Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Ann Beaton og alle laboratoriemedlemmer for deres input til manuskriptet. Særlig tak går til Dr. Tom Reh, Julia Pollak og Russ Taylor for at introducere MG primære kulturer som et screeningsværktøj til S.G.W. under postdoktoruddannelse ved University of Washington i Seattle. Undersøgelsen blev finansieret af Empire Innovation Program (EIP) Grant til S.G.W. og opstartsmidler fra SUNY Optometry til S.G.W. samt R01EY032532-prisen fra National Eye Institute (NEI) til S.G.W.

Procedurer, der involverer forsøgspersoner, er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved SUNY College of Optometry.
BEMÆRK: Denne kulturprotokol består af tre faser: vækst, transfektion og konverteringsfase. Et resumé af den samlede protokol med tidslinjen er angivet i figur 1.
1. Fremstilling af medier og alle nødvendige reagenser
BEMÆRK: Alle trin skal ...

Denne protokol beskriver, hvordan man dyrker MG fra dissocierede musehinden til omprogrammering af undersøgelser ved hjælp af miRNA'er. Som vist og bekræftet i en række tidligere undersøgelser er langt størstedelen (80%-90%) af cellerne, der findes i disse kulturer, MG 20,23,24. Denne metode er en meget robust og pålidelig teknik, og resultaterne kan let gengives, hvis protokollen følges korrekt21,27</s...

Müller glia (MG) er den dominerende glia i neurale nethinden. De har lignende funktioner sammenlignet med andre glia i andre dele af centralnervesystemet, såsom at opretholde vand og ionhomeostase, nærende neuroner og beskytte vævet. MG har en anden fascinerende funktion: selvom de er modne glia, udtrykker de stadig mange gener udtrykt i retinale stamceller (RPC'er) under sen udvikling 1,2. Denne lighed antages at være årsagen til den naturligt forekommende MG-baserede neuronale regenerering i fiskehinden efter retinal skade 3,4. Under denne proces går MG ind i cellecyklussen igen og dedifferentierer i RPC'er, der derefter differentieres til alle seks typer retinale neuroner. Selvom dette fænomen forekommer naturligt i fisk, omdannes pattedyr MG ikke til neuroner 5,6. De kan dog omprogrammeres. En række faktorer har vist sig at omprogrammere MG til RPC'er / neuroner; blandt disse faktorer er den grundlæggende helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktor achaete-scute homolog 1 (Ascl1), der er involveret i fiskeregenerering 7,8. Hos mus udtrykkes Ascl1 kun i RPC'er under retinogenese, men er fraværende i modne MG- eller retinale neuroner9.
Omprogrammering af celler direkte in vivo er ikke kun metodisk udfordrende, men kræver også godkendelse fra et institutionelt dyrepleje- og brugsudvalg. For at opnå godkendelse kræves foreløbige data om den eller de anvendte eller ændrede faktorer, koncentrationer, virkninger uden for målet, underliggende mekanismer, toksicitet og effektivitet. Cellekultursystemer tillader test af disse kriterier før brug i in vivo-modeller. Da MG desuden kun udgør ca. 5% af hele retinal cellepopulation10, tillader MG-kulturer undersøgelse af deres funktion11 såvel som deres adfærd, herunder migration12,13, proliferation14, stressreaktion på skade / skade15,16, deres interaktion med andre celletyper såsom microglia17 eller retinale ganglionceller (RRGC'er)18, eller deres neurogene potentiale 19,20,21. Mange forskere bruger udødeliggjorte cellelinjer til deres studier, da de har et ubegrænset proliferativt potentiale og let kan vedligeholdes og transficeret. Primære celler foretrækkes imidlertid til biologisk relevante assays end udødeliggjorte celler, da de har sande celleegenskaber (gen- og proteinekspression), og endnu vigtigere repræsenterer de et bestemt udviklingsstadium og har derfor en "alder". Et dyrs alder (og følgelig af de celler, der er opnået fra et dyr) er en særlig afgørende faktor i cellulær omprogrammering, da celle plasticitet reduceres med fremskreden udviklingsstadium22.
Denne protokol beskriver detaljeret, hvordan man omprogrammerer primær MG med miRNA'er som en aktuel in vitro-metode til undersøgelse af regenerering. Denne MG primære kulturmodel blev etableret i 2012 for at evaluere celleproliferationsegenskaber for MG i P53 knock-out mus (trp53-/- mus)23. Det blev vist, at dyrket MG opretholder deres gliaegenskaber (dvs. ekspression af S100β-, Pax6- og Sox2-proteiner evalueret via immunofluorescerende mærkning), og at de ligner in vivo MG (mikroarray af FACS-renset MG)23. Kort tid derefter blev gliamRNA og proteinekspression valideret og bekræftet i en anden tilgang ved hjælp af virale vektorer20. Et par år senere blev det bekræftet, at langt de fleste celler, der findes i disse kulturer, er MG ved hjælp af mg-specifikke Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reporter mus24. Desuden viste kvantificeringen af sættet af miRNA'er i både FACS-renset MG og dyrket primær MG, at niveauerne af MG miRNA'er (mGLiomiRs) ikke varierer meget i dyrket MG i vækstfasen. Langstrakte dyrkningsperioder forårsager imidlertid ændringer i miRNA-niveauer og følgelig i mRNA-niveauer og proteinekspression, da miRNA'er er translationelle regulatorer25.
I 2013 blev denne MG-kulturmodel brugt til at teste en række transkriptionsfaktorer med hensyn til deres evne til at omprogrammere MG til retinale neuroner20. Ascl1 viste sig at være en meget robust og pålidelig omprogrammeringsfaktor. Overekspression af Ascl1 via virale vektorer inducerede morfologiske ændringer, ekspression af neuronale markører og erhvervelse af neuronale elektrofysiologiske egenskaber. Endnu vigtigere er det, at den indsigt og de resultater, der blev opnået fra disse første in vitro-forsøg, med succes blev overført til in vivo-applikationer 22,26, hvilket viser, at primære MG-kulturer repræsenterer et solidt og pålideligt værktøj til indledende faktorscreeninger og evaluering af gliale træk inden in vivo-implementering.
For et par år siden blev det vist, at det hjerneberigede miRNA miR-124, som også er stærkt udtrykt i retinale neuroner, kan inducere Ascl1-ekspression i dyrket MG21. Ascl1-ekspression i levende celler blev visualiseret via en Ascl1-reportermus (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl). En reportermus er en gensplejset mus, der har et reportergen indsat i sit DNA. Dette reportergen koder for et reporterprotein, som i dette studie er tdTomato, et rødt fluorescerende protein. Denne reporter protein rapporterer ekspressionen af et gen af interesse, i dette tilfælde Ascl1. Med andre ord bliver celler, der udtrykker Ascl1 , røde. Da Ascl1 kun udtrykkes i RPC'er9, tillader denne Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-mus sporing af MG-konvertering til Ascl1 , der udtrykker RPC'er, hvilket betyder, at konverterende celler vil udtrykke rødt fluorescerende tdTomato reporterprotein. Dette er irreversibel mærkning, da DNA'et i disse celler ændres. Følgelig vil enhver efterfølgende neuronal differentiering blive visualiseret, fordi tdTomato-etiketten forbliver i differentierende celler. Hvis Ascl1 , der udtrykker MG-afledte RPC'er (med tdTomato-etiket), differentieres til neuroner, vil disse neuroner stadig have deres røde etiket. Denne mus tillader derfor ikke kun mærkning af MG-afledte RPC'er til levende cellebilleddannelse, men tillader også skæbnekortlægning og afstamning af disse MG-afledte (røde) RPC'er. For nylig blev sættet af miRNA'er i RPC'er identificeret, og MG-kulturer af Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermus blev brugt til at screene og teste effekten af disse miRNA'er på omprogrammeringskapacitet og effektivitet27. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, blev fundet i stand til at omprogrammere dyrket MG til Ascl1-ekspressive (Ascl1-Tomato+) celler. Disse omprogrammerede celler vedtager neuronale træk over tid, herunder neuronal morfologi (små somata og enten korte eller lange fine processer), ekspression af neuronale transkripter målt via scRNA-Seq samt ekspression af neuronale proteiner valideret via immunofluorescerende mærkning27.
Her beskriver protokollen, hvordan man dyrker og transfekterer MG fra P12-mus tilpasset fra det tidligere arbejde 21,24,27. Valgt til denne protokol er den førnævnte miRNA miR-25, et miRNA stærkt udtrykt i RPC'er, med lave ekspressionsniveauer i MG eller retinale neuroner. For at overudtrykke miR-25 efterligner murine miR-25, dvs. kunstige miRNA-molekyler. Som kontrol vælges efterligninger af et miRNA fra Caenorhabditis elegans, der ikke har nogen funktion i pattedyrceller. Visualisering af konverteringen af MG til RPC'er blev udført via RPC-reportermusen (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl), en mus med blandet baggrund (C57BL / 6, S129 og ICR-stammer). Denne dyrkning kan dog udføres med alle musestammer, herunder vildstammer. I de sidste par år er den oprindelige protokol blevet ændret for at reducere vækstfasevarigheden og den samlede kulturperiode og sikre en mere robust gliacellestatus og minimere graden af cellulær degeneration, som forekommer i længere dyrkningsperioder. Det almindelige transfektionstidsvindue blev også forlænget fra 3 timer til 2 dage. Som tidligere nævnt, selvom den nuværende protokol beskriver MG-kulturer som et værktøj til regenereringsundersøgelser, er metoden ikke kun nyttig til test af omprogrammeringsfaktorer, men kan også tilpasses til andre applikationer, herunder undersøgelser om MG-migrerende eller proliferativ adfærd, skade / celleskaderelaterede paradigmer og / eller identifikation af underliggende mekanismer og veje.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

Müller glia (MG) er den dominerende glia i neurale nethinden og kan fungere som en regenerativ kilde til retinale neuroner. I lavere hvirveldyr som fisk forekommer MG-drevet regenerering naturligt; hos pattedyr er stimulering med visse faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulation imidlertid påkrævet. Da MG kun udgør 5% af retinal cellepopulationen, er der behov for modelsystemer, der udelukkende tillader undersøgelse af denne cellepopulation. Et af disse modelsystemer er primære MG-kulturer, der er reproducerbare og kan bruges til en række forskellige applikationer, herunder molekyle / faktor screening og identifikation, test af forbindelser eller faktorer, celleovervågning og / eller funktionelle tests. Denne model bruges til at studere potentialet af murine MG til at konvertere til retinale neuroner efter tilskud eller hæmning af microRNA'er (miRNA'er) via transfektion af kunstige miRNA'er eller deres hæmmere. Brugen af MG-specifikke reportermus i kombination med immunofluorescerende mærkning og enkeltcelle RNA-sekventering (scRNA-seq) bekræftede, at 80% -90% af cellerne, der findes i disse kulturer, er MG. Ved hjælp af denne model blev det opdaget, at miRNA'er kan omprogrammere MG til retinale stamceller (RPC'er), som efterfølgende differentierer sig til neuronallignende celler. Fordelene ved denne teknik er, at miRNA-kandidater kan testes for deres effektivitet og resultat, før de anvendes i in vivo-applikationer .

Denne protokol beskriver, hvordan man dyrker MG fra P12-musens nethinder, og hvordan man omprogrammerer disse celler med miR-25 til retinale neuroner ved hjælp af Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC reportermus. Denne metode blev anvendt i tidligere arbejde, der detaljeret rapporterede andre egnede miRNA'er (efterligninger eller hæmmere, som enkeltmolekyler eller i kombination) til at omprogrammere MG til RPC, der derefter vedtager neuronale celleegenskaber27. Den...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Müller glia primære kulturer opnået fra musens nethinder repræsenterer et meget robust og pålideligt værktøj til at studere gliakonverteringen til retinale stamceller efter mikroRNA-behandling. Enkeltmolekyler eller kombinationer kan testes før deres efterfølgende anvendelse af in vivo-tilgange .

Primære cellekulturer til undersøgelse af Regenereringspotentialet for Murine Müller Glia efter MicroRNA-behandling

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Denne protokol gør det muligt at studere Muller glias potentiale og evne til at konvertere til retinale stamceller efter behandling med specifikke faktorer såsom mikroRNA'er. Fordelen ved denne teknik er, at mikroRNA-kandidater kan testes for deres effektivitet og resultat, før de bruges i in vivo-applikationer. Med til at demonstrere proceduren vil være Seoyoung Kang, en ph.d.-studerende fra Stefanie Wohls laboratorium.Dyp først det fjernede øjeæble kort i et rør med ethanol for at undgå overførsel af bakterier fra dyret. Vask derefter øjeæblet kort i den 10 centimeter lange petriskål, inden du lægger det i 24-brøndpladen på is. Når øjenkuglerne er fjernet og renset, skal du placere det ene øje i dissektionsskålen placeret under et dissekeringsmikroskop med en lyskilde.Fastgør nu det ene øjeæble ved at gribe fat i synsnerven og det omgivende bindevæv omkring scleraen med Dumont 5 fine tang og tryk det forsigtigt mod dissektionsskålen. Lav derefter et hul i hornhindecentret ved hjælp af en 30 gauge nål for at give lettere adgang til den venøse saks. Disseker derefter hornhinden omkring ciliarylegemet ved hjælp af venøs saks og fjern forsigtigt hornhinden, linsen, iris og glaslegemet med Dumont 5 fine tang.Senere dissekeres sclera med venøs saks, indtil synsnerven er nået, og træk forsigtigt nethinden ud ved hjælp af Dumont 5 fine tang. Brug nu en anden Dumont 5 fine tang til at skubbe mod nethinden og fjerne glaslegemet helt. Overfør nethinden skåret ca. 2,5 centimeter af spidsen af en steril overførselspipette for at forstørre diameteren.Brug nu dette tip, tag hele nethinden op uden at beskadige vævet og overfør nethinden til en ny steril petriskål med kold HBSS og rock fadet. Brug derefter en ny steril overførselspipette til forsigtigt at skubbe nethinden rundt for at vaske retinale pigmentepitelceller af. Placer straks den isolerede nethinde i en ny ren brønd af 24-brøndpladen fyldt med en milliliter HBSS, mens du holder 24-brøndpladen på isen under dissektionen.Forbered Papain DNase I dissociationsblanding som beskrevet i manuskriptet. Nu med en forstørret spidsoverførselspipette skal du hente nethinden. Vent, indtil nethinden sætter sig i bunden af spidsen, og slip nethinden uden overdreven HBSS i røret indeholdende Papain DNase I-blanding.Placer derefter røret på en nutator i inkubatoren og inkuberes i 10 minutter ved 37 grader Celsius og med 5% kuldioxid. Derefter adskilles cellerne ved forsigtigt at pipettere op og ned med en en milliliter pipette. Når cellerne er dissocieret, tilsættes 275 mikroliter ovomucoid proteasehæmmer fra Papain-dissociationssættet for at neutralisere Papain og blandes forsigtigt ved at pipettere op og ned.Rør anbringes i en centrifuge, og centrifugeres ved fire grader Celsius i otte minutter ved en relativ centrifugalkraft på 300. Tilføj epidermal vækstfaktor til det beregnede volumen af vækstmedium forvarmet ved 37 grader Celsius. Fjern rørene forsigtigt fra centrifugen.Uden at røre pelleten i bunden af røret skal du fjerne supernatanten forsigtigt og helt. Resuspender nu cellepellet med 500 mikroliter epidermal vækstfaktor suppleret vækstmedium. Overfør derefter cellesuspensionen til en brønd af den mærkede 12 brøndplade.Skyl røret med yderligere 500 mikroliter af den epidermale vækstfaktor suppleret vækstmedium og tilsæt det til brønden. Rock brøndpladen omhyggeligt, og læg derefter pladen i inkubatoren ved 37 grader Celsius med kuldioxid. Begynd med at kontrollere, om der er 90% til 100% cellesammenløb.Fjern derefter mediet og tilsæt en milliliter kold HBSS for at vaske brønden. Vug forsigtigt pladen og fjern HBSS uden efterladte spor. Senere tilsættes 500 mikroliter af en forvarmet trypsin indeholdende opløsning for at løsne cellerne fra brønden.Rock forsigtigt og inkubere i to minutter i 37 grader Celsius inkubator. Efter at have flyttet pladen fra inkubatoren til biosikkerhedsskabet, skal du opsuge den trypsinholdige opløsning, mens du vipper. Spred det forsigtigt og langsomt over brønden flere gange, indtil cellerne løsner sig helt.Overfør derefter denne cellesuspension til et sterilt 1,5 milliliter rør og læg rør i centrifugen. Drej 300 gange g i otte minutter ved fire grader Celsius og bring rør tilbage i biosikkerhedsskabet. Fjern supernatanten uden at røre pelleten.Resuspender nu forsigtigt cellepelleten ved at tilsætte 600 mikroliter forvarmet vækstmedium og pipettere op og ned ca. 30 til 40 gange. Endelig frø 100 mikroliter af den opnåede cellesuspension i midten af seks belagte dæksler af 24 brøndpladen. Placer pladen på inkubatoren og lad cellerne sætte sig til efterfølgende transfektion ved hjælp af mikro-RNA-efterligninger.Figuren viser kontrolforholdene fem dage efter transfektion med et par Ascl1-Tomato-positive celler til stede. Efter en miR-25-behandling findes der dog mange flere Ascl1-Tomato-positive celler. Kvantificeringen afslørede en firedobling i antallet af Ascl1-Tomato-positive celler i de miR-25-behandlede brønde sammenlignet med kontroller.Vigtigst er det, at langt størstedelen af de Ascl1-Tomato-positive celler, der findes i de riR-25-behandlede brønde, vedtog en neuronal morfologi. Funktioner af denne neuronale morfologi omfattede reduceret celle soma størrelse, udvikling af fine processer og dannelsen af små netværk. Kvantificeringen afslørede, at omkring 70% af alle Ascl1-Tomato-positive celler havde neuronale træk.Immunofluorescerende mærkning viser, at Ascl1-Tomato-positive celler med neuronal morfologi udtrykker de neurale markører OTX2 og MAP2, hvilket bekræfter neuronal identitet. Kvantificeringen af disse celler afslørede, at efter miR-25 overekspression er ca. 40 Ascl1-Tomato-positive neuroner pr. felt til stede sammenlignet med fem neuronale celler pr. felt i kontroller. De identificerede neuronale celler udgør ca. 70% af den samlede Ascl1-Tomato-positive cellepopulation af miR-25-behandlede prøver.Desuden viste kvantificering af det absolutte antal OTX2- og MAP2-coexpressing-neuroner, at der efter miR-25-behandling blev fundet ca. 60 neuroner pr. felt sammenlignet med 10 neuroner pr. felt i kontroller. Det er bydende nødvendigt at arbejde i et rent og desinficeret miljø med rent og sterilt værktøj og at arbejde omhyggeligt ved at undgå enhver hård behandling. Downstream-applikationer kan for eksempel være proteinkvantificering, DNA- eller RNA-analyse eller elektrofysiologiske undersøgelser.Denne teknik hjalp os med at udforske indledende spørgsmål om nuklear omprogrammering, der hører til området for regenerativ medicin. Og der er en lang række faktorer og forhold, der kan testes for at udforske nye spørgsmål.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiering af en human neural stamcelle Line på tredimensionelle kulturer, Analyse af MicroRNA og formodede målgener

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Anvendelse af Teton System til Undersøgelse molekylære mekanismer for zebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyt-specifik Ablation i Zebrafisk til Studieinformationen Biliær drevet Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimering af såret Scratch-analysen til at påvise ændringer i murine Mesenchymale stromacelle Migration efter skade ved Opløselig Cigaret røgekstrakt

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Udvikling af en Ethanol-induceret Fibrotiske Lever Model i Zebrafisk at studere progenitorcelle-medieret hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metode til at opnå dedifferentierede fedtceller

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Menneskelig Primær trofoblasten Cell Culture Model at studere de beskyttende virkninger af melatonin Against Hypoksi / reoxygenering-induceret Forstyrrelse

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Brug Primære Neurosfære kulturer til at studere Primær Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolering og karakterisering af primære rotte ventil interstitielle celler: en ny Model til at studere aortaklappen forkalkning

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Metoder til undersøgelse af regenerering i Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...