Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Ann Beaton und allen Labormitgliedern für ihren Beitrag zum Manuskript. Besonderer Dank geht an Dr. Tom Reh, Dr. Julia Pollak und Dr. Russ Taylor für die Einführung von MG-Primärkulturen als Screening-Tool für S.G.W. während der Postdoc-Ausbildung an der University of Washington in Seattle. Die Studie wurde durch den Empire Innovation Program (EIP) Grant an S.G.W. und Start-up-Mittel von SUNY Optometry an S.G.W. sowie den R01EY032532 Award des National Eye Institute (NEI) an S.G.W. finanziert.

Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am SUNY College of Optometry genehmigt.
HINWEIS: Dieses Kulturprotokoll besteht aus drei Phasen: Wachstums-, Transfektions- und Konversionsphase. Eine Zusammenfassung des Gesamtprotokolls mit dem Zeitplan ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Aufbereitung von Medien und allen erforderlichen Reagenzien
<p class="jove_content"...

Dieses Protokoll beschreibt, wie MG aus dissoziierten Mausnetzhäuten für Reprogrammierungsstudien mit miRNAs gezüchtet werden kann. Wie in einer Vielzahl früherer Studien gezeigt und bestätigt wurde, ist die überwiegende Mehrheit (80% -90%) der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG20,23,24. Diese Methode ist eine sehr robuste und zuverlässige Technik und die Ergebnisse können leicht reproduziert werden, wenn das Protok...

Die Müllerglia (MG) sind die vorherrschenden Gliazellen in der neuronalen Netzhaut. Sie haben ähnliche Funktionen im Vergleich zu anderen Gliazellen in anderen Teilen des zentralen Nervensystems, wie z.B. die Aufrechterhaltung der Wasser- und Ionenhomöostase, die Ernährung von Neuronen und den Schutz des Gewebes. MG haben eine weitere faszinierende Eigenschaft: Obwohl sie reife Gliazellen sind, exprimieren sie immer noch viele Gene, die in retinalen Vorläuferzellen (RPCs) während der späten Entwicklung exprimiertwerden 1,2. Es wird angenommen, dass diese Ähnlichkeit der Grund für die natürlich vorkommende MG-basierte neuronale Regeneration in der Netzhaut der Fische nach Netzhautschädenist 3,4. Während dieses Prozesses tritt MG wieder in den Zellzyklus ein und dedifferenziert sich in RPCs, die sich dann in alle sechs Arten von Netzhautneuronen differenzieren. Obwohl dieses Phänomen natürlich bei Fischen auftritt, wandeln sich MG von Säugetieren nicht in Neuronenum 5,6. Sie können jedoch umprogrammiert werden. Es wurde gezeigt, dass eine Vielzahl von Faktoren MG in RPCs / Neuronen umprogrammiert; Zu diesen Faktoren gehört der grundlegende Helix-Loop-Helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor achaete-scute homolog 1 (Ascl1), der an der Fischregeneration beteiligt ist 7,8. Bei Mäusen wird Ascl1 während der Retinogenese nur in RPCs exprimiert, fehlt jedoch in reifen MG- oder retinalen Neuronen9.
Die direkte Reprogrammierung von Zellen in vivo ist nicht nur eine methodische Herausforderung, sondern erfordert auch die Genehmigung eines institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung. Um die Zulassung zu erhalten, sind vorläufige Daten über die verwendeten oder veränderten Faktoren, Konzentrationen, Off-Target-Effekte, zugrunde liegende Mechanismen, Toxizität und Effizienz erforderlich. Zellkultursysteme ermöglichen es, diese Kriterien vor der Verwendung in In-vivo-Modellen zu testen. Da MG nur etwa 5% der gesamten retinalen Zellpopulationausmachen 10, ermöglichen MG-Kulturen die Untersuchung ihrer Funktion 11 sowie ihres Verhaltens, einschließlich Migration 12,13, Proliferation 14, Stressreaktion auf Verletzungen/Schäden15,16, ihrer Interaktion mit anderen Zelltypen wie Mikroglia 17 oder retinalen Ganglienzellen (RGCs)18, oder ihr neurogenes Potential 19,20,21. Viele Forscher verwenden immortalisierte Zelllinien für ihre Studien, da sie ein unbegrenztes proliferatives Potenzial haben und leicht aufrechterhalten und transfiziert werden können. Primärzellen sind jedoch für biologisch relevante Assays besser geeignet als unsterbliche Zellen, da sie echte Zelleigenschaften (Gen- und Proteinexpression) aufweisen und, was noch wichtiger ist, ein bestimmtes Entwicklungsstadium darstellen und daher ein "Alter" haben. Das Alter eines Tieres (und folglich der von einem Tier gewonnenen Zellen) ist ein besonders entscheidender Faktor bei der zellulären Reprogrammierung, da die Zellplastizität mit fortschreitendem Entwicklungsstadium abnimmt22.
Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie primäres MG mit miRNAs als aktuelle In-vitro-Methode zur Untersuchung der Regeneration umprogrammiert werden kann. Dieses MG-Primärkulturmodell wurde 2012 etabliert, um die Zellproliferationseigenschaften von MG in P53-Knock-out-Mäusen (trp53-/- Mäuse)23 zu bewerten. Es wurde gezeigt, dass kultivierte MG ihre Gliaeigenschaften beibehalten (d. h. Expression von S100β-, Pax6- und Sox2-Proteinen, die über Immunfluoreszenzmarkierung bewertet werden) und dass sie in vivo MG (Microarray of FACS-gereinigtem MG)23 ähneln. Kurz darauf wurden gliale mRNA und Proteinexpression validiert und in einem anderen Ansatz mit viralen Vektorenbestätigt 20. Einige Jahre später wurde bestätigt, dass die überwiegende Mehrheit der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG ist, indem die MG-spezifische Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl Reportermaus24 verwendet wurde. Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung des Satzes von miRNAs sowohl in FACS-gereinigtem MG als auch in kultiviertem primärem MG, dass die Spiegel von MG-miRNAs (mGLiomiRs) in kultiviertem MG während der Wachstumsphase nicht sehr unterschiedlich sind. Verlängerte Kulturperioden verursachen jedoch Veränderungen der miRNA-Spiegel und folglich der mRNA-Spiegel und der Proteinexpression, da miRNAs translationale Regulatorensind 25.
Im Jahr2013 wurde dieses MG-Kulturmodell verwendet, um eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren in Bezug auf ihre Fähigkeit zu testen, MG in retinale Neuronen 20 umzuprogrammieren. Ascl1 erwies sich als sehr robuster und zuverlässiger Reprogrammierungsfaktor. Die Überexpression von Ascl1 über virale Vektoren induzierte morphologische Veränderungen, die Expression neuronaler Marker und den Erwerb neuronaler elektrophysiologischer Eigenschaften. Noch wichtiger ist, dass die Erkenntnisse und Ergebnisse aus diesen ersten In-vitro-Experimenten erfolgreich auf In-vivo-Anwendungenübertragen wurden 22,26, die zeigen, dass primäre MG-Kulturen ein solides und zuverlässiges Werkzeug für anfängliche Faktor-Screenings und die Bewertung von Glia-Merkmalen vor der In-vivo-Implementierung darstellen. 
Vor einigen Jahren wurde gezeigt, dass die mit dem Gehirn angereicherte miRNA miR-124, die auch in retinalen Neuronen hoch exprimiert wird, die Ascl1-Expression in kultiviertem MG21 induzieren kann. Die Ascl1-Expression in lebenden Zellen wurde über eine Ascl1-Reportermaus (Ascl1 CreERT:tdTomato STOPfl/fl) visualisiert. Eine Reportermaus ist eine gentechnisch veränderte Maus, in deren DNA ein Reportergen eingefügt wurde. Dieses Reporter-Gen kodiert für ein Reporterprotein, das in dieser Studie tdTomato, ein rot fluoreszierendes Protein, ist. Dieses Reporterprotein berichtet über die Expression eines Gens von Interesse, in diesem Fall Ascl1. Mit anderen Worten, Zellen, die Ascl1 ausdrücken, werden rot. Da Ascl1 nur in RPCs9 exprimiert wird, ermöglicht diese Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl-Maus die Verfolgung der MG-Umwandlung in Ascl1-exprimierende RPCs, was bedeutet, dass die Umwandlung von Zellen rot fluoreszierendes tdTomaten-Reporterprotein exprimiert. Dies ist eine irreversible Markierung, da die DNA dieser Zellen verändert ist. Folglich wird jede nachfolgende neuronale Differenzierung visualisiert, da die tdTomato-Markierung in differenzierenden Zellen verbleibt. Wenn Ascl1-exprimierende MG-abgeleitete RPCs (mit tdTomato-Label) in Neuronen differenzieren, haben diese Neuronen immer noch ihre rote Markierung. Diese Maus ermöglicht daher nicht nur die Markierung von MG-abgeleiteten RPCs für die Live-Cell-Bildgebung, sondern ermöglicht auch die Schicksalskartierung und Abstammungsverfolgung dieser MG-abgeleiteten (roten) RPCs. In jüngerer Zeit wurde der Satz von miRNAs in RPCs identifiziert und MG-Kulturen von Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-Reporter-Mäusen wurden verwendet, um die Wirkung dieser miRNAs auf die Reprogrammierungskapazität und -effizienz zu screenen und zu testen27. Ein Kandidat, die RPC-miRNA miR-25, wurde in der Lage befunden, kultiviertes MG in Ascl1-exprimierende (Ascl1-Tomato+) Zellen umzuprogrammieren. Diese reprogrammierten Zellen nehmen im Laufe der Zeit neuronale Merkmale an, einschließlich der neuronalen Morphologie (kleine Somata und entweder kurze oder lange Feinprozesse), der Expression neuronaler Transkripte, die über scRNA-Seq gemessen werden, sowie der Expression neuronaler Proteine, die über Immunfluoreszenzmarkierung validiert wurden27.
Hier beschreibt das Protokoll, wie MG von P12-Mäusen gezüchtet und transfiziert werden kann, angepasst an die vorherige Arbeit21,24,27. Für dieses Protokoll wurde die oben erwähnte miRNA miR-25 ausgewählt, eine miRNA, die in RPCs hoch exprimiert wird, mit niedrigen Expressionsspiegeln in MG- oder Netzhautneuronen. Um miR-25 zu überexprimieren, werden murine miR-25-Moleküle verwendet, d.h. künstliche miRNA-Moleküle. Zur Kontrolle werden Nachahmungen einer miRNA aus Caenorhabditis elegans gewählt, die in Säugetierzellen keine Funktion haben. Die Visualisierung der Umwandlung von MG in RPCs erfolgte über die RPC-Reportermaus (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), eine Maus mit gemischtem Hintergrund (C57BL/6, S129 und ICR-Dehnungen). Diese Kultur kann jedoch mit allen Mausstämmen, einschließlich Wildtyp-Stämmen, durchgeführt werden. In den letzten Jahren wurde das ursprüngliche Protokoll modifiziert, um die Dauer der Wachstumsphase und die Gesamtkulturperiode zu reduzieren und einen robusteren Gliazellenstatus zu gewährleisten und den Grad der zellulären Degeneration, die in längeren Kulturperioden auftritt, zu minimieren. Auch das reguläre Transfektionszeitfenster wurde von 3 h auf 2 Tage verlängert. Obwohl das aktuelle Protokoll MG-Kulturen als Werkzeug für Regenerationsstudien beschreibt, ist die Methode nicht nur zum Testen von Reprogrammierungsfaktoren nützlich, sondern kann auch für andere Anwendungen angepasst werden, einschließlich Studien über MG-Migrations- oder Proliferationsverhalten, Verletzungs- / Zellschadensparadigmen und / oder die Identifizierung zugrunde liegender Mechanismen und Signalwege.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

Müller-Glia (MG) sind die vorherrschenden Gliazellen in der neuronalen Netzhaut und können als regenerative Quelle für retinale Neuronen fungieren. Bei niederen Wirbeltieren wie Fischen findet die MG-getriebene Regeneration auf natürliche Weise statt; Bei Säugetieren ist jedoch eine Stimulation mit bestimmten Faktoren oder eine genetische/epigenetische Manipulation erforderlich. Da MG nur 5% der retinalen Zellpopulation ausmachen, besteht ein Bedarf an Modellsystemen, die ausschließlich die Untersuchung dieser Zellpopulation ermöglichen. Eines dieser Modellsysteme sind primäre MG-Kulturen, die reproduzierbar sind und für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden können, einschließlich Molekül- / Faktor-Screening und -Identifizierung, Testen von Verbindungen oder Faktoren, Zellüberwachung und / oder Funktionstests. Dieses Modell wird verwendet, um das Potenzial von murinem MG zu untersuchen, sich nach Supplementierung oder Hemmung von microRNAs (miRNAs) durch Transfektion künstlicher miRNAs oder ihrer Inhibitoren in retinale Neuronen umzuwandeln. Die Verwendung von MG-spezifischen Reportermäusen in Kombination mit Immunfluoreszenzmarkierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bestätigte, dass 80% -90% der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG sind. Mit diesem Modell wurde entdeckt, dass miRNAs MG in retinale Vorläuferzellen (RPCs) umprogrammieren können, die sich anschließend in neuronale Zellen differenzieren. Die Vorteile dieser Technik bestehen darin, dass miRNA-Kandidaten vor ihrer Verwendung in In-vivo-Anwendungen auf ihre Effizienz und ihr Ergebnis getestet werden können.

Dieses Protokoll beschreibt, wie man MG aus P12-Maus-Netzhäuten züchtet und wie man diese Zellen mit miR-25 mit der Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-Reportermaus in Netzhautneuronen umprogrammiert. Diese Methode wurde in früheren Arbeiten verwendet, in denen detailliert über andere geeignete miRNAs (Mimics oder Inhibitoren, als Einzelmoleküle oder in Kombination) berichtet wurde, um MG in RPC umzuprogrammieren, die dann neuronale Zelleigenschaften annehmen27. D...

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Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Müller-Glia-Primärkulturen, die aus Mausnetzhaut gewonnen werden, stellen ein sehr robustes und zuverlässiges Werkzeug dar, um die Umwandlung von Gliazellen in retinale Vorläuferzellen nach einer microRNA-Behandlung zu untersuchen. Einzelne Moleküle oder Kombinationen können vor der anschließenden Anwendung von In-vivo-Ansätzen getestet werden.

Primäre Zellkulturen zur Untersuchung des Regenerationspotenzials von murinen Müller-Glia nach MicroRNA-Behandlung

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, das Potenzial und die Fähigkeit von Muller-Gliazellen zu untersuchen, sich nach der Behandlung mit spezifischen Faktoren wie microRNAs in retinale Vorläuferzellen umzuwandeln. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass microRNA-Kandidaten vor ihrer Verwendung in In-vivo-Anwendungen auf ihre Effizienz und ihr Ergebnis getestet werden können. Bei der Demonstration des Verfahrens hilft Seoyoung Kang, Doktorandin aus dem Labor von Stefanie Wohl.Tauchen Sie zuerst den entfernten Augapfel kurz in ein Röhrchen mit Ethanol, um die Verschleppung von Bakterien aus dem Tier zu vermeiden. Dann waschen Sie den Augapfel kurz in der 10 Zentimeter großen Petrischale, bevor Sie ihn in die 24-Well-Platte auf Eis legen. Sobald die Augäpfel entfernt und gereinigt sind, legen Sie ein Auge in die Präzierschale, die unter einem Seziermikroskop mit einer Lichtquelle platziert ist.Befestigen Sie nun einen Augapfel, indem Sie den Sehnerv und das umgebende Bindegewebe um die Sklera mit einer Dumont 5 feinen Pinzette greifen und vorsichtig gegen die Präzierschale drücken. Als nächstes machen Sie ein Loch in der Hornhautmitte mit einer 30-Gauge-Nadel, um einen leichteren Zugang für die Venenschere zu ermöglichen. Dann sezieren Sie die Hornhaut um den Ziliarkörper mit einer Venenschere und entfernen Sie Hornhaut, Linse, Iris und Glaskörper vorsichtig mit Dumont 5 feiner Pinzette.Später sezieren Sie die Sklera mit einer Venenschere, bis der Sehnerv erreicht ist, und extrahieren Sie die Netzhaut vorsichtig mit einer feinen Pinzette Dumont 5. Verwenden Sie nun eine zweite Dumont 5 feine Pinzette, um gegen die Netzhaut zu drücken und den Glaskörper vollständig zu entfernen. Übertragen Sie die Netzhaut, die etwa 2,5 Zentimeter von der Spitze einer sterilen Transferpipette geschnitten wird, um den Durchmesser zu vergrößern.Nehmen Sie nun mit diesem Tipp ganze Netzhäute auf, ohne das Gewebe zu beschädigen, und übertragen Sie die Netzhaut in eine neue sterile Petrischale mit kaltem HBSS und rocken Sie die Schale. Als nächstes schieben Sie die Netzhaut mit einer neuen sterilen Transferpipette vorsichtig herum, um die Netzhautpigmentepithelzellen abzuwaschen. Legen Sie die isolierte Netzhaut sofort in eine neue saubere Vertiefung der 24-Well-Platte, die mit einem Milliliter HBSS gefüllt ist, während Sie die 24-Well-Platte während der Dissektion auf dem Eis halten.Bereiten Sie die Papain-DNase-I-Dissoziationsmischung wie im Manuskript beschrieben vor. Nehmen Sie nun mit einer vergrößerten Spitzentransferpipette die Netzhaut auf. Warten Sie, bis sich die Netzhaut an der Unterseite der Spitze abgesetzt hat, und geben Sie die Netzhaut ohne übermäßiges HBSS in das Röhrchen frei, das die Papain-DNase-I-Mischung enthält.Als nächstes legen Sie das Röhrchen auf einen Nutator im Inkubator und inkubieren für 10 Minuten bei 37 Grad Celsius und mit 5% Kohlendioxid. Als nächstes dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer Ein-Milliliter-Pipette auf und ab pipettieren. Nachdem die Zellen dissoziiert sind, fügen Sie 275 Mikroliter ovomucoiden Proteaseinhibitor aus dem Papain-Dissoziationskit hinzu, um den Papain zu neutralisieren, und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren auf und ab.Röhrchen in eine Zentrifuge geben und acht Minuten lang bei vier Grad Celsius bei einer relativen Zentrifugalkraft von 300 drehen. Fügen Sie dem berechneten Volumen des bei 37 Grad Celsius vorgewärmten Wachstumsmediums den epidermalen Wachstumsfaktor hinzu. Nehmen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge.Ohne das Pellet am Boden des Röhrchens zu berühren, entfernen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig. Nun resuspendieren Sie das Zellpellet mit 500 Mikrolitern epidermalen Wachstumsfaktor ergänzt Wachstumsmedium. Dann wird die Zellsuspension in eine Vertiefung der beschrifteten 12-Well-Platte überführt.Spülen Sie das Röhrchen mit weiteren 500 Mikrolitern des mit epidermalen Wachstumsfaktor ergänzten Wachstumsmediums und fügen Sie es dem Brunnen hinzu. Schütteln Sie die Brunnenplatte vorsichtig und legen Sie die Platte bei 37 Grad Celsius mit Kohlendioxid in den Inkubator. Beginnen Sie mit der Überprüfung auf 90% bis 100% Zellkonfluenz.Als nächstes entfernen Sie das Medium und fügen Sie einen Milliliter kaltes HBSS hinzu, um den Brunnen zu waschen. Schaukeln Sie vorsichtig die Platte und entfernen Sie HBSS ohne Spuren hinterlassen. Später fügen Sie 500 Mikroliter einer vorgewärmten Trypsin-haltigen Lösung hinzu, um die Zellen aus dem Brunnen zu lösen.Schaukeln Sie vorsichtig und inkubieren Sie für zwei Minuten im 37 Grad Celsius Inkubator. Nachdem Sie die Platte vom Inkubator in die Biosicherheitswerkbank gebracht haben, saugen Sie die trypsinhaltige Lösung beim Kippen ab. Verteilen Sie es vorsichtig und langsam mehrmals über den Brunnen, bis sich die Zellen vollständig lösen.Als nächstes übertragen Sie diese Zellsuspension in ein steriles 1,5-Milliliter-Röhrchen und legen Röhrchen in die Zentrifuge. Bei 300 mal g acht Minuten bei vier Grad Celsius schleudern und Röhrchen zurück in die Biosicherheitswerkbank bringen. Entfernen Sie den Überstand, ohne das Pellet zu berühren.Resuspendieren Sie nun vorsichtig das Zellpellet, indem Sie 600 Mikroliter vorgewärmtes Wachstumsmedium hinzufügen und etwa 30 bis 40 Mal auf und ab pipettieren. Schließlich werden 100 Mikroliter der erhaltenen Zellsuspension in der Mitte von sechs beschichteten Deckgläsern der 24-Well-Platte ausgesät. Legen Sie die Platte auf den Inkubator und lassen Sie die Zellen für die anschließende Transfektion mit Mikro-RNA-Nachahmungen absetzen.Die Abbildung zeigt die Kontrollbedingungen fünf Tage nach der Transfektion mit einigen Ascl1-Tomato-positiven Zellen. Nach einer miR-25-Behandlung werden jedoch noch viel mehr Ascl1-Tomato-positive Zellen gefunden. Die Quantifizierung ergab eine Vervierfachung der Anzahl der Ascl1-Tomato-positiven Zellen in den miR-25-behandelten Vertiefungen im Vergleich zu Kontrollen.Am wichtigsten ist, dass die überwiegende Mehrheit der Ascl1-Tomato-positiven Zellen, die in den mit riR-25 behandelten Wells gefunden wurden, eine neuronale Morphologie annahm. Zu den Merkmalen dieser neuronalen Morphologie gehörten eine reduzierte Zellsomagröße, die Entwicklung feiner Prozesse und die Bildung winziger Netzwerke. Die Quantifizierung ergab, dass etwa 70% aller Ascl1-Tomato-positiven Zellen neuronale Merkmale aufwiesen.Die immunfluoreszierende Markierung zeigt, dass Ascl1-Tomato-positive Zellen mit neuronaler Morphologie die neuronalen Marker OTX2 und MAP2 exprimieren, was die neuronale Identität bestätigt. Die Quantifizierung dieser Zellen zeigte, dass nach miR-25-Überexpression etwa 40 Ascl1-Tomato-positive Neuronen pro Feld vorhanden sind, verglichen mit fünf neuronalen Zellen pro Feld in Kontrollen. Die identifizierten neuronalen Zellen machen etwa 70% der gesamten Ascl1-Tomato-positiven Zellpopulation der miR-25-behandelten Proben aus.Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung der absoluten Anzahl von OTX2- und MAP2-koexprimierenden Neuronen, dass nach miR-25-Behandlung etwa 60 Neuronen pro Feld gefunden wurden, verglichen mit 10 Neuronen pro Feld bei Kontrollen. Es ist unerlässlich, in einer sauberen und desinfizierten Umgebung mit sauberen und sterilen Werkzeugen zu arbeiten und sorgfältig zu arbeiten, indem jede harte Behandlung vermieden wird. Nachgelagerte Anwendungen können beispielsweise Proteinquantifizierung, DNA- oder RNA-Analyse oder elektrophysiologische Studien sein.Diese Technik half uns, erste Fragen zur nuklearen Reprogrammierung zu erforschen, die zum Bereich der regenerativen Medizin gehört. Und es gibt eine Vielzahl von Faktoren und Bedingungen, die getestet werden können, um neue Fragen zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differenzierung einer Menschen Neural Stem Cell Line auf Dreidimensional Kulturen, Analyse der MicroRNA und mutmaßlichen Zielgene

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatozyten-spezifische Ablation in Zebrafische, um Gallengetriebenen Leberregeneration Studieren

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimierung der Wund Scratch Assay auf Änderungen in Murine mesenchymale Stromazellen Zellmigration Detect nach der Beschädigung durch lösliche Cigarette Smoke Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Entwicklung einer fibrotischen Leber Modell in Zebrabärbling Ethanol-induzierte zur Untersuchung Progenitor-vermittelte Zell Hepatozyten-Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Eine effiziente Methode erhalten Sie Dedifferenzierte Fettzellen

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Menschliche Primär Trophoblast Zellkulturmodell die schützende Wirkung von Melatonin gegen Hypoxie / Reoxygenierung induzierte Störung zu studieren

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Mit dem Hauptneurosphäre Kulturen Primäre Cilia zu studieren

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolierung und Charakterisierung von primären Ratte Ventil interstitielle Zellen: ein neues Modell zur Verkalkung der Aortenklappe

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methoden für die Untersuchung der Regeneration im Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...