Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

De auteurs bedanken Dr. Ann Beaton en alle lableden voor hun input over het manuscript. Speciale dank gaat uit naar Drs. Tom Reh, Julia Pollak en Russ Taylor voor het introduceren van MG primaire culturen als een screeningsinstrument voor S.G.W. tijdens postdoctorale training aan de Universiteit van Washington in Seattle. De studie werd gefinancierd door de Empire Innovation Program (EIP) Grant aan S.G.W. en start-upfondsen van SUNY Optometry tot S.G.W., evenals de R01EY032532 award van het National Eye Institute (NEI) aan S.G.W.

Procedures met betrekking tot dierlijke proefpersonen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan het SUNY College of Optometry.
OPMERKING: Dit kweekprotocol bestaat uit drie fasen: groei, transfectie en conversiefase. Een samenvatting van het algemene protocol met de tijdlijn wordt gegeven in figuur 1.
1. Bereiding van media en alle benodigde reagentia
OPME...

Dit protocol beschrijft hoe MG kan worden gekweekt uit gedissocieerde netvliezen van muizen voor herprogrammeringsstudies met behulp van miRNA's. Zoals aangetoond en bevestigd in een verscheidenheid aan eerdere studies, is de overgrote meerderheid (80% -90%) van de cellen in deze culturen MG 20,23,24. Deze methode is een zeer robuuste en betrouwbare techniek en de resultaten kunnen gemakkelijk worden gereproduceerd als het proto...

De Müller glia (MG) zijn de overheersende glia in het neurale netvlies. Ze hebben vergelijkbare functies in vergelijking met andere glia in andere delen van het centrale zenuwstelsel, zoals het handhaven van de water- en ionhomeostase, het voeden van neuronen en het beschermen van het weefsel. MG hebben nog een fascinerend kenmerk: hoewel ze volwassen glia zijn, brengen ze nog steeds veel genen tot expressie die tot expressie komen in retinale voorlopercellen (RPC's) tijdens de late ontwikkeling 1,2. Deze gelijkenis wordt verondersteld de reden te zijn voor de natuurlijk voorkomende op MG gebaseerde neuronale regeneratie in het netvlies van vissen na retinale schade 3,4. Tijdens dit proces komt MG opnieuw in de celcyclus en de-differentieert in RPC's die vervolgens differentiëren in alle zes soorten retinale neuronen. Hoewel dit fenomeen van nature voorkomt bij vissen, zet mg van zoogdieren niet om in neuronen 5,6. Ze kunnen echter worden geherprogrammeerd. Van een verscheidenheid aan factoren is aangetoond dat ze MG herprogrammeren in RPC's / neuronen; een van deze factoren is de basis helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactor achaete-scute homoloog 1 (Ascl1) die betrokken is bij visregeneratie 7,8. Bij muizen komt Ascl1 alleen tot expressie in RPC's tijdens retinogenese, maar is afwezig in volwassen MG- of retinale neuronen9.
Het direct in vivo herprogrammeren van cellen is niet alleen methodologisch uitdagend, maar vereist ook goedkeuring van een instellingscommissie voor dierverzorging en -gebruik. Om goedkeuring te krijgen, zijn voorlopige gegevens nodig over de gebruikte of gewijzigde factor(en), concentraties, off-target effecten, onderliggende mechanismen, toxiciteit en efficiëntie. Celkweeksystemen maken het mogelijk om deze criteria te testen voordat ze in in vivo modellen worden gebruikt. Bovendien, aangezien MG slechts ongeveer 5% van de gehele retinale celpopulatie10 omvat, maken MG-culturen de studie van hun functie11 en hun gedrag mogelijk, inclusief migratie12,13, proliferatie14, stressreactie op letsel / schade15,16, hun interactie met andere celtypen zoals microglia17 of retinale ganglioncellen (RGC's)18, of hun neurogene potentieel 19,20,21. Veel onderzoekers gebruiken onsterfelijke cellijnen voor hun studies, omdat ze een onbeperkt proliferatief potentieel hebben en gemakkelijk kunnen worden onderhouden en getransfecteerd. Primaire cellen hebben echter de voorkeur voor biologisch relevante testen dan vereeuwigde cellen, omdat ze echte celkenmerken hebben (gen- en eiwitexpressie) en, nog belangrijker, ze vertegenwoordigen een bepaald stadium in ontwikkeling en hebben daarom een "leeftijd". De leeftijd van een dier (en bijgevolg van de cellen verkregen van een dier) is een bijzonder cruciale factor bij cellulaire herprogrammering, omdat de plasticiteit van cellen afneemt met het gevorderde stadium van ontwikkeling22.
Dit protocol beschrijft in detail hoe primaire MG met miRNA's kan worden geherprogrammeerd als een huidige in vitro methode voor het bestuderen van regeneratie. Dit MG primaire kweekmodel werd in 2012 opgericht om celproliferatiekenmerken van MG te evalueren bij P53 knock-out muizen (trp53-/- muizen)23. Er werd aangetoond dat gekweekte MG hun gliale kenmerken behouden (d.w.z. expressie van S100β-, Pax6- en Sox2-eiwitten geëvalueerd via immunofluorescente etikettering), en dat ze lijken op in vivo MG (microarray van FACS-gezuiverde MG)23. Kort daarna werden gliale mRNA en eiwitexpressie gevalideerd en bevestigd in een andere benadering met behulp van virale vectoren20. Een paar jaar later werd bevestigd dat de overgrote meerderheid van de cellen in deze culturen MG zijn met behulp van de MG-specifieke Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reporter mouse24. Bovendien toonde kwantificering van de set miRNA's in zowel FACS-gezuiverde MG als gekweekte primaire MG aan dat de niveaus van MG miRNA's (mGLiomiRs) niet veel variëren in gekweekte MG tijdens de groeifase. Langgerekte kweekperioden veroorzaken echter veranderingen in miRNA-niveaus en bijgevolg in mRNA-niveaus en eiwitexpressie, aangezien miRNA's translationele regulatoren zijn25.
In 2013 werd dit MG-cultuurmodel gebruikt om een verscheidenheid aan transcriptiefactoren te testen met betrekking tot hun vermogen om MG te herprogrammeren in retinale neuronen20. Ascl1 bleek een zeer robuuste en betrouwbare herprogrammeringsfactor te zijn. Overexpressie van Ascl1 via virale vectoren veroorzaakte morfologische veranderingen, expressie van neuronale markers en de verwerving van neuronale elektrofysiologische eigenschappen. Wat nog belangrijker is, de inzichten en resultaten verkregen uit deze eerste in vitro experimenten werden met succes overgebracht naar in vivo toepassingen22,26 wat aantoont dat primaire MG-culturen een solide en betrouwbaar hulpmiddel vormen voor initiële factorscreenings en evaluatie van gliale kenmerken voorafgaand aan in vivo implementatie.
Een paar jaar geleden werd aangetoond dat het met de hersenen verrijkte miRNA miR-124, dat ook sterk tot expressie komt in retinale neuronen, Ascl1-expressie kan induceren in gekweekte MG21. Ascl1-expressie in levende cellen werd gevisualiseerd via een Ascl1 reportermuis (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Een reportermuis is een genetisch gemanipuleerde muis waarvan een reporter-gen in zijn DNA is ingebracht. Dit reporter-gen codeert voor een reporter-eiwit, dat in deze studie tdTomato is, een rood fluorescerend eiwit. Dit reporter-eiwit rapporteert de expressie van een gen van belang, in dit geval Ascl1. Met andere woorden, cellen die Ascl1 tot expressie brengen, worden rood. Aangezien Ascl1 alleen tot expressie komt in RPC's9, maakt deze Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl muis het mogelijk om mg-conversie te volgen in Ascl1-expresserende RPC's, wat betekent dat converterende cellen rode fluorescerende tdTomato-reportereiwitten tot expressie zullen brengen. Dit is onomkeerbare etikettering omdat het DNA van deze cellen is veranderd. Bijgevolg zal elke daaropvolgende neuronale differentiatie worden gevisualiseerd omdat het tdTomato-label in differentiërende cellen blijft. Als Ascl1-expressie mg-afgeleide RPC's (met tdTomato-label) differentiëren in neuronen, zullen deze neuronen nog steeds hun rode label hebben. Deze muis maakt daarom niet alleen de etikettering van MG-afgeleide RPC's mogelijk voor live-cell imaging, maar maakt ook fate mapping en lineage tracing van deze MG-afgeleide (rode) RPC's mogelijk. Meer recent werd de set miRNA's in RPC's geïdentificeerd en werden MG-culturen van Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter-muizen gebruikt om het effect van deze miRNA's op herprogrammeringscapaciteit en efficiëntie te screenen en te testen27. Eén kandidaat, de RPC-miRNA miR-25, bleek in staat om gekweekte MG te herprogrammeren in Ascl1-expressie (Ascl1-Tomato+) cellen. Deze geherprogrammeerde cellen nemen in de loop van de tijd neuronale kenmerken aan, waaronder neuronale morfologie (kleine somata en korte of lange fijne processen), expressie van neuronale transcripten gemeten via scRNA-Seq, evenals expressie van neuronale eiwitten gevalideerd via immunofluorescente etikettering27.
Hier beschrijft het protocol hoe MG te kweken en te transfecteren van P12-muizen aangepast van het vorige werk 21,24,27. Gekozen voor dit protocol is het eerder genoemde miRNA miR-25, een miRNA dat sterk tot expressie komt in RPC's, met lage expressieniveaus in MG of retinale neuronen. Om miR-25 te overexpressie te geven, worden murine miR-25-mimiek, d.w.z. kunstmatige miRNA-moleculen gebruikt. Als controle worden mimics van een miRNA van Caenorhabditis elegans gekozen, die geen functie hebben in zoogdiercellen. Visualisatie van de omzetting van MG in RPC's werd bereikt via de RPC reporter muis (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), een muis met gemengde achtergrond (C57BL/6, S129 en ICR stammen). Deze kweek kan echter worden uitgevoerd met alle muizenstammen, inclusief wildtype stammen. In de afgelopen jaren is het oorspronkelijke protocol aangepast om de duur van de groeifase en de algehele kweekperiode te verminderen en een robuustere gliacelstatus te garanderen en de mate van cellulaire degeneratie, die optreedt in langdurige kweekperioden, te minimaliseren. Het reguliere transfectietijdvenster werd ook verlengd van 3 uur naar 2 dagen. Zoals eerder vermeld, hoewel het huidige protocol MG-culturen beschrijft als een hulpmiddel voor regeneratiestudies, is de methode niet alleen nuttig voor het testen van herprogrammeringsfactoren, maar kan deze ook worden aangepast voor andere toepassingen, waaronder studies over MG-migratie of proliferatief gedrag, letsel / celschade gerelateerde paradigma's en / of de identificatie van onderliggende mechanismen en paden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

Müller glia (MG) zijn de overheersende glia in het neurale netvlies en kunnen functioneren als een regeneratieve bron voor retinale neuronen. Bij lagere gewervelde dieren zoals vissen vindt MG-gedreven regeneratie van nature plaats; bij zoogdieren is echter stimulatie met bepaalde factoren of genetische/epigenetische manipulatie vereist. Aangezien MG slechts 5% van de retinale celpopulatie uitmaakt, is er behoefte aan modelsystemen die de studie van deze celpopulatie uitsluitend mogelijk maken. Een van deze modelsystemen zijn primaire MG-culturen die reproduceerbaar zijn en kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder moleculen / factorscreening en -identificatie, testen van verbindingen of factoren, celmonitoring en / of functionele tests. Dit model wordt gebruikt om het potentieel van muizen-MG te bestuderen om te converteren in retinale neuronen na suppletie of remming van microRNA's (miRNA's) via transfectie van kunstmatige miRNA's of hun remmers. Het gebruik van MG-specifieke reportermuizen in combinatie met immunofluorescente etikettering en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) bevestigde dat 80% -90% van de cellen in deze culturen MG zijn. Met behulp van dit model werd ontdekt dat miRNA's MG kunnen herprogrammeren in retinale voorlopercellen (RPC's), die vervolgens differentiëren in neuronaal-achtige cellen. De voordelen van deze techniek zijn dat miRNA-kandidaten kunnen worden getest op hun efficiëntie en uitkomst voordat ze in in vivo toepassingen worden gebruikt.

Dit protocol beschrijft hoe MG uit de retinas van P12-muizen kan groeien en hoe deze cellen met miR-25 kunnen worden geherprogrammeerd tot retinale neuronen met behulp van de Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermuis. Deze methode werd gebruikt in eerder werk dat in detail andere geschikte miRNA's (mimics of remmers, als enkele moleculen of in combinatie) rapporteerde om MG te herprogrammeren in RPC die vervolgens neuronale celkenmerken aannemen27. Deze metho...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Müller glia primaire culturen verkregen uit het netvlies van muizen vormen een zeer robuust en betrouwbaar hulpmiddel om de gliale omzetting in retinale voorlopercellen na microRNA-behandeling te bestuderen. Afzonderlijke moleculen of combinaties kunnen worden getest voordat ze vervolgens in vivo worden toegepast.

Primaire celculturen om het regeneratiepotentieel van Murine Müller Glia na microRNA-behandeling te bestuderen

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Dit protocol maakt het mogelijk om het potentieel en het vermogen van Muller-glia te bestuderen om na behandeling met specifieke factoren zoals microRNA's om te zetten in retinale voorlopercellen. Het voordeel van deze techniek is dat microRNA-kandidaten kunnen worden getest op hun efficiëntie en uitkomst voordat ze in in vivo toepassingen worden gebruikt. Seoyoung Kang, een promovendus uit het laboratorium van Stefanie Wohl, zal helpen om de procedure te demonstreren.Dompel eerst de verwijderde oogbol kort in een buis met ethanol om overdracht van bacteriën van het dier te voorkomen. Was vervolgens de oogbol kort in de petrischaal van 10 centimeter voordat u deze in de 24 putplaat op ijs plaatst. Zodra de oogbollen zijn verwijderd en gereinigd, plaatst u één oog in de dissectieschaal die onder een ontleedmicroscoop met een lichtbron wordt geplaatst.Fixeer nu één oogbol door de oogzenuw en het omliggende bindweefsel rond de sclera te grijpen met Dumont 5 fijne tang en druk deze voorzichtig tegen de dissectieschaal. Maak vervolgens een gat in het hoornvliescentrum met behulp van een naald van 30 gauge om gemakkelijker toegang te krijgen voor de veneuze schaar. Ontleed vervolgens het hoornvlies rond het ciliaire lichaam met een veneuze schaar en verwijder voorzichtig het hoornvlies, de lens, de iris en het glasachtig lichaam met Dumont 5 fijne tangen.Ontleed de sclera later met een veneuze schaar tot de oogzenuw is bereikt en haal voorzichtig het netvlies eruit met dumont 5 fijne tang. Gebruik nu een tweede Dumont 5 fijne tang om tegen het netvlies te duwen en het glasvochtlichaam volledig te verwijderen. Breng de netvliezen over en snijd ongeveer 2,5 centimeter van de punt van een steriele transferpipet om de diameter te vergroten.Gebruik nu deze tip, pak hele netvliezen op zonder het weefsel te beschadigen en breng de netvliezen over in een nieuwe steriele petrischaal met koude HBSS en schommel het gerecht. Duw vervolgens met behulp van een nieuwe steriele transferpipet voorzichtig de netvliezen rond om retinale pigmentepitheelcellen af te spoelen. Plaats het geïsoleerde netvlies onmiddellijk in een nieuwe schone put van de 24 putplaat gevuld met één milliliter HBSS terwijl de 24 putplaat op het ijs blijft tijdens de dissectie.Bereid Papain DNase I dissociatiemengsel zoals beschreven in het manuscript. Pak nu met een vergrote pipet de netvliezen op. Wacht tot de netvliezen zich aan de onderkant van de punt nestelen en laat de netvliezen zonder overmatig HBSS los in de buis met Papain DNase I-mengsel.Plaats vervolgens de buis op een nutator in de incubator en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en met 5% koolstofdioxide. Dissociëer vervolgens de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren met een pipet van één milliliter. Nadat cellen zijn gedissocieerd, voegt u 275 microliter ovomucoïde proteaseremmer uit de Papain-dissociatiekit toe om de Papaïne te neutraliseren en voorzichtig te mengen door op en neer te pipetteren.Plaats buizen in een centrifuge en draai gedurende acht minuten op vier graden Celsius bij een relatieve centrifugale kracht van 300. Voeg epidermale groeifactor toe aan het berekende volume groeimedium dat is voorverwarmd bij 37 graden Celsius. Verwijder de buisjes voorzichtig uit de centrifuge.Zonder de pellet aan de onderkant van de buis aan te raken, verwijdert u het supernatant voorzichtig en volledig. Resuspendeer nu de celpellet met 500 microliter epidermale groeifactor aangevuld groeimedium. Breng vervolgens de celsuspensie over in een put van de gelabelde 12 putplaat.Spoel de buis af met nog eens 500 microliter van de epidermale groeifactor aangevuld groeimedium en voeg deze toe aan de put. Schommel de putplaat voorzichtig en plaats de plaat in de incubator op 37 graden Celsius met koolstofdioxide. Begin met het controleren op 90% tot 100% celconfluentie.Verwijder vervolgens het medium en voeg een milliliter koude HBSS toe om de put te wassen. Schommel de plaat voorzichtig en verwijder HBSS zonder sporen achter te laten. Voeg later 500 microliter van een voorverwarmde trypsinehoudende oplossing toe om de cellen van de put los te maken.Schommel zachtjes en incubeer gedurende twee minuten in de incubator van 37 graden Celsius. Nadat u de plaat van de incubator naar de bioveiligheidskast hebt verplaatst, ademt u de trypsinehoudende oplossing tijdens het kantelen. Verspreid het voorzichtig en langzaam over de put meerdere keren totdat de cellen volledig loskomen.Breng vervolgens deze celsuspensie over in een steriele buis van 1,5 milliliter en plaats buizen in de centrifuge. Draai op 300 keer g gedurende acht minuten bij vier graden Celsius en breng buizen terug in de bioveiligheidskast. Verwijder het supernatant zonder de pellet aan te raken.Resuspendeer nu voorzichtig de celpellet door 600 microliter voorverwarmd groeimedium toe te voegen en ongeveer 30 tot 40 keer op en neer te pipetteren. Ten slotte zaad 100 microliter van de verkregen celsuspensie in het midden van zes gecoate afdekslips van de 24 putplaat. Plaats de plaat op de incubator en laat de cellen genoegen nemen voor volgende transfectie met behulp van micro-RNA-nabootsingen.De figuur toont de controleomstandigheden vijf dagen na transfectie met een paar Ascl1-Tomato positieve cellen aanwezig. Na een miR-25 behandeling worden echter veel meer Ascl1-Tomato positieve cellen gevonden. De kwantificering onthulde een viervoudige toename van het aantal Ascl1-Tomato-positieve cellen in de miR-25 behandelde putten in vergelijking met controles.Het belangrijkste is dat de overgrote meerderheid van de Ascl1-Tomato-positieve cellen in de met riR-25 behandelde putten een neuronale morfologie heeft aangenomen. Kenmerken van deze neuronale morfologie waren onder meer een verminderde cel somagrootte, de ontwikkeling van fijne processen en de vorming van kleine netwerken. De kwantificering onthulde dat ongeveer 70% van alle Ascl1-Tomato positieve cellen neuronale kenmerken hadden.Immunofluorescente etikettering toont aan dat Ascl1-Tomato-positieve cellen met neuronale morfologie de neurale markers OTX2 en MAP2 tot expressie brengen, wat de neuronale identiteit bevestigt. De kwantificering van deze cellen onthulde dat na miR-25 overexpressie ongeveer 40 Ascl1-Tomato positieve neuronen per veld aanwezig zijn in vergelijking met vijf neuronale cellen per veld in controles. De geïdentificeerde neuronale cellen vormen ongeveer 70% van de totale Ascl1-Tomato positieve celpopulatie van de met miR-25 behandelde monsters.Bovendien toonde kwantificering van het absolute aantal OTX2- en MAP2-coexpressieneuronen aan dat na miR-25-behandeling ongeveer 60 neuronen per veld werden gevonden in vergelijking met 10 neuronen per veld in controles. Het is absoluut noodzakelijk om in een schone en gereinigde omgeving te werken met schoon en steriel gereedschap en om zorgvuldig te werken door elke harde behandeling te vermijden. Downstream-toepassingen kunnen bijvoorbeeld eiwitkwantificering, DNA- of RNA-analyse of elektrofysiologische studies zijn.Deze techniek hielp ons om de eerste vragen over nucleaire herprogrammering te onderzoeken die behoort tot het gebied van regeneratieve geneeskunde. En er is een lange reeks factoren en voorwaarden die kunnen worden getest om nieuwe vragen te verkennen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiatie van een menselijke neurale stamcellen Line op Three Dimensional Culturen, Analyse van MicroRNA en vermeende doelwit-genen

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Gebruik van de Teton systeem om te studeren moleculaire mechanismen van zebravis Regeneratie

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyt-specifieke Ablation in zebravis-Biliary gedreven leverregeneratie Studie

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimalisatie van de wond Scratch Assay om veranderingen in muizen mesenchymale Stromal Cell Migratie Detect Na Schade door Oplosbare sigarettenrook Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Een efficiënte methode om gededifferentieerde Fat cellen te verkrijgen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Human Primary Trofoblast Cell Cultuur aan de beschermende effecten van melatonine tegen hypoxie Studie / reoxygenation-geïnduceerde Disruption

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Met behulp van Primary neurosfeerculturen om te studeren Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolatie en karakterisatie van primaire Rat klep interstitiële cellen: een nieuw Model voor het bestuderen van verkalking van de aortaklep

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methoden voor de studie van regeneratie in de Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...