Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

המחברים מודים לד"ר אן ביטון ולכל חברי המעבדה על התייחסותם לכתב היד. תודה מיוחדת לד"ר טום רה, ג'וליה פולק וראס טיילור על הצגת התרבויות הראשוניות של MG ככלי סינון ל- S.G.W. במהלך הכשרת פוסט-דוקטורט באוניברסיטת וושינגטון בסיאטל. המחקר מומן על ידי מענק תוכנית החדשנות של האימפריה (EIP) ל- S.G.W. וקרנות סטארט-אפ מ- SUNY אופטומטריה ל- S.G.W., כמו גם פרס R01EY032532 ממכון העיניים הלאומי (NEI) ל- S.G.W.

נהלים הנוגעים לנבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכללת SUNY לאופטומטריה.
הערה: פרוטוקול תרבות זה מורכב משלושה שלבים: גדילה, טרנספקציה ושלב המרה. סיכום של הפרוטוקול הכולל עם ציר הזמן ניתן באיור 1.
1. הכ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר מנותקות לצורך תכנות מחדש של מחקרים באמצעות miRNAs. כפי שהוכח ואושר במגוון מחקרים קודמים, הרוב המכריע (80%-90%) של התאים שנמצאו בתרביות אלה הם MG 20,23,24. שיטה זו היא טכניקה חזקה ואמינה מאוד וניתן לשחזר בקלות ?...

גליה מולר (באנגלית: Müller glia) היא הגליה השולטת ברשתית העצבית. יש להם תפקודים דומים בהשוואה לגליה אחרים בחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, כגון שמירה על הומאוסטזיס של מים ויונים, הזנת נוירונים והגנה על הרקמה. ל-MG יש תכונה מרתקת נוספת: למרות שהם גליה בוגרים, הם עדיין מבטאים גנים רבים המתבטאים בתאי אב רשתית (RPCs) במהלך התפתחות מאוחרת 1,2. ההנחה היא שדמיון זה הוא הסיבה להתחדשות העצבית הטבעית המבוססת על MG ברשתית הדגים לאחר נזק לרשתית 3,4. במהלך תהליך זה, MG נכנסת מחדש למחזור התאים ומתמיינת מחדש ל-RPCs שלאחר מכן מתמיינים לכל ששת הסוגים של נוירוני הרשתית. למרות שתופעה זו מתרחשת באופן טבעי בדגים, יונקים MG אינם ממירים לנוירונים 5,6. עם זאת, ניתן לתכנת אותם מחדש. הודגם כי מגוון גורמים מתכנתים מחדש את MG ל-RPCs/נוירונים; בין גורמים אלה נמצא גורם השעתוק הבסיסי סליל-לולאה-סליל (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1) המעורב בהתחדשות דגים 7,8. בעכברים, Ascl1 מתבטא רק ב-RPCs במהלך רטינוגנזה, אך הוא נעדר ב-MG בוגר או בתאי עצב ברשתית9.
תכנות מחדש של תאים ישירות in vivo הוא לא רק מאתגר מבחינה מתודולוגית, אלא גם דורש אישור מוועדה מוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם. כדי לקבל אישור, נדרשים נתונים ראשוניים על הגורמים שבהם נעשה שימוש או שינוי, ריכוזים, השפעות מחוץ למטרה, מנגנונים בסיסיים, רעילות ויעילות. מערכות תרביות תאים מאפשרות בדיקה של קריטריונים אלה לפני השימוש במודלים in vivo. יתר על כן, מכיוון ש-MG מהווים רק כ-5% מכלל אוכלוסיית תאי הרשתית10, תרביות MG מאפשרות לחקור את תפקודן11 וכן את התנהגותן, כולל נדידה12,13, התפשטות14, תגובת עקה לפציעה/נזק15,16, האינטראקציה שלהן עם סוגי תאים אחרים כגון מיקרוגליה17 או תאי גנגליון רשתית (RGCs)18, או הפוטנציאל הנוירוגני שלהם 19,20,21. חוקרים רבים משתמשים בקווי תאים מונצחים לצורך המחקרים שלהם מכיוון שיש להם פוטנציאל התפשטות בלתי מוגבל וניתן לתחזק אותם בקלות ולתמר אותם. תאים ראשוניים, לעומת זאת, עדיפים על מבחנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית מאשר תאים מונצחים, שכן יש להם מאפייני תאים אמיתיים (ביטוי גנים וחלבונים), וחשוב מכך, הם מייצגים שלב מסוים בהתפתחות ולכן יש להם "גיל". גילו של בעל חיים (וכתוצאה מכך של התאים המתקבלים מבעל חיים) הוא גורם מכריע במיוחד בתכנות מחדש של התאים, שכן הפלסטיות של התאים פוחתת עם התקדמות שלב ההתפתחות22.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לתכנת מחדש MG ראשוני עם miRNAs כשיטת מבחנה נוכחית לחקר התחדשות. מודל תרבית ראשוני זה של MG הוקם בשנת 2012 כדי להעריך את מאפייני התפשטות התאים של MG בעכברי נוק-אאוט P53 (trp53-/- עכברים)23. הודגם כי MG מתורבתים שומרים על תכונות הגליה שלהם (כלומר, ביטוי של חלבוני S100β, Pax6 ו-Sox2 שהוערכו באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי), וכי הם דומים ל-in vivo MG (מיקרו-מערך של MG מטוהר FACS)23. זמן קצר לאחר מכן, mRNA גליאלי וביטוי חלבונים אומתו ואושרו בגישה שונה באמצעות וקטורים נגיפיים20. כמה שנים לאחר מכן, אושר כי הרוב המכריע של התאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG על ידי שימוש בעכבר Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter24 הספציפי ל-MG. יתר על כן, כימות של קבוצת ה-miRNAs הן ב-MG המטוהר ב-FACS והן ב-MG ראשי מתורבת הראה כי הרמות של MG miRNAs (mGLiomiRs) אינן משתנות הרבה ב-MG מתורבת במהלך שלב הצמיחה. עם זאת, תקופות תרבית מוארכות גורמות לשינויים ברמות ה-miRNA וכתוצאה מכך ברמות ה-mRNA ובביטוי החלבון, שכן miRNA הם מווסתים תרגומיים25.
בשנת 2013, מודל תרבית MG זה שימש לבדיקת מגוון גורמי שעתוק ביחס ליכולתם לתכנת מחדש את MG לנוירונים ברשתית20. Ascl1 נמצא כגורם תכנות מחדש חזק ואמין מאוד. ביטוי יתר של Ascl1 באמצעות וקטורים ויראליים גרם לשינויים מורפולוגיים, ביטוי של סמנים עצביים ורכישת תכונות אלקטרופיזיולוגיות עצביות. חשוב מכך, התובנות והתוצאות שהתקבלו מניסויים ראשונים אלה במבחנה הועברו בהצלחה ליישומי in vivo 22,26, מה שמדגים כי תרבויות MG ראשוניות מייצגות כלי מוצק ואמין להקרנות גורמים ראשוניות ולהערכה של תכונות גליה לפני יישום in vivo.
לפני מספר שנים, הוכח כי miRNA miR-124 המועשר במוח, אשר מתבטא מאוד גם בתאי עצב ברשתית, יכול לגרום לביטוי Ascl1 בתרבית MG21. ביטוי Ascl1 בתאים חיים הודגם באמצעות עכבר כתב Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). עכבר עיתונאי הוא עכבר מהונדס גנטית שיש לו גן עיתונאי המוחדר לדנ"א שלו. גן מדווח זה מקודד לחלבון עיתונאי, שנמצא במחקר זה tdTomato, חלבון פלואורסצנטי אדום. חלבון כתב זה מדווח על ביטוי של גן בעל עניין, במקרה זה, Ascl1. במילים אחרות, תאים המבטאים Ascl1 יהפכו לאדומים. מכיוון ש- Ascl1 מתבטא רק ב- RPCs9, עכבר Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl זה מאפשר מעקב אחר המרת MG ל- Ascl1 המבטאת RPCs, כלומר המרת תאים תבטא חלבון כתב tdTomato פלואורסצנטי אדום. זהו תיוג בלתי הפיך מכיוון שהדנ"א של תאים אלה משתנה. כתוצאה מכך, כל התמיינות עצבית עוקבת תודגם מכיוון שהתווית tdTomato נשארת בתאים מתמיינים. אם Ascl1 מבטא RPCs שמקורם ב-MG (עם תווית tdTomato) מתמיינים לנוירונים, נוירונים אלה עדיין יהיו בעלי התווית האדומה שלהם. עכבר זה, אם כן, מאפשר לא רק תיוג של RPCs שמקורם ב-MG להדמיית תאים חיים, אלא גם מאפשר מיפוי גורל ומעקב אחר שושלת של RPCs אלה שמקורם ב-MG (אדום). לאחרונה זוהתה קבוצת miRNA ב-RPCs ותרביות MG של Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter עכברים שימשו לסינון ובדיקת ההשפעה של miRNA אלה על יכולת התכנות מחדש והיעילות27. מועמד אחד, ה-RPC-miRNA miR-25, נמצא מסוגל לתכנת מחדש את MG בתרבית לתאים המבטאים Ascl1 (Ascl1-Tomato+). תאים מתוכנתים מחדש אלה מאמצים תכונות עצביות לאורך זמן, כולל מורפולוגיה עצבית (סומטה קטנה ותהליכים עדינים קצרים או ארוכים), ביטוי של תעתיקים עצביים הנמדדים באמצעות scRNA-Seq, כמו גם ביטוי של חלבונים עצביים המאומתים באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי27.
כאן, הפרוטוקול מפרט כיצד לגדל ולהחליף MG מעכברי P12 שהותאמו מהעבודה הקודמת 21,24,27. נבחר לפרוטוקול זה הוא miRNA miR-25 הנ"ל, miRNA המבוטא מאוד ב-RPCs, עם רמות ביטוי נמוכות ב-MG או בתאי עצב ברשתית. על מנת לבטא יתר על המידה miR-25, מורין miR-25 מחקה, כלומר, מולקולות miRNA מלאכותיות משמשות. כבקרה, נבחרים חיקויים של miRNA מ- Caenorhabditis elegans, שאין להם שום תפקיד בתאי יונקים. ההדמיה של ההמרה של MG ל-RPCs נעשתה באמצעות עכבר הכתב RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), עכבר עם רקע מעורב (זני C57BL/6, S129 ו-ICR). עם זאת, תרבות זו יכולה להתבצע עם כל זני העכברים, כולל זנים מסוג בר. בשנים האחרונות, הפרוטוקול המקורי שונה כדי לקצר את משך שלב הגדילה ואת תקופת התרבית הכוללת ולהבטיח מצב חזק יותר של תאי גליה ולמזער את מידת הניוון התאי, המתרחשת בתקופות תרבית ממושכות. חלון הזמן הרגיל של הטרנספקציה הוארך גם הוא מ-3 שעות ליומיים. כפי שצוין קודם לכן, למרות שהפרוטוקול הנוכחי מתאר תרביות MG ככלי למחקרי התחדשות, השיטה לא רק שימושית לבדיקת גורמי תכנות מחדש, אלא יכולה להיות מותאמת גם ליישומים אחרים, כולל מחקרים על התנהגות נודדת או התפשטות של MG, פרדיגמות הקשורות לפציעה/נזק לתאים, ו/או זיהוי מנגנונים ומסלולים בסיסיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

Müller glia (MG) הם הגליה השולטת ברשתית העצבית ויכולים לתפקד כמקור רגנרטיבי לנוירונים ברשתית. אצל בעלי חוליות נמוכים יותר כגון דגים, התחדשות מונעת MG מתרחשת באופן טבעי; ביונקים, לעומת זאת, נדרש גירוי עם גורמים מסוימים או מניפולציה גנטית/אפיגנטית. מכיוון ש-MG מהווה רק 5% מאוכלוסיית תאי הרשתית, יש צורך במערכות מודל המאפשרות לחקור את אוכלוסיית התאים הזו באופן בלעדי. אחת ממערכות המודל הללו היא תרביות MG ראשוניות הניתנות לשחזור וניתן להשתמש בהן למגוון יישומים, כולל סינון וזיהוי של מולקולות/גורמים, בדיקת תרכובות או גורמים, ניטור תאים ו/או בדיקות פונקציונליות. מודל זה משמש לחקר הפוטנציאל של מורין MG להמיר לנוירונים ברשתית לאחר תוספת או עיכוב של מיקרו-רנ"א (miRNA) באמצעות טרנספקציה של miRNA מלאכותיים או מעכביהם. השימוש בעכברי דיווח ספציפיים ל-MG בשילוב עם תיוג אימונופלואורסצנטי וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) אישר כי 80%-90% מהתאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG. באמצעות מודל זה, התגלה כי miRNAs יכולים לתכנת מחדש את MG לתאי אב רשתית (RPCs), אשר לאחר מכן מתמיינים לתאים דמויי נוירונים. היתרונות של טכניקה זו הם שניתן לבחון מועמדים ל-miRNA על יעילותם ותוצאתם לפני השימוש בהם ביישומי in vivo .

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר P12 וכיצד לתכנת מחדש את התאים האלה עם miR-25 לנוירונים ברשתית באמצעות עכבר הכתב Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. שיטה זו שימשה בעבודה קודמת המדווחת בפירוט על miRNAs מתאימים אחרים (מחקים או מעכבים, כמולקולות בודדות או בשילוב) כדי לתכנת מחדש את MG ל-RPC שמאמ...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

תרביות ראשוניות של Müller glia המתקבלות מרשתיות עכברים מייצגות כלי חזק ואמין מאוד לחקר המרת גליה לתאי אב רשתית לאחר טיפול במיקרו-רנ"א. ניתן לבדוק מולקולות בודדות או שילובים לפני היישום הבא של גישות in vivo .

תרביות תאים ראשוניות לחקר פוטנציאל ההתחדשות של מורין מולר גליה לאחר טיפול במיקרו-רנ"א

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

פרוטוקול זה מאפשר לחקור את הפוטנציאל והיכולת של Muller glia להמיר לתאי אב ברשתית לאחר טיפול בגורמים ספציפיים כגון מיקרו-רנ"א. היתרון של טכניקה זו הוא שניתן לבחון מועמדים למיקרו-רנ"א על יעילותם ותוצאותיהם לפני השימוש בהם ביישומי in vivo. מי שיעזור להדגים את ההליך יהיה Seoyoung Kang, סטודנט לדוקטורט מהמעבדה של סטפני וואהל.ראשית, טבלו את גלגל העין שהוסר לזמן קצר לתוך צינור עם אתנול כדי למנוע נשיאה של חיידקים מהחיה. לאחר מכן, לשטוף את גלגל העין לזמן קצר בצלחת פטרי 10 ס"מ לפני הנחתו לתוך צלחת 24 באר על קרח. לאחר הסרת גלגלי העיניים וניקוים, הניחו עין אחת בכלי הנתיחה הממוקמת מתחת למיקרוסקופ מנתח עם מקור אור.כעת תקן גלגל עין אחד על ידי תפיסת עצב הראייה ורקמת החיבור שמסביב סביב הסקלרה עם מלקחיים עדינים של Dumont 5 ולחץ עליו בזהירות כנגד צלחת הנתיחה. לאחר מכן, צור חור במרכז הקרנית באמצעות מחט 30 מד כדי לאפשר גישה קלה יותר למספריים הוורידיים. לאחר מכן, נתחו את הקרנית סביב הגוף הציליארי באמצעות מספריים ורידיים והסירו בזהירות את הקרנית, העדשה, הקשתית והגוף הזגוגי בעזרת מלקחיים עדינים של Dumont 5.מאוחר יותר לנתח את הסקלרה עם מספריים ורידיים עד שמגיעים לעצב הראייה ולחלץ בזהירות את הרשתית באמצעות Dumont 5 מלקחיים עדינים. עכשיו להשתמש השני Dumont 5 מלקחיים עדינים לדחוף נגד הרשתית לחלוטין להסיר את הגוף הזגוגי. מעבירים את הרשתיות לחתוך כ 2.5 ס"מ של קצה פיפטה העברה סטרילית כדי להגדיל את הקוטר.כעת, בעזרת קצה זה, הרימו רשתיות שלמות מבלי לפגוע ברקמה והעבירו את הרשתיות לצלחת פטרי סטרילית חדשה עם HBSS קר ונדנדו את המנה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה העברה סטרילית חדשה, דחפו בזהירות את הרשתיות מסביב כדי לשטוף את תאי אפיתל פיגמנט הרשתית. מיד מניחים את הרשתית המבודדת בבאר נקייה חדשה של צלחת 24 הבאר המלאה במיליליטר אחד של HBSS תוך שמירה על צלחת 24 הבאר על הקרח במהלך הנתיחה.הכינו את תערובת הדיסוציאציה של פפאין DNase I כמתואר בכתב היד. עכשיו עם פיפטה העברת קצה מוגדל, להרים את הרשתיות. המתן עד שהרשתיות ישקעו בתחתית הקצה ושחרר את הרשתיות ללא HBSS מוגזם לתוך הצינור המכיל תערובת פפאין DNase I.לאחר מכן, מניחים את הצינור על נוטור באינקובטור ודוגרים במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ועם 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, לנתק את התאים על ידי pipetting בזהירות למעלה ולמטה עם פיפטה מיליליטר אחד. לאחר ניתוק התאים, הוסיפו 275 מיקרוליטרים של מעכב פרוטאז אובומוקואידי מתוך ערכת הדיסוציאציה של פפאין כדי לנטרל את הפפאין ולערבב בעדינות על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.מכניסים צינורות לתוך צנטריפוגה ומסתובבים בארבע מעלות צלזיוס במשך שמונה דקות בעוצמה צנטריפוגלית יחסית של 300. הוסף את גורם הצמיחה האפידרמלי לנפח המחושב של מדיום הצמיחה שהתחמם מראש ב-37 מעלות צלזיוס. הסר את הצינורות בזהירות מהצנטריפוגה.מבלי לגעת בכדור שבתחתית הצינור, יש להסיר את הסופר-נטנט בזהירות ובאופן מלא. עכשיו להשעות את גלולת התא עם 500 microliters של גורם גדילה אפידרמלי בתוספת מדיום גדילה. לאחר מכן, העבר את מתלה התא לבאר אחת של צלחת 12 הבאר המסומנת.שטפו את הצינור בעוד 500 מיקרוליטרים של גורם הגדילה האפידרמלי בתוספת מדיום גדילה והוסיפו אותו לבאר. נדנדו את צלחת הבאר בזהירות ואז הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם פחמן דו חמצני. התחל על-ידי בדיקת מפגש תאים של 90% עד 100%.לאחר מכן, להסיר את המדיום ולהוסיף מיליליטר אחד של HBSS קר לשטוף את הבאר. נדנדנדו בעדינות את הצלחת והסירו את HBSS ללא עקבות שנותרו. מאוחר יותר, להוסיף 500 microliters של טריפסין מחומם מראש המכיל תמיסה כדי לנתק את התאים מן הבאר.רוק בעדינות ודגרה במשך שתי דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר העברת הצלחת מהאינקובטור לארון הבטיחות הביולוגי, שאפו את התמיסה המכילה טריפסין תוך כדי הטיה. פזרו אותו בזהירות ובאיטיות על פני הבאר מספר פעמים עד שהתאים מתנתקים לחלוטין.לאחר מכן, להעביר את זה השעיה התא צינור סטרילי 1.5 מיליליטר ולשים צינורות לתוך צנטריפוגה. סובבו 300 פעמים גרם במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס והחזירו צינורות לארון הבטיחות הביולוגי. יש להסיר את הסופר-נטנט מבלי לגעת בכדור.כעת יש להשעות בזהירות את גלולת התא על ידי הוספת 600 מיקרוליטרים של מדיום גדילה שחומם מראש וצינורות למעלה ולמטה כ-30 עד 40 פעמים. לבסוף, זרע 100 מיקרוליטר של ההשעיה התא המתקבל במרכז שישה תלושי כיסוי מצופים של צלחת 24 באר. הניחו את הצלחת על האינקובטור ותנו לתאים להסתפק בטרנספקציה הבאה באמצעות חיקוי מיקרו-רנ"א.האיור מראה תנאי בקרה חמישה ימים לאחר ההעברה עם כמה תאים חיוביים Ascl1-Tomato נוכחים. עם זאת, לאחר טיפול miR-25, נמצאו תאים חיוביים רבים נוספים של Ascl1-Tomato. הכימות גילה עלייה של פי ארבעה במספר התאים החיוביים Ascl1-Tomato בבארות שטופלו ב-miR-25 בהשוואה לקבוצת הביקורת.והכי חשוב, הרוב המכריע של התאים החיוביים Ascl1-Tomato שנמצאו בבארות שטופלו ב-riR-25 אימצו מורפולוגיה עצבית. תכונות של מורפולוגיה עצבית זו כללו גודל סומה תא מופחת, פיתוח של תהליכים עדינים והיווצרות של רשתות זעירות. הכימות גילה כי כ-70% מכל התאים החיוביים ל-Ascl1-Tomato היו בעלי תכונות עצביות.תיוג אימונופלואורסצנטי מראה כי תאים חיוביים Ascl1-Tomato עם מורפולוגיה עצבית מבטאים את הסמנים העצביים OTX2 ו- MAP2, המאשרים את הזהות העצבית. הכימות של תאים אלה גילה כי לאחר ביטוי יתר של miR-25, קיימים כ-40 תאי עצב חיוביים ל-Ascl1-Tomato לכל שדה, בהשוואה לחמישה תאים עצביים לכל שדה בבקרות. תאי העצב שזוהו מהווים כ-70% מכלל אוכלוסיית התאים החיוביים Ascl1-Tomato של דגימות miR-25 שטופלו.יתר על כן, כימות המספר המוחלט של תאי עצב בעלי ביטוי משותף של OTX2 ו-MAP2 הראה כי לאחר טיפול ב-miR-25, נמצאו כ-60 תאי עצב לכל שדה, לעומת 10 נוירונים לכל שדה בבקרות. חובה לעבוד בסביבה נקייה ומחוטאת עם כלים נקיים וסטריליים ולעבוד בזהירות על ידי הימנעות מכל טיפול קשה. יישומים במורד הזרם יכולים להיות, למשל, כימות חלבונים, ניתוח DNA או RNA, או מחקרים אלקטרופיזיולוגיים.טכניקה זו סייעה לנו לחקור שאלות ראשוניות על תכנות מחדש גרעיני השייך לתחום הרפואה הרגנרטיבית. ויש מגוון רחב של גורמים ותנאים שניתן לבחון על מנת לחקור שאלות חדשות.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

אבלציה Hepatocyte הספציפי בדג הזברה לחקר התחדשות כבד מונע מרה

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

אופטימיזציה של assay Scratch הפצע כדי לזהות שינויים בנדידת תאי Murine mesenchymal סטרומה לאחר נזק על ידי תמצית עשן סיגריות מסיס

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

שיטה יעילה להשיג תאי Dedifferentiated שומן

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

ראשוניים האדם Trophoblast דגם תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות המגנות של מלטונין נגד היפוקסיה / נגרמת reoxygenation שיבוש

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

בתרביות neurosphere ראשיים כדי המחקר העיקרי צילה

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

בידוד ואפיון של החולדה הראשית שסתום תאים ביניים: מודל חדש ללמוד הסתיידות שסתום אבי העורקים

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

שיטות המחקר של התחדשות ב- Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...