Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Ann Beaton og alle laboratoriemedlemmer for deres innspill til manuskriptet. Spesiell takk går til Dr. Tom Reh, Julia Pollak og Russ Taylor for å introdusere MG primære kulturer som et screeningsverktøy til S.G.W. under postdoktorutdanning ved University of Washington i Seattle. Studien ble finansiert av Empire Innovation Program (EIP) Grant til S.G.W. og oppstartsmidler fra SUNY Optometry til S.G.W., samt R01EY032532-prisen fra National Eye Institute (NEI) til S.G.W.

Prosedyrer som involverer dyrefag er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved SUNY College of Optometry.
MERK: Denne kulturprotokollen består av tre faser: vekst, transfeksjon og konverteringsfase. Et sammendrag av den samlede protokollen med tidslinjen er gitt i figur 1.
1. Fremstilling av media og alle nødvendige reagenser
MERK: Alle trinn må utføres i et A2- el...

Denne protokollen beskriver hvordan man dyrker MG fra dissosierte musehinner for omprogrammering av studier ved bruk av miRNA. Som vist og bekreftet i en rekke tidligere studier, er det store flertallet (80% -90%) av cellene som finnes i disse kulturer MG 20,23,24. Denne metoden er en veldig robust og pålitelig teknikk, og resultatene kan enkelt reproduseres hvis protokollen følges riktig21,27</sup...

Müller glia (MG) er den dominerende glia i nevral retina. De har lignende funksjoner sammenlignet med andre glia i andre deler av sentralnervesystemet, for eksempel å opprettholde vann- og ionhomeostase, nærende nevroner og beskytte vevet. MG har en annen fascinerende funksjon: selv om de er modne glia, uttrykker de fortsatt mange gener uttrykt i retinale stamceller (RPC) under sen utvikling 1,2. Denne likheten antas å være årsaken til den naturlig forekommende MG-baserte nevronregenereringen i fiskehinnen etter retinal skade 3,4. I løpet av denne prosessen går MG inn i cellesyklusen og de-differensierer til RPC-er som deretter differensierer i alle seks typer retinale nevroner. Selv om dette fenomenet forekommer naturlig i fisk, konverterer ikke pattedyr MG til nevroner 5,6. De kan imidlertid omprogrammeres. En rekke faktorer har vist seg å omprogrammere MG til RPC/nevroner; blant disse faktorene er den grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktoren achaete-scute homolog 1 (Ascl1) som er involvert i fiskregenerering 7,8. Hos mus uttrykkes Ascl1 bare i RPC under retinogenese, men er fraværende i modne MG- eller retinale nevroner9.
Omprogrammering av celler direkte in vivo er ikke bare metodisk utfordrende, men krever også godkjenning fra en institusjonell dyrepleie- og brukskomité. For å motta godkjenning kreves foreløpige data om faktoren(e) som er brukt eller endret, konsentrasjoner, off-target effekter, underliggende mekanismer, toksisitet og effektivitet. Cellekultursystemer tillater testing for disse kriteriene før bruk i in vivo-modeller. Videre, siden MG bare utgjør omtrent 5% av hele retinalcellepopulasjonen10, tillater MG-kulturer studier av deres funksjon11 også deres oppførsel, inkludert migrasjon12,13, spredning14, stressreaksjon på skade / skade15,16, deres interaksjon med andre celletyper som microglia17 eller retinale ganglionceller (RGCs)18, eller deres nevrogene potensial 19,20,21. Mange forskere bruker udødelige cellelinjer for sine studier siden de har et ubegrenset proliferativt potensial og lett kan vedlikeholdes og transfectederes. Primære celler er imidlertid å foretrekke for biologisk relevante analyser enn immortaliserte celler siden de har sanne celleegenskaper (gen- og proteinuttrykk), og enda viktigere, de representerer et bestemt utviklingsstadium og derfor har en "alder". Alderen til et dyr (og følgelig av cellene hentet fra et dyr) er en spesielt avgjørende faktor i cellulær omprogrammering siden celleplastisiteten reduseres med utviklet utviklingsstadium22.
Denne protokollen beskriver i detalj hvordan man omprogrammerer primær MG med miRNA som en nåværende in vitro-metode for å studere regenerering. Denne MG primære kulturmodellen ble etablert i 2012 for å evaluere celleproliferasjonsegenskaper for MG i P53 knock-out mus (trp53-/- mus)23. Det ble vist at kultivert MG opprettholder sine glialegenskaper (dvs. ekspresjon av S100β-, Pax6- og Sox2-proteiner evaluert via immunfluorescerende merking), og at de ligner in vivo MG (mikromatrise av FACS-renset MG)23. Kort tid etter ble glial mRNA og proteinuttrykk validert og bekreftet i en annen tilnærming ved bruk av virale vektorer20. Noen år senere ble det bekreftet at de aller fleste cellene som finnes i disse kulturene er MG ved hjelp av MG-spesifikke Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reporter mus24. Videre viste kvantifisering av settet av miRNA i både FACS-renset MG og kultivert primær MG at nivåene av MG miRNA (mGLiomiRs) ikke varierer mye i kultivert MG i vekstfasen. Langstrakte kulturperioder forårsaker imidlertid endringer i miRNA-nivåer og følgelig i mRNA-nivåer og proteinuttrykk siden miRNA er translasjonsregulatorer25.
I 2013 ble denne MG-kulturmodellen brukt til å teste en rekke transkripsjonsfaktorer med hensyn til deres evne til å omprogrammere MG til retinale nevroner20. Ascl1 ble funnet å være en svært robust og pålitelig omprogrammeringsfaktor. Overekspresjon av Ascl1 via virale vektorer induserte morfologiske endringer, ekspresjon av nevronmarkører og oppkjøp av nevronale elektrofysiologiske egenskaper. Enda viktigere, innsikten og resultatene fra disse første in vitro-eksperimentene ble vellykket overført til in vivo-applikasjoner 22,26 som viser at primære MG-kulturer representerer et solid og pålitelig verktøy for innledende faktorscreening og evaluering av glialfunksjoner før in vivo implementering.
For noen år siden ble det vist at hjerneberiket miRNA miR-124, som også er sterkt uttrykt i retinale nevroner, kan indusere Ascl1-uttrykk i dyrket MG21. Ascl1-uttrykk i levende celler ble visualisert via en Ascl1 reportermus (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl). En reportermus er en genmodifisert mus som har et reportergen satt inn i sitt DNA. Dette reportergenet koder for et reporterprotein, som er i denne studien tdTomato, et rødt fluorescerende protein. Dette reporterproteinet rapporterer uttrykket av et gen av interesse, i dette tilfellet Ascl1. Med andre ord, celler som uttrykker Ascl1 vil bli røde. Siden Ascl1 bare uttrykkes i RPC9, tillater denne Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-musen sporing av MG-konvertering til Ascl1-uttrykk for RPC-er, noe som betyr at konvertering av celler vil uttrykke rødt fluorescerende tdTomato reporterprotein. Dette er irreversibel merking siden DNA fra disse cellene er endret. Følgelig vil enhver etterfølgende nevrondifferensiering bli visualisert fordi tdTomato-etiketten forblir i differensierende celler. Hvis Ascl1 som uttrykker MG-avledede RPC-er (med tdTomato-etikett) skiller seg ut i nevroner, vil disse nevronene fortsatt ha sin røde etikett. Denne musen tillater derfor ikke bare merking av MG-avledede RPC-er for levende celleavbildning, men tillater også skjebnekartlegging og avstamningssporing av disse MG-avledede (røde) RPC-ene. Mer nylig ble settet med miRNA i RPC-er identifisert, og MG-kulturer av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermus ble brukt til å skjerme og teste effekten av disse miRNA-ene på omprogrammeringskapasitet og effektivitet27. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, ble funnet i stand til å omprogrammere kultivert MG til Ascl1-uttrykkende (Ascl1-Tomato +) celler. Disse omprogrammerte cellene adopterer nevronale egenskaper over tid, inkludert nevronmorfologi (liten somata og enten korte eller lange fine prosesser), uttrykk for nevronale transkripsjoner målt via scRNA-Seq, samt ekspresjon av nevronproteiner validert via immunfluorescerende merking27.
Her beskriver protokollen hvordan man dyrker og transfekterer MG fra P12-mus tilpasset fra forrige arbeid 21,24,27. Valgt for denne protokollen er den nevnte miRNA miR-25, et miRNA sterkt uttrykt i RPC, med lave ekspresjonsnivåer i MG eller retinale nevroner. For å overuttrykke miR-25, brukes murine miR-25 etterligner, dvs. kunstige miRNA-molekyler. Som en kontroll velges etterligninger av et miRNA fra Caenorhabditis elegans, som ikke har noen funksjon i pattedyrceller. Visualisering av konverteringen av MG til RPC-er ble oppnådd via RPC-reportermusen (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl), en mus med blandet bakgrunn (C57BL / 6, S129 og ICR-stammer). Denne kulturen kan imidlertid utføres med alle musestammer, inkludert villtypestammer. I løpet av de siste årene har den opprinnelige protokollen blitt modifisert for å redusere vekstfasevarigheten og den generelle kulturperioden og sikre en mer robust gliacellestatus og minimere graden av cellulær degenerasjon, som oppstår i lengre kulturperioder. Det vanlige transfeksjonstidsvinduet ble også utvidet fra 3 timer til 2 dager. Som nevnt tidligere, selv om den nåværende protokollen beskriver MG-kulturer som et verktøy for regenereringsstudier, er metoden ikke bare nyttig for å teste omprogrammeringsfaktorer, men kan også tilpasses for andre applikasjoner, inkludert studier om MG-migrerende eller proliferativ oppførsel, skade / celleskaderelaterte paradigmer og / eller identifisering av underliggende mekanismer og veier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

Müller glia (MG) er den dominerende glia i nevral retina og kan fungere som en regenerativ kilde for retinale nevroner. Hos lavere virveldyr som fisk forekommer MG-drevet regenerering naturlig; hos pattedyr er det imidlertid nødvendig med stimulering med visse faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulasjon. Siden MG bare utgjør 5% av retinalcellepopulasjonen, er det behov for modellsystemer som utelukkende tillater studier av denne cellepopulasjonen. Et av disse modellsystemene er primære MG-kulturer som er reproduserbare og kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert screening og identifisering av molekyler / faktorer, testing av forbindelser eller faktorer, celleovervåking og / eller funksjonstester. Denne modellen brukes til å studere potensialet til murine MG for å konvertere til retinale nevroner etter tilskudd eller inhibering av mikroRNA (miRNA) via transfeksjon av kunstige miRNA eller deres hemmere. Bruken av MG-spesifikke reportermus i kombinasjon med immunfluorescerende merking og enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) bekreftet at 80% -90% av cellene som finnes i disse kulturene er MG. Ved hjelp av denne modellen ble det oppdaget at miRNA kan omprogrammere MG til retinale stamceller (RPC), som senere skiller seg ut i nevronlignende celler. Fordelene med denne teknikken er at miRNA-kandidater kan testes for effektivitet og utfall før de brukes i in vivo-applikasjoner .

Denne protokollen beskriver hvordan du dyrker MG fra P12 musehinner og hvordan du omprogrammerer disse cellene med miR-25 til retinale nevroner ved hjelp av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC reportermus. Denne metoden ble brukt i tidligere arbeidsrapportering i detalj andre egnede miRNA (etterligner eller hemmere, som enkeltmolekyler eller i kombinasjon) for å omprogrammere MG til RPC som deretter vedtar nevroncelleegenskaper27. Denne metoden har blitt modifisert...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Müller glia primære kulturer hentet fra musehinnen representerer et meget robust og pålitelig verktøy for å studere glialkonvertering til retinale stamceller etter mikroRNA-behandling. Enkeltmolekyler eller kombinasjoner kan testes før deres påfølgende anvendelse av in vivo-tilnærminger .

Primære cellekulturer for å studere regenereringspotensialet til Murine Müller Glia etter microRNA-behandling

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Denne protokollen gjør det mulig å studere potensialet og evnen til Muller glia til å konvertere til retinale stamceller etter behandling med spesifikke faktorer som mikroRNA. Fordelen med denne teknikken er at mikroRNA-kandidater kan testes for effektivitet og utfall før de brukes in vivo-applikasjoner. Å bidra til å demonstrere prosedyren vil være Seoyoung Kang, en doktorgradsstudent fra laboratoriet til Stefanie Wohl.Dypp først det fjernede øyebollet kort i et rør med etanol for å unngå overføring av bakterier fra dyret. Vask deretter øyeeplet kort i 10 centimeter petriskålen før du legger det i 24-brønnsplaten på is. Når øyebollene er fjernet og rengjort, plasser ett øye i disseksjonsfatet plassert under et dissekeringsmikroskop med en lyskilde.Fest nå ett øyeeplet ved å ta tak i optisk nerve og det omkringliggende bindevevet rundt sclera med Dumont 5 fine tang og trykk det forsiktig mot disseksjonsfatet. Deretter lager du et hull i hornhinnesenteret ved hjelp av en 30 gauge nål for å gi lettere tilgang til venøs saks. Deretter dissekerer du hornhinnen rundt ciliary kroppen ved hjelp av venøs saks og fjerner forsiktig hornhinnen, linsen, iris og glasslegemet med Dumont 5 fine tang.Senere dissekere sclera med venøs saks til optisk nerve er nådd og forsiktig trekke ut netthinnen ved hjelp av Dumont 5 fine tang. Bruk nå en andre Dumont 5 fine tang for å presse mot netthinnen og fjerne glasslegemet helt. Overfør netthinnen kuttet ca. 2,5 centimeter av spissen av en steril overføringspipette for å forstørre diameteren.Bruk nå denne spissen, plukk opp hele netthinner uten å skade vevet og overfør netthinnen til en ny steril petriskål med kald HBSS og rock parabolen. Deretter, ved hjelp av en ny steril overføringspipette, skyv netthinnen forsiktig rundt for å vaske av retinale pigmentepitelceller. Plasser umiddelbart den isolerte netthinnen i en ny ren brønn på 24-brønnplaten fylt med en milliliter HBSS mens du holder 24-brønnplaten på isen under disseksjonen.Forbered Papain DNase I dissosiasjonsblanding som beskrevet i manuskriptet. Nå med en forstørret spissoverføringspipette, plukk opp netthinnen. Vent til netthinnen legger seg nederst på spissen og slipp netthinnen uten overdreven HBSS i røret som inneholder Papain DNase I-blandingen.Deretter legger du røret på en nutator i inkubatoren og inkuberer i 10 minutter ved 37 grader Celsius og med 5% karbondioksid. Deretter dissosierer du cellene ved å forsiktig pipettere opp og ned med en milliliter pipette. Etter at cellene er dissosiert, tilsett 275 mikroliter ovomucoid proteasehemmer fra Papain dissosiasjonssett for å nøytralisere Papain og bland forsiktig ved pipettering opp og ned.Plasser rør i en sentrifuge og spinn ved fire grader Celsius i åtte minutter ved en relativ sentrifugalkraft på 300. Legg epidermal vekstfaktor til det beregnede volumet av vekstmedium forvarmet ved 37 grader Celsius. Fjern rørene forsiktig fra sentrifugen.Uten å berøre pelleten i bunnen av røret, fjern supernatanten forsiktig og helt. Nå resuspendere cellepelleten med 500 mikroliter epidermal vekstfaktor supplert vekstmedium. Overfør deretter cellesuspensjonen til en brønn på den merkede 12-brønnplaten.Skyll røret med ytterligere 500 mikroliter av den epidermale vekstfaktoren supplert vekstmedium og legg det til brønnen. Rock brønnplaten forsiktig, og legg deretter platen inn i inkubatoren ved 37 grader Celsius med karbondioksid. Begynn med å sjekke om 90% til 100% celle sammenløp.Fjern deretter mediet og tilsett en milliliter kald HBSS for å vaske brønnen. Vipp platen forsiktig og fjern HBSS uten spor igjen. Senere tilsettes 500 mikroliter av en forvarmet trypsinholdig løsning for å løsne cellene fra brønnen.Rock forsiktig og inkubere i to minutter i 37 grader Celsius inkubator. Etter å ha flyttet platen fra inkubatoren til biosikkerhetsskapet, aspirer trypsinholdig løsning mens du vipper. Spre det forsiktig og sakte over brønnen flere ganger til cellene løsner helt.Deretter overfører du denne cellesuspensjonen til et sterilt 1,5 milliliter rør og legger rør inn i sentrifugen. Spinn ved 300 ganger g i åtte minutter ved fire grader Celsius og ta rør tilbake i biosikkerhetsskapet. Fjern supernatanten uten å berøre pelleten.Resuspender nå cellepelleten forsiktig ved å tilsette 600 mikroliter forvarmet vekstmedium og pipettere opp og ned ca. 30 til 40 ganger. Til slutt, frø 100 mikroliter av den oppnådde cellesuspensjonen i midten av seks belagte deksel slips av 24 brønnplaten. Plasser platen på inkubatoren og la cellene nøye seg med etterfølgende transfeksjon ved hjelp av mikroRNA-etterligninger.Figuren viser kontrollforhold fem dager etter transfeksjon med noen få Ascl1-Tomato positive celler tilstede. Etter en miR-25-behandling finnes det imidlertid mange flere Ascl1-Tomato-positive celler. Kvantifiseringen viste en firedobling i antall Ascl1-Tomato-positive celler i miR-25-behandlede brønner sammenlignet med kontroller.Viktigst, det store flertallet av Ascl1-Tomato positive celler funnet i riR-25 behandlede brønner vedtok en neuronal morfologi. Funksjoner i denne nevronale morfologien inkluderte redusert celle soma størrelse, utvikling av fine prosesser og dannelse av små nettverk. Kvantifiseringen viste at omtrent 70% av alle Ascl1-Tomato positive celler hadde nevronale egenskaper.Immunfluorescerende merking viser at Ascl1-Tomat positive celler med nevronal morfologi uttrykker nevrale markører OTX2 og MAP2, bekrefter nevronidentitet. Kvantifiseringen av disse cellene viste at etter miR-25 overekspresjon er omtrent 40 Ascl1-Tomato-positive nevroner per felt tilstede sammenlignet med fem nevronceller per felt i kontroller. De identifiserte nevroncellene utgjør ca. 70% av den totale Ascl1-Tomato-positive cellepopulasjonen i miR-25-behandlede prøver.Videre viste kvantifisering av det absolutte antallet OTX2- og MAP2-kouttrykkende nevroner at etter miR-25-behandling ble det funnet ca. 60 nevroner per felt sammenlignet med 10 nevroner per felt i kontroller. Det er viktig å jobbe i et rent og desinfisert miljø med rene og sterile verktøy og å jobbe nøye ved å unngå hard behandling. Nedstrøms applikasjoner kan for eksempel være proteinkvantifisering, DNA- eller RNA-analyse eller elektrofysiologiske studier.Denne teknikken hjalp oss med å utforske innledende spørsmål om kjernefysisk omprogrammering som tilhører feltet regenerativ medisin. Og det er en lang rekke faktorer og forhold som kan testes for å utforske nye spørsmål.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differensiering av Human Neural Stem Cell Line on tredimensjonal kulturer, Analyse av mikroRNA og Antatte målgener

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Bruk av Teton system for å studere molekylære mekanismer av Sebrafisk Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocytter spesifikke Ablation i Sebrafisk å studere Galledrevet Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimalisering av Wound Scratch analysen å oppdage endringer i Murint Mesenchymale stromal Cell Migration Etter Skade ved Løselig sigarettrøyk Extract

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Utvikling av en etanol-indusert Fibrotiske Liver Modell i Sebrafisk å studere stamceller-mediert hepatocytter Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metode for å få dedifferensierte fettcellene

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Menneskelig Primær trophoblast? Trophoblast Cell Culture modell for å studere den beskyttende effekten av melatonin mot Hypoksi / Reoksygeneringen-indusert Forstyrrelse

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Bruke Primære neurosfærekulturer å studere Primær Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolering og karakterisering av primære rotte ventil interstitielle cellene: en ny modell å studere Aortaklaff forkalkninger

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Metoder for studier av gjenfødelse Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...