.和纽约州立大学验光学院向S.G.W.的启动资金资助，以及美国国家眼科研究所（NEI）向S.G.W.颁发的R01EY032532奖。

涉及动物受试者的程序已获得纽约州立大学眼科学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
注意：该培养方案包括三个阶段：生长、转染和转化阶段。 图1给出了带有时间表的整体协议摘要。
1. 培养基和所有所需试剂的制备
注：所有步骤都需要在A2或B2生物安全柜（BSC）中执行。在生长阶段，?...

该协议描述了如何从解离的小鼠视网膜中生长MG，以使用miRNA进行重编程研究。如先前各种研究所显示和证实的那样，在这些培养物中发现的绝大多数（80%-90%）细胞是MG20，23，24。这种方法是一种非常可靠和可靠的技术，如果正确遵循协议21，27，可以很容易地重现结果。然而，培养?...

米勒神经胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要神经胶质细胞。与中枢神经系统其他部位的其他神经胶质细胞相比，它们具有相似的功能，例如维持水和离子稳态，滋养神经元和保护组织。MG还有另一个迷人的特征：虽然它们是成熟的神经胶质细胞，但它们仍然在发育后期表达视网膜祖细胞（RPC）中的许多基因1，2。这种相似性被认为是视网膜损伤3，4后鱼视网膜中自然发生的基于MG的神经元再生的原因。在此过程中，MG重新进入细胞周期并解分化成RPC，然后分化成所有六种类型的视网膜神经元。虽然这种现象自然发生在鱼类中，但哺乳动物MG不会转化为神经元5，6。但是，它们可以重新编程。已经证明多种因素可以将MG重新编程为RPC /神经元;这些因素包括参与鱼类再生的基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子阿科特-斯库特同源物1（Ascl1）7，8。在小鼠中， Ascl1 仅在视网膜发生期间在RPC中表达，但在成熟的MG或视网膜神经元中不存在9。
直接 在体内 重编程细胞不仅在方法学上具有挑战性，而且还需要获得机构动物护理和使用委员会的批准。要获得批准，需要有关使用或改变的因子，浓度，脱靶效应，潜在机制，毒性和效率的初步数据。细胞培养系统允许在 体内 模型中使用之前测试这些标准。此外，由于MG仅占整个视网膜细胞群10的约5%，MG培养物允许研究其功能11 以及它们的行为，包括迁移12，13，增殖14，对损伤/损伤的应激反应15，16，它们与其他细胞类型的相互作用，如小胶质细胞17 或视网膜神经节细胞（RGC）18， 或他们的神经源性潜力19，20，21。许多研究人员使用永生细胞系进行研究，因为它们具有无限的增殖潜力，并且可以轻松维持和转染。然而，原代细胞比永生化细胞更适合生物学相关测定，因为它们具有真正的细胞特征（基因和蛋白质表达），更重要的是，它们代表发育的某个阶段，因此具有“年龄”。动物的年龄（以及因此从动物获得的细胞的年龄）是细胞重编程中特别关键的因素，因为细胞可塑性随着发育阶段的推进而降低22。
该协议详细描述了如何用miRNA重新编程原代MG作为研究再生的当前 体外 方法。该MG原代培养模型建立于2012年，用于评估MG在P53敲除小鼠（trp53-/-小鼠）23中的细胞增殖特征。结果表明，培养的MG保持其神经胶质特征（即 通过 免疫荧光标记评估的S100β，Pax6和Sox2蛋白的表达），并且它们类似于 体内 MG（FACS纯化的MG的微阵列）23。此后不久，使用病毒载体20以不同的方法验证和确认了神经胶质mRNA和蛋白质表达。几年后，通过使用MG特异性 Rlbp1CreERT：tdTomatoSTOPFL / fl 报告小鼠24，证实在这些培养物中发现的绝大多数细胞是MG。此外，对FACS纯化的MG和培养的原代MG中一组miRNA的定量表明，在生长阶段，培养的MG中mRNA的水平变化不大。然而，较长的培养周期会导致miRNA水平的变化，从而导致mRNA水平和蛋白质表达的变化，因为miRNA是翻译调节因子25。
2013年，该MG培养模型用于测试各种转录因子，这些转录因子具有将MG重新编程为视网膜神经元20的能力。Ascl1被发现是一种非常强大和可靠的重编程因子。通过病毒载体过表达Ascl1诱导形态学变化，神经元标志物的表达以及神经元电生理特性的获得。更重要的是，从这些首次体外实验中获得的见解和结果已成功转移到体内应用22，26中，证明初级MG培养物代表了在体内实施之前进行初始因子筛选和神经胶质特征评估的坚实可靠的工具。
几年前，已经证明，在视网膜神经元中高度表达的富含脑的miRNA miR-124可以在培养的MG21中诱导Ascl1表达。通过Ascl1报告小鼠可视化活细胞中的Ascl1表达（Ascl1CreERT：td多马托斯托普夫特/fl）。报告小鼠是一种基因工程小鼠，其DNA中插入了报告基因。这个报告基因编码一种报告蛋白，在这项研究中，这是一种红色荧光蛋白tdTomato。该报告蛋白报告目的基因的表达，在这种情况下，Ascl1。换句话说，表达Ascl1的细胞将变成红色。由于Ascl1仅在RPC9中表达，因此该Ascl1CreERT：td多马托斯托普弗/fl小鼠允许跟踪MG转化为表达RPC的Ascl1，这意味着转换细胞将表达红色荧光tdtomato报告蛋白。这是不可逆的标记，因为这些细胞的DNA被改变。因此，任何随后的神经元分化都将被可视化，因为tdTomato标签保留在分化细胞中。如果表达MG衍生的RPC（带有tdTomato标签）的Ascl1分化成神经元，这些神经元仍将具有红色标签。因此，该小鼠不仅可以标记MG衍生的RPC以进行活细胞成像，还可以允许这些MG衍生的（红色）RPC的命运映射和谱系追踪。最近，鉴定了RPC中的一组miRNA，并使用Ascl1CreERT：tdTomatoSTOPFL / fl RPC报告基因小鼠的MG培养物来筛选和测试这些miRNA对重编程能力和效率的影响27。一种候选者RPC-miRNA miR-25被发现能够将培养的MG重新编程为Ascl1表达（Ascl1-番茄+）细胞。这些重编程的细胞随着时间的推移采用神经元特征，包括神经元形态（小体细胞和短或长精细过程），通过scRNA-Seq测量的神经元转录本的表达，以及通过免疫荧光标记27验证的神经元蛋白的表达。
在这里，该协议详细介绍了如何从适应先前工作21，24，27的P12小鼠中生长和转染MG。为该方案选择的是上述miRNA miR-25，这是一种在RPC中高度表达的miRNA，在MG或视网膜神经元中表达水平低。为了过表达miR-25，使用小鼠miR-25模拟物，即人工miRNA分子。作为对照，选择来自秀丽隐杆线虫的miRNA的模拟物，它们在哺乳动物细胞中没有功能。MG转换为RPC的可视化是通过RPC报告小鼠（Ascl1CreERT：tdTomatoSTOPFL / fl），具有混合背景的小鼠（C57BL / 6，S129和ICR菌株）完成的。然而，这种培养可以用所有小鼠品系进行，包括野生型品系。在过去几年中，对原始方案进行了修改，以减少生长阶段的持续时间和整个培养期，并确保更健壮的神经胶质细胞状态，并最大限度地减少细胞变性的程度，这在长时间的培养期间发生。常规转染时间窗口也从3小时延长至2天。如前所述，尽管目前的方案将MG培养物描述为再生研究的工具，但该方法不仅可用于测试重编程因子，还可以适用于其他应用，包括关于MG迁移或增殖行为的研究，损伤/细胞损伤相关范例，和/或潜在机制和途径的鉴定。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

穆勒神经胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要神经胶质细胞，可以作为视网膜神经元的再生源。在鱼类等低等脊椎动物中，MG驱动的再生自然发生;然而，在哺乳动物中，需要用某些因素或遗传/表观遗传操作进行刺激。由于MG仅占视网膜细胞群的5%，因此需要允许专门研究该细胞群的模型系统。这些模型系统之一是可重复的原代MG培养物，可用于各种应用，包括分子/因子筛选和鉴定，化合物或因子的测试，细胞监测和/或功能测试。该模型用于研究小鼠MG 在通过 转染人工miRNA或其抑制剂补充或抑制microRNA（miRNA）后转化为视网膜神经元的潜力。将MG特异性报告小鼠与免疫荧光标记和单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合使用，证实在这些培养物中发现的80%-90%的细胞是MG.使用该模型，发现miRNA可以将MG重新编程为视网膜祖细胞（RPC），随后分化为神经元样细胞。该技术的优点是，在 体内 应用之前，可以测试miRNA候选物的效率和结果。

该协议描述了如何从P12小鼠视网膜中生长MG，以及如何使用 Ascl1CreERT：td多巴托斯托普/fl RPC报告小鼠将这些细胞用miR-25重新编程为视网膜神经元。该方法在先前的工作中详细报告了其他合适的miRNA（模仿物或抑制剂，作为单分子或组合）以将MG重新编程为RPC，然后采用神经元细胞特征27。该方法已被修改以更快地生长培养物，从而最大限度地减少人工环境随?...

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Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

从小鼠视网膜获得的Müller神经胶质细胞原代培养物是研究microRNA处理后神经胶质转化为视网膜祖细胞的非常强大和可靠的工具。在随后应用 体内 方法之前，可以测试单个分子或组合。

原代细胞培养物研究小鼠穆勒胶质细胞在微RNA处理后的再生潜力

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

该协议允许研究穆勒胶质细胞在用特定因子（如microRNA）处理后转化为视网膜祖细胞的潜力和能力。该技术的优点是microRNA候选物可以在体内应用之前测试其效率和结果。帮助演示该程序的是来自Stefanie Wohl实验室的博士生Seoyoung Kang。首先，将取出的眼球短暂浸入装有乙醇的管中，以避免细菌从动物身上携带。然后，在10厘米的培养皿中短暂清洗眼球，然后将其放入冰上的24孔板中。取出眼球并清洁后，将一只眼睛放入带有光源的解剖显微镜下的解剖盘中。现在，用Dumont 5细镊子抓住巩膜周围的视神经和周围的结缔组织，并将其小心地按压在解剖盘上，从而固定一个眼球。接下来，使用 30 号针在角膜中心开一个洞，以便更容易地进入静脉剪刀。然后，使用静脉剪刀解剖睫状体周围的角膜，并用Dumont 5细钳小心地去除角膜，晶状体，虹膜和玻璃体。然后用静脉剪刀解剖巩膜，直到到达视神经，并使用Dumont 5细钳小心地提取视网膜。现在使用第二个Dumont 5细钳子推动视网膜并完全去除玻璃体。将视网膜切开无菌移液器尖端约2.5厘米以扩大直径。现在使用此尖端，在不损坏组织的情况下拾取整个视网膜，并将视网膜转移到带有冷HBSS的新无菌培养皿中并摇动培养皿。接下来，使用新的无菌移液管，小心地推动视网膜以洗掉视网膜色素上皮细胞。立即将分离的视网膜放入装有一毫升HBSS的24孔板的新清洁孔中，同时在解剖过程中将24孔板保持在冰上。按照手稿中的说明制备木瓜蛋白酶 DNase I 解离混合物。现在使用扩大的吸头转移移液器，拾取视网膜。等到视网膜沉淀在尖端底部，然后将没有过多HBSS的视网膜释放到含有木瓜蛋白酶DNase I混合物的管中。接下来，将试管放在培养箱中的章动器上，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 10 分钟。接下来，用一毫升移液器小心地上下移液来解离细胞。细胞解离后，从木瓜蛋白酶解离试剂盒中加入 275 μL 卵木蛋白酶抑制剂以中和木瓜蛋白酶并通过上下移液轻轻混合。将试管放入离心机中，以 300 的相对离心力在 4 摄氏度下旋转 8 分钟。将表皮生长因子添加到在37摄氏度预热的生长培养基的计算体积中。小心地从离心机中取出试管。在不接触管底部的沉淀的情况下，小心地完全除去上清液。现在用500微升补充的表皮生长因子生长培养基重悬细胞沉淀。然后，将细胞悬液转移到标记的12孔板的一个孔中。用另外500微升补充的表皮生长因子生长培养基冲洗管，并将其添加到孔中。小心摇动孔板，然后将板放入含有二氧化碳的37摄氏度的培养箱中。首先检查90%至100%的细胞汇合度。接下来，取出培养基并加入一毫升冷HBSS清洗井。轻轻摇动板并去除HBSS，不留下任何痕迹。之后，加入500微升含有预热胰蛋白酶的溶液，将细胞从孔中分离出来。轻轻摇晃，在 37 摄氏度的培养箱中孵育两分钟。将板从培养箱移动到生物安全柜后，在倾斜的同时吸出含有胰蛋白酶的溶液。小心地缓慢地将其分散在孔上几次，直到细胞完全分离。接下来，将该细胞悬液转移到无菌的1.5毫升管中，并将管放入离心机中。在 4 摄氏度下以 300 倍克旋转 8 分钟，然后将试管带回生物安全柜。在不接触沉淀的情况下除去上清液。现在，通过加入600微升预热的生长培养基并上下移液约30至40次，小心地重悬细胞沉淀。最后，将100微升获得的细胞悬液接种在24孔板的六个包被盖玻片的中心。将板放在培养箱上，让细胞沉淀，以便使用micro RNA模拟物进行后续转染。该图显示了转染五天后存在一些Ascl1-Tomato阳性细胞的对照条件。然而，在miR-25处理后，发现了更多的Ascl1-番茄阳性细胞。定量显示，与对照组相比，miR-25处理孔中Ascl1-Tomato阳性细胞的数量增加了四倍。最重要的是，在riR-25处理孔中发现的绝大多数Ascl1-Tomato阳性细胞都采用了神经元形态。这种神经元形态的特征包括细胞体大小减小，精细过程的发展和微小网络的形成。定量显示，约70%的Ascl1-番茄阳性细胞具有神经元特征。免疫荧光标记显示，具有神经元形态的Ascl1-番茄阳性细胞表达神经标志物OTX2和MAP2，确认神经元身份。这些细胞的定量显示，在miR-25过表达后，每个场存在约40个Ascl1-Tomato阳性神经元，而对照组中每个场存在5个神经元细胞。鉴定的神经元细胞约占miR-25处理样品中Ascl1-Tomato阳性细胞群总量的70%。此外，OTX2和MAP2共表达神经元绝对数量的定量表明，在miR-25处理后，每个场发现约60个神经元，而对照组每个场发现10个神经元。必须使用清洁和无菌的工具在清洁和消毒的环境中工作，并通过避免任何苛刻的处理来仔细工作。下游应用可以是例如蛋白质定量、DNA 或 RNA 分析或电生理研究。这项技术帮助我们探索了属于再生医学领域的核重编程的初始问题。为了探索新问题，可以测试各种各样的因素和条件。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

一个人类神经干细胞系的三维文化，微小RNA的分析和推测的靶基因分化

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

科研

发育生物学

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

使用提顿体系的研究斑马鱼再生的分子机制

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

肝细胞特异性消融在斑马鱼研究胆驱动肝再生

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

伤口划痕试验的优化来探测在小鼠间充质干细胞迁移的可溶性香烟烟雾提取物受损后

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

乙醇引起的肝纤维化模型的斑马鱼发展研究祖细胞介导的​​肝细胞的再生

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

一个有效的方法获取反分化脂肪细胞

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

人胎盘滋养层细胞培养模型，研究褪黑素对缺氧的保护作用/复氧引起的中断

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Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

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Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

原发性大鼠瓣膜间质细胞的分离与鉴定: 主动脉瓣钙化的新模型研究

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

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Stentor再生的研究方法

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