Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Gli autori ringraziano la dottoressa Ann Beaton e tutti i membri del laboratorio per il loro contributo al manoscritto. Un ringraziamento speciale va ai dottori Tom Reh, Julia Pollak e Russ Taylor per aver introdotto le culture primarie MG come strumento di screening per S.G.W. durante la formazione post-dottorato presso l'Università di Washington a Seattle. Lo studio è stato finanziato dall'Empire Innovation Program (EIP) Grant a S.G.W. e fondi di start-up da SUNY Optometry a S.G.W., nonché dal premio R01EY032532 dal National Eye Institute (NEI) a S.G.W.

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il SUNY College of Optometry.
NOTA: questo protocollo di coltura è costituito da tre fasi: crescita, trasfezione e fase di conversione. Un riepilogo del protocollo generale con la sequenza temporale è riportato nella Figura 1.
1. Preparazione dei mezzi e di tutti i reagenti necessari
<p ...

Questo protocollo descrive come far crescere MG da retine di topo dissociate per riprogrammare studi che utilizzano miRNA. Come mostrato e confermato in una varietà di studi precedenti, la stragrande maggioranza (80%-90%) delle cellule trovate in queste colture sono MG 20,23,24. Questo metodo è una tecnica molto robusta e affidabile e i risultati possono essere facilmente riprodotti se il protocollo viene seguito correttamente...

La glia di Müller (MG) è la glia predominante nella retina neurale. Hanno funzioni simili rispetto ad altre glia in altre parti del sistema nervoso centrale come il mantenimento dell'omeostasi dell'acqua e degli ioni, il nutrimento dei neuroni e la protezione del tessuto. Le MG hanno un'altra caratteristica affascinante: sebbene siano glia mature, esprimono ancora molti geni espressi nelle cellule progenitrici retiniche (RPC) durante lo sviluppo tardivo 1,2. Si presume che questa somiglianza sia la ragione della rigenerazione neuronale naturale basata su MG nella retina del pesce dopo il danno retinico 3,4. Durante questo processo, mg rientra nel ciclo cellulare e si de-differenzia in RPC che poi si differenziano in tutti e sei i tipi di neuroni retinici. Sebbene questo fenomeno si verifichi naturalmente nei pesci, i mammiferi MG non si convertono in neuroni 5,6. Possono, tuttavia, essere riprogrammati. Una varietà di fattori hanno dimostrato di riprogrammare MG in RPC / neuroni; tra questi fattori c'è il fattore di trascrizione di base helix-loop-helix (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1) che è coinvolto nella rigenerazione dei pesci 7,8. Nei topi, Ascl1 è espresso solo in RPC durante la retinogenesi, ma è assente nei neuroni MG maturi o retinici9.
La riprogrammazione delle cellule direttamente in vivo non è solo metodologicamente impegnativa, ma richiede anche l'approvazione di un comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Per ricevere l'approvazione, sono necessari dati preliminari sui fattori utilizzati o alterati, sulle concentrazioni, sugli effetti fuori bersaglio, sui meccanismi sottostanti, sulla tossicità e sull'efficienza. I sistemi di coltura cellulare consentono di testare questi criteri prima dell'uso in modelli in vivo. Inoltre, poiché le MG comprendono solo circa il 5% dell'intera popolazione di cellule retiniche10, le colture di MG consentono lo studio della loro funzione11 e del loro comportamento, compresa la migrazione12,13, la proliferazione14, la reazione allo stress a lesioni/danni 15,16, la loro interazione con altri tipi di cellule come la microglia17 o le cellule gangliari retiniche (RGC)18, o il loro potenziale neurogeno 19,20,21. Molti ricercatori utilizzano linee cellulari immortalizzate per i loro studi poiché hanno un potenziale proliferativo illimitato e possono essere facilmente mantenute e trasfettate. Le cellule primarie, tuttavia, sono preferibili per saggi biologicamente rilevanti rispetto alle cellule immortalizzate poiché hanno caratteristiche cellulari reali (espressione genica e proteica) e, cosa più importante, rappresentano un certo stadio di sviluppo e quindi hanno una "età". L'età di un animale (e di conseguenza delle cellule ottenute da un animale) è un fattore particolarmente cruciale nella riprogrammazione cellulare poiché la plasticità cellulare si riduce con lo stadio di sviluppo progredito22.
Questo protocollo descrive in dettaglio come riprogrammare MG primario con miRNA come metodo attuale in vitro per lo studio della rigenerazione. Questo modello di coltura primaria mg è stato stabilito nel 2012 per valutare le caratteristiche di proliferazione cellulare di MG in topi knock-out P53 (topi trp53-/-)23. È stato dimostrato che le MG coltivate mantengono le loro caratteristiche gliali (cioè l'espressione delle proteine S100β, Pax6 e Sox2 valutate tramite etichettatura immunofluorescente) e che assomigliano a MG in vivo (microarray di MG purificato con FACS)23. Poco dopo, l'mRNA gliale e l'espressione proteica sono stati convalidati e confermati in un approccio diverso utilizzando vettori virali20. Alcuni anni dopo, è stato confermato che la stragrande maggioranza delle cellule trovate in queste colture sono MG utilizzando il topo reporter Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 24 specifico per MG. Inoltre, la quantificazione dell'insieme dei miRNA sia nella MG purificata dalla FACS che nella MG primaria in coltura ha mostrato che i livelli di MG miRNA (mGLiomiRs) non variano molto nella MG coltivata durante la fase di crescita. I periodi di coltura allungati, tuttavia, causano cambiamenti nei livelli di miRNA e di conseguenza nei livelli di mRNA e nell'espressione proteica poiché i miRNA sono regolatori traslazionali25.
Nel 2013, questo modello di coltura MG è stato utilizzato per testare una varietà di fattori di trascrizione rispetto alla loro capacità di riprogrammare MG in neuroni retinici20. Ascl1 è risultato essere un fattore di riprogrammazione molto robusto e affidabile. La sovraespressione di Ascl1 tramite vettori virali ha indotto cambiamenti morfologici, espressione di marcatori neuronali e acquisizione di proprietà elettrofisiologiche neuronali. Ancora più importante, le intuizioni e i risultati ottenuti da questi primi esperimenti in vitro sono stati trasferiti con successo alle applicazioni in vivo 22,26 dimostrando che le colture primarie di MG rappresentano uno strumento solido e affidabile per gli screening fattoriali iniziali e la valutazione delle caratteristiche gliali prima dell'implementazione in vivo.
Alcuni anni fa, è stato dimostrato che il miRNA miR-124 arricchito dal cervello, che è anche altamente espresso nei neuroni della retina, può indurre l'espressione di Ascl1 inMG 21 coltivato. L'espressione di Ascl1 nelle cellule viventi è stata visualizzata tramite un topo reporter Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Un topo reporter è un topo geneticamente modificato che ha un gene reporter inserito nel suo DNA. Questo gene reporter codifica per una proteina reporter, che è in questo studio tdTomato, una proteina fluorescente rossa. Questa proteina reporter riporta l'espressione di un gene di interesse, in questo caso, Ascl1. In altre parole, le celle che esprimono Ascl1 diventeranno rosse. Poiché Ascl1 è espresso solo in RPC9, questo mouse Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl consente il monitoraggio della conversione MG in RPC che esprimono Ascl1 , il che significa che le cellule in conversione esprimeranno la proteina reporter tdTomato fluorescente rossa. Questa è un'etichettatura irreversibile poiché il DNA di queste cellule è alterato. Di conseguenza, qualsiasi successiva differenziazione neuronale verrà visualizzata perché l'etichetta tdTomato rimane nelle cellule differenzianti. Se Ascl1 che esprime RPC derivate da MG (con etichetta tdTomato) si differenzia in neuroni, questi neuroni avranno ancora la loro etichetta rossa. Questo topo, quindi, consente non solo l'etichettatura di RPC derivati da MG per l'imaging di cellule vive, ma consente anche la mappatura del destino e il tracciamento del lignaggio di questi RPC (rossi) derivati da MG. Più recentemente, è stato identificato il set di miRNA nelle RPC e sono state utilizzate colture MG di topi ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter per lo screening e il test dell'effetto di questi miRNA sulla capacità di riprogrammazione e sull'efficienza27. Un candidato, l'RPC-miRNA miR-25, è stato trovato in grado di riprogrammare MG coltivato in cellule che esprimono Ascl1 (Ascl1-Tomato +). Queste cellule riprogrammate adottano caratteristiche neuronali nel tempo, tra cui la morfologia neuronale (piccoli somata e processi fini brevi o lunghi), l'espressione di trascritti neuronali misurati tramite scRNA-Seq, nonché l'espressione di proteine neuronali convalidate tramite l'etichettatura immunofluorescente27.
Qui, il protocollo descrive in dettaglio come coltivare e trasfettare MG da topi P12 adattati dal lavoro precedente 21,24,27. Scelto per questo protocollo è il già citato miRNA miR-25, un miRNA altamente espresso in RPC, con bassi livelli di espressione in MG o neuroni retinici. Per sovraesprimere miR-25, mi mimica miR-25 murina, cioè vengono utilizzate molecole di miRNA artificiali. Come controllo, vengono scelte imitazioni di un miRNA da Caenorhabditis elegans, che non hanno alcuna funzione nelle cellule di mammifero. La visualizzazione della conversione di MG in RPC è stata effettuata tramite il mouse reporter RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), un mouse con sfondo misto (ceppi C57BL/6, S129 e ICR). Questa coltura può, tuttavia, essere eseguita con tutti i ceppi di topo, compresi i ceppi wild-type. Negli ultimi anni, il protocollo originale è stato modificato per ridurre la durata della fase di crescita e il periodo di coltura complessivo e garantire uno stato delle cellule glialiche più robusto e ridurre al minimo il grado di degenerazione cellulare, che si verifica in periodi di coltura prolungati. Anche la finestra temporale di trasfezione regolare è stata estesa da 3 ore a 2 giorni. Come accennato in precedenza, sebbene l'attuale protocollo descriva le colture MG come strumento per gli studi di rigenerazione, il metodo non è solo utile per testare i fattori di riprogrammazione, ma può anche essere adattato per altre applicazioni, inclusi studi sul comportamento migratorio o proliferativo della MG, paradigmi correlati a lesioni / danni cellulari e / o l'identificazione di meccanismi e percorsi sottostanti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

La glia di Müller (MG) è la glia predominante nella retina neurale e può funzionare come fonte rigenerativa per i neuroni retinici. Nei vertebrati inferiori come i pesci, la rigenerazione guidata da MG avviene naturalmente; nei mammiferi, tuttavia, è necessaria la stimolazione con determinati fattori o la manipolazione genetica/ epigenetica. Poiché le MG comprendono solo il 5% della popolazione di cellule retiniche, vi è la necessità di sistemi modello che consentano esclusivamente lo studio di questa popolazione cellulare. Uno di questi sistemi modello sono colture PRIMARIE DI MG riproducibili e possono essere utilizzate per una varietà di applicazioni, tra cui lo screening e l'identificazione di molecole / fattori, test di composti o fattori, monitoraggio cellulare e / o test funzionali. Questo modello viene utilizzato per studiare il potenziale della MG murina di convertirsi in neuroni retinici dopo l'integrazione o l'inibizione di microRNA (miRNA) tramite trasfezione di miRNA artificiali o dei loro inibitori. L'uso di topi reporter mg-specifici in combinazione con l'etichettatura immunofluorescente e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha confermato che l'80%-90% delle cellule trovate in queste colture sono MG. Utilizzando questo modello, è stato scoperto che i miRNA possono riprogrammare MG in cellule progenitrici retiniche (RPC), che successivamente si differenziano in cellule neuronali. I vantaggi di questa tecnica sono che i candidati miRNA possono essere testati per la loro efficienza e il loro risultato prima del loro utilizzo in applicazioni in vivo .

Questo protocollo descrive come far crescere MG dalle retine di topo P12 e come riprogrammare queste cellule con miR-25 in neuroni retinici usando il topo reporter Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Questo metodo è stato utilizzato in lavori precedenti riportando in dettaglio altri miRNA adatti (imitazioni o inibitori, come singole molecole o in combinazione) per riprogrammare MG in RPC che quindi adottano le caratteristiche delle cellule neuronali27. Questo metodo ...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Le colture primarie di glia di Müller ottenute da retine di topo rappresentano uno strumento molto robusto e affidabile per studiare la conversione gliale in cellule progenitrici retiniche dopo il trattamento con microRNA. Singole molecole o combinazioni possono essere testate prima della loro successiva applicazione di approcci in vivo .

Colture cellulari primarie per studiare il potenziale di rigenerazione di Murine Müller Glia dopo il trattamento con microRNA

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Questo protocollo permette di studiare il potenziale e la capacità della glia di Muller di convertirsi in cellule progenitrici retiniche dopo il trattamento con fattori specifici come i microRNA. Il vantaggio di questa tecnica è che i candidati microRNA possono essere testati per la loro efficienza e risultato prima del loro utilizzo in applicazioni in vivo. Ad aiutare a dimostrare la procedura sarà Seoyoung Kang, una dottoranda del laboratorio di Stefanie Wohl.In primo luogo, immergere brevemente il bulbo oculare rimosso in un tubo con etanolo per evitare il trascinamento di batteri dall'animale. Quindi, lavare brevemente il bulbo oculare nella capsula di Petri da 10 centimetri prima di posizionarlo nella piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio. Una volta rimossi e puliti i bulbi oculari, posizionare un occhio nel piatto di dissezione posto sotto un microscopio da dissezione con una fonte di luce.Ora fissa un bulbo oculare afferrando il nervo ottico e il tessuto connettivo circostante intorno alla sclera con una pinza fine Dumont 5 e premerlo con attenzione contro il piatto di dissezione. Successivamente, praticare un foro nel centro della cornea utilizzando un ago calibro 30 per consentire un accesso più facile alle forbici venose. Quindi, sezionare la cornea intorno al corpo ciliare usando le forbici venose e rimuovere con attenzione la cornea, la lente, l'iride e il corpo vitreo con una pinza fine Dumont 5.Successivamente sezionare la sclera con le forbici venose fino a raggiungere il nervo ottico ed estrarre con cura la retina usando una pinza fine Dumont 5. Ora usa una seconda pinza fine Dumont 5 per spingere contro la retina e rimuovere completamente il corpo vitreo. Trasferire le retine tagliate circa 2,5 centimetri della punta di una pipetta di trasferimento sterile per ingrandirne il diametro.Ora, usando questo suggerimento, raccogli intere retine senza danneggiare il tessuto e trasferisci le retine in una nuova capsula di Petri sterile con HBSS freddo e scuoti il piatto. Successivamente, utilizzando una nuova pipetta di trasferimento sterile, spingere con attenzione le retine per lavare via le cellule epiteliali pigmentate retiniche. Posizionare immediatamente la retina isolata in un nuovo pozzetto pulito della piastra a 24 pozzetti riempita con un millilitro di HBSS mantenendo la piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio durante la dissezione.Preparare la miscela di dissociazione della Papaina DNasi I come descritto nel manoscritto. Ora con una pipetta di trasferimento della punta allargata, raccogliere le retine. Attendere che le retine si depositino nella parte inferiore della punta e rilasciare le retine senza eccessiva HBSS nel tubo contenente la miscela di Papaina DNasi I.Quindi, posizionare il tubo su un nutator nell'incubatore e incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius e con il 5% di anidride carbonica. Quindi, dissociare le cellule con attenzione pipettaggio su e giù con una pipetta da un millilitro. Dopo che le cellule sono state dissociate, aggiungere 275 microlitri di inibitore della proteasi ovomucoide dal kit di dissociazione della papaina per neutralizzare la papaina e mescolare delicatamente pipettando su e giù.Mettere i tubi in una centrifuga e ruotare a quattro gradi Celsius per otto minuti con una forza centrifuga relativa di 300. Aggiungere il fattore di crescita epidermico al volume calcolato del terreno di crescita preriscaldato a 37 gradi Celsius. Rimuovere accuratamente i tubi dalla centrifuga.Senza toccare il pellet sul fondo del tubo, rimuovere il surnatante con cura e interamente. Ora risospendi il pellet cellulare con 500 microlitri di mezzo di crescita integrato con fattore di crescita epidermico. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti etichettata.Risciacquare il tubo con altri 500 microlitri del mezzo di crescita integrato con fattore di crescita epidermico e aggiungerlo al pozzetto. Scuotere attentamente la piastra del pozzo, quindi posizionare la piastra nell'incubatore a 37 gradi Celsius con anidride carbonica. Inizia controllando la confluenza cellulare dal 90% al 100%.Quindi, rimuovere il mezzo e aggiungere un millilitro di HBSS freddo per lavare il pozzo. Oscillare delicatamente la piastra e rimuovere HBSS senza lasciare tracce. Successivamente, aggiungere 500 microlitri di una soluzione contenente tripsina preriscaldata per staccare le cellule dal pozzetto.Oscillare delicatamente e incubare per due minuti in incubatrice a 37 gradi Celsius. Dopo aver spostato la piastra dall'incubatore all'armadio di biosicurezza, aspirare la soluzione contenente tripsina durante l'inclinazione. Disperderlo con cura e lentamente sul pozzo più volte fino a quando le cellule si staccano completamente.Quindi, trasferire questa sospensione cellulare in un tubo sterile da 1,5 millilitri e inserire i tubi nella centrifuga. Girare a 300 volte g per otto minuti a quattro gradi Celsius e riportare i tubi nell'armadio di biosicurezza. Rimuovere il surnatante senza toccare il pellet.Ora risospendere attentamente il pellet cellulare aggiungendo 600 microlitri di terreno di crescita preriscaldato e pipettando su e giù circa 30-40 volte. Infine, seminare 100 microlitri della sospensione cellulare ottenuta al centro di sei vetrini di copertura rivestiti della piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra sull'incubatore e lasciare che le cellule si depositino per la successiva trasfezione usando micro RNA mimiche.La figura mostra le condizioni di controllo cinque giorni dopo la trasfezione con alcune cellule positive al pomodoro Ascl1. Dopo un trattamento miR-25, tuttavia, si trovano molte più cellule positive al pomodoro Ascl1. La quantificazione ha rivelato un aumento di quattro volte del numero di cellule positive al pomodoro Ascl1 nei pozzetti trattati con miR-25 rispetto ai controlli.Ancora più importante, la stragrande maggioranza delle cellule positive al pomodoro Ascl1 trovate nei pozzetti trattati con riR-25 ha adottato una morfologia neuronale. Le caratteristiche di questa morfologia neuronale includevano la riduzione delle dimensioni del soma cellulare, lo sviluppo di processi fini e la formazione di piccole reti. La quantificazione ha rivelato che circa il 70% di tutte le cellule positive al pomodoro Ascl1 aveva caratteristiche neuronali.La marcatura immunofluorescente mostra che le cellule positive al pomodoro Ascl1 con morfologia neuronale esprimono i marcatori neurali OTX2 e MAP2, confermando l'identità neuronale. La quantificazione di queste cellule ha rivelato che dopo la sovraespressione di miR-25, sono presenti circa 40 neuroni positivi all'Ascl1-Tomato per campo rispetto a cinque cellule neuronali per campo nei controlli. Le cellule neuronali identificate costituiscono circa il 70% della popolazione totale di cellule positive al pomodoro Ascl1 dei campioni trattati con miR-25.Inoltre, la quantificazione del numero assoluto di neuroni coesprimenti OTX2 e MAP2 ha mostrato che dopo il trattamento con miR-25, sono stati trovati circa 60 neuroni per campo rispetto ai 10 neuroni per campo nei controlli. È imperativo lavorare in un ambiente pulito e igienizzato con strumenti puliti e sterili e lavorare con attenzione evitando qualsiasi trattamento duro. Le applicazioni a valle possono essere, ad esempio, la quantificazione delle proteine, l'analisi del DNA o dell'RNA o studi elettrofisiologici.Questa tecnica ci ha aiutato a esplorare le domande iniziali sulla riprogrammazione nucleare che appartiene al campo della medicina rigenerativa. E c'è una lunga gamma di fattori e condizioni che possono essere testati per esplorare nuove domande.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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L&#39;utilizzo del sistema di Teton per studiare Meccanismi molecolari della rigenerazione Zebrafish

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Ottimizzazione del test ferita Scratch per rilevare i cambiamenti in murini mesenchimali stromali migrazione cellulare dopo i danni da fumo di sigaretta estratto solubile

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