Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Os autores agradecem a Dra. Agradecimentos especiais aos Drs. Tom Reh, Julia Pollak e Russ Taylor por introduzirem culturas primárias de MG como uma ferramenta de triagem para a S.G.W. durante o treinamento de pós-doutorado na Universidade de Washington, em Seattle. O estudo foi financiado pelo Empire Innovation Program (EIP) Grant to S.G.W. e fundos in start-up da SUNY Optometria para a S.G.W., bem como o prêmio R01EY032532 do National Eye Institute (NEI) para s.G.W.

Os procedimentos envolvendo matérias animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Faculdade suny de Optometria.
NOTA: Este protocolo de cultura consiste em três fases: crescimento, transfecção e fase de conversão. Um resumo do protocolo geral com o cronograma é dado na Figura 1.
1. Preparação de mídia e todos os reagentes necessários
NOTA:...

Este protocolo descreve como cultivar MG a partir de retinas de camundongos dissociados para estudos de reprogramação usando miRNAs. Como mostrado e confirmado em uma variedade de estudos anteriores, a grande maioria (80%-90%) das células encontradas nessas culturas são MG 20,23,24. Este método é uma técnica muito robusta e confiável e os resultados podem ser facilmente reproduzidos se o protocolo for seguido corretament...

A glia Müller (MG) é a glia predominante na retina neural. Eles têm funções semelhantes em comparação com outras glia em outras partes do sistema nervoso central, como manter a água e a homeostase de íon, nutrir neurônios e proteger o tecido. Mg tem outra característica fascinante: embora sejam glia maduras, elas ainda expressam muitos genes expressos em células progenitoras de retina (RPCs) durante o desenvolvimento tardio 1,2. Essa semelhança é considerada a razão para a regeneração neuronal baseada em MG na retina do peixe após danos na retina 3,4. Durante esse processo, a MG reentra no ciclo celular e se desfastou em RPCs que, em seguida, se diferenciam em todos os seis tipos de neurônios da retina. Embora este fenômeno ocorra naturalmente em peixes, os mamíferos MG não se convertem em neurônios 5,6. Eles podem, no entanto, ser reprogramados. Uma variedade de fatores tem sido mostrado para reprogramar MG em RPCs/neurônios; entre esses fatores está o fator básico de transcrição helix-loop-helix (bHLH) que está envolvido na regeneração de peixes 7,8. Em camundongos, Ascl1 só é expresso em RPCs durante a retinogênese, mas está ausente em MG maduro ou neurônios de retina9.
A reprogramação de células diretamente in vivo não só é metodologicamente desafiadora, mas também requer a aprovação de um comitê institucional de cuidados e uso de animais. Para receber aprovação, são necessários dados preliminares sobre os fatores usados ou alterados, concentrações, efeitos fora do alvo, mecanismos subjacentes, toxicidade e eficiência. Os sistemas de cultura celular permitem testes para esses critérios antes do uso em modelos in vivo. Além disso, como MG compreende apenas cerca de 5% de toda a população de células da retina10, as culturas de MG permitem o estudo de sua função11, bem como seu comportamento, incluindo migração12,13, proliferação14, reação de estresse a lesões/danos15,16, sua interação com outros tipos celulares como microglia17 ou células de gânglios de retina (RGCs)18, ou seu potencial neurogênico 19,20,21. Muitos pesquisadores usam linhas celulares imortalizadas para seus estudos, pois têm um potencial proliferativo ilimitado e podem ser facilmente mantidas e transfetizadas. As células primárias, no entanto, são preferíveis para ensaios biologicamente relevantes do que células imortalizadas, pois possuem características celulares verdadeiras (expressão genética e proteica) e, mais importante, representam um certo estágio no desenvolvimento e, portanto, têm uma "idade". A idade de um animal (e consequentemente das células obtidas de um animal) é um fator especialmente crucial na reprogramação celular, uma vez que a plasticidade celular reduz com o estágio de desenvolvimentoprogredido 22.
Este protocolo descreve em detalhes como reprogramar MG primário com miRNAs como um método in vitro atual para estudar a regeneração. Este modelo de cultura primária de MG foi criado em 2012 para avaliar as características de proliferação celular de MG em camundongos knock-out P53 (trp53-/- camundongos)23. Mostrou-se que mg cultivados mantêm suas características gliais (ou seja, expressão de proteínas S100β, Pax6 e Sox2 avaliadas via rotulagem imunofluorescente), e que se assemelham a in vivo MG (microarray de FACS-purificado MG)23. Pouco depois, mRNA glial e expressão proteica foram validados e confirmados em uma abordagem diferente utilizando vetores virais20. Alguns anos depois, foi confirmado que a grande maioria das células encontradas nessas culturas são MG usando o Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter mouse24. Além disso, a quantificação do conjunto de miRNAs tanto em MG purificada facs quanto em MG primária cultivada mostrou que os níveis de MG miRNAs (mGLiomiRs) não variam muito em MG cultivada durante a fase de crescimento. Períodos de cultura alongados, no entanto, causam alterações nos níveis de miRNA e, consequentemente, nos níveis de mRNA e expressão proteica, uma vez que os miRNAs são reguladores translacionais25.
Em 2013, este modelo de cultura mg foi utilizado para testar uma variedade de fatores de transcrição no que diz respeito à sua capacidade de reprogramar MG em neurôniosretinais 20. O Ascl1 foi considerado um fator de reprogramação muito robusto e confiável. A superexpressão de Ascl1 através de vetores virais induziu alterações morfológicas, expressão de marcadores neuronais e aquisição de propriedades eletrofisiológicas neuronais. Mais importante, os insights e resultados obtidos a partir desses primeiros experimentos in vitro foram transferidos com sucesso para aplicações in vivo 22,26 demonstrando que as culturas primárias de MG representam uma ferramenta sólida e confiável para triagens iniciais de fatores e avaliação de recursos gliais antes da implementação in vivo.
Alguns anos atrás, foi mostrado que o miRNA miR-124 enriquecido pelo cérebro, que também é altamente expresso em neurônios da retina, pode induzir a expressão Ascl1 em MG21 cultivada. A expressão ascl1 em células vivas foi visualizada através de um rato repórter Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Um rato repórter é um rato geneticamente modificado que tem um gene repórter inserido em seu DNA. Este gene repórter codifica uma proteína repórter, que está neste estudo tdTomato, uma proteína fluorescente vermelha. Esta proteína repórter relata a expressão de um gene de interesse, neste caso, Ascl1. Em outras palavras, as células que expressam Ascl1 ficarão vermelhas. Uma vez que o Ascl1 é expresso apenas em RPCs9, este rato Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl permite o rastreamento da conversão de MG em RPCs expressos ascl1 , o que significa que as células de conversão expressarão proteína de repórter tdTomato fluorescente vermelho. Esta é uma rotulagem irreversível, já que o DNA dessas células é alterado. Consequentemente, qualquer diferenciação neuronal subsequente será visualizada porque o rótulo tdTomato permanece em células diferenciadoras. Se ascl1 expressando RPCs derivados de MG (com rótulo tdTomato) se diferenciarem em neurônios, esses neurônios ainda terão seu rótulo vermelho. Este mouse, portanto, permite não apenas a rotulagem de RPCs derivados de MG para imagens de células vivas, mas também permite mapeamento de destino e rastreamento de linhagem desses RPCs derivados de MG (vermelho). Mais recentemente, o conjunto de miRNAs em RPCs foi identificado e as culturas mg de ratos Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter foram usadas para tela e teste o efeito desses miRNAs na capacidade de reprogramação e eficiência27. Um candidato, o RPC-miRNA miR-25, foi encontrado capaz de reprogramar MG cultivado em células expressantes Ascl1 (Ascl1-Tomate+). Essas células reprogramadas adotam características neuronais ao longo do tempo, incluindo morfologia neuronal (pequeno somata e processos finos curtos ou longos), expressão de transcrições neuronais medidas via scRNA-Seq, bem como expressão de proteínas neuronais validadas via rotulagem imunofluorescente27.
Aqui, o protocolo detalha como crescer e transfectar MG a partir de camundongos P12 adaptados do trabalho anterior 21,24,27. Escolhido para este protocolo é o miRNA miR-25 acima mencionado, um miRNA altamente expresso em RPCs, com baixos níveis de expressão em MG ou neurônios de retina. Para superexpressar o miR-25, são utilizadas mímicas de murine miR-25, ou seja, moléculas artificiais de miRNA. Como controle, são escolhidas imitações de um miRNA de caenorhabditis elegans, que não têm função em células de mamíferos. A visualização da conversão de MG em RPCs foi realizada através do mouse repórter RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), um mouse com fundo misto (cepas C57BL/6, S129 e ICR). Essa cultura pode, no entanto, ser realizada com todas as cepas de camundongos, incluindo cepas do tipo selvagem. Nos últimos anos, o protocolo original foi modificado para reduzir a duração da fase de crescimento e o período de cultura geral e garantir um status celular glia mais robusto e minimizar o grau de degeneração celular, que ocorre em períodos de cultura prolongada. O horário regular de transfecção também foi estendido de 3h para 2 dias. Como mencionado anteriormente, embora o protocolo atual descreva as culturas de MG como uma ferramenta para estudos de regeneração, o método não é apenas útil para testar fatores de reprogramação, mas também pode ser adaptado para outras aplicações, incluindo estudos sobre comportamento migratório ou proliferativo de MG, paradigmas relacionados a lesões/danos celulares e/ou a identificação de mecanismos e caminhos subjacentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

Müller glia (MG) é a glia predominante na retina neural e pode funcionar como fonte regenerativa para neurônios da retina. Em vertebrados inferiores, como peixes, a regeneração orientada por MG ocorre naturalmente; em mamíferos, no entanto, é necessária estimulação com certos fatores ou manipulação genética/epigenética. Como a MG compreende apenas 5% da população de células da retina, há necessidade de sistemas de modelo que permitam o estudo dessa população celular exclusivamente. Um desses sistemas de modelo são culturas primárias de MG que são reprodutíveis e podem ser usadas para uma variedade de aplicações, incluindo triagem e identificação de moléculas/fatores, testes de compostos ou fatores, monitoramento celular e/ou testes funcionais. Este modelo é usado para estudar o potencial de mamão murina para converter em neurônios de retina após suplementação ou inibição de microRNAs (miRNAs) via transfecção de miRNAs artificiais ou seus inibidores. O uso de camundongos repórteres específicos de MG em combinação com rotulagem imunofluorescente e sequenciamento de RNA unicelular (scRNA-seq) confirmou que 80%-90% das células encontradas nessas culturas são MG. Usando este modelo, descobriu-se que miRNAs podem reprogramar MG em células progenitoras de retina (RPCs), que posteriormente se diferenciam em células neuronais. As vantagens dessa técnica são que os candidatos do miRNA podem ser testados para sua eficiência e resultado antes de seu uso em aplicações in vivo .

Este protocolo descreve como cultivar MG a partir de retinas de camundongos P12 e como reprogramar essas células com miR-25 em neurônios de retina usando o rato repórter Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Este método foi utilizado em trabalhos anteriores relatando em detalhes outros miRNAs adequados (imitadores ou inibidores, como moléculas únicas ou em combinação) para reprogramar MG em RPC que, em seguida, adotam características celulares neuronais27. Este...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

As culturas primárias de Müller glia obtidas a partir de retinas de camundongos representam uma ferramenta muito robusta e confiável para estudar a conversão gliaial em células progenitoras de retina após o tratamento de microRNA. Moléculas ou combinações únicas podem ser testadas antes de sua subsequente aplicação de abordagens in vivo .

Culturas celulares primárias para estudar o potencial de regeneração de Murine Müller Glia após tratamento de MicroRNA

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Este protocolo permite estudar o potencial e a capacidade de Muller glia de converter em células progenitoras de retina após o tratamento com fatores específicos como microRNAs. A vantagem dessa técnica é que os candidatos a microRNA podem ser testados para sua eficiência e resultado antes de seu uso em aplicações in vivo. Ajudando a demonstrar o procedimento estará Seoyoung Kang, um estudante de doutorado do laboratório de Stefanie Wohl.Primeiro, mergulhe o globo ocular removido brevemente em um tubo com etanol para evitar a transferência de bactérias do animal. Em seguida, lave o globo ocular brevemente na placa de Petri de 10 centímetros antes de colocá-lo na placa de 24 poços no gelo. Uma vez que os globos oculares são removidos e limpos, coloque um olho no prato de dissecção colocado sob um microscópio dissecando com uma fonte de luz.Agora conserte um globo ocular agarrando o nervo óptico e o tecido conjuntivo circundante ao redor da esclera com Dumont 5 fórceps finos e pressione-o cuidadosamente contra o prato de dissecção. Em seguida, faça um furo no centro da córnea usando uma agulha calibre 30 para facilitar o acesso à tesoura venosa. Em seguida, disseca a córnea ao redor do corpo ciliar usando uma tesoura venosa e remova cuidadosamente a córnea, lente, íris e corpo vítreo com Dumont 5 fórceps finos.Mais tarde disseque a esclera com uma tesoura venosa até que o nervo óptico seja atingido e extraia cuidadosamente a retina usando fórceps finos Dumont 5. Agora use um segundo fórceps finos Dumont 5 para empurrar contra a retina e remover completamente o corpo vítreo. Transfira as retinas cortadas cerca de 2,5 centímetros da ponta de uma pipeta de transferência estéril para ampliar o diâmetro.Agora, usando esta dica, pegue retinas inteiras sem danificar o tecido e transfira as retinas para uma nova placa de Petri estéril com HBSS frio e arrase o prato. Em seguida, usando uma nova pipeta de transferência estéril, empurre cuidadosamente as retinas ao redor para lavar as células epiteliais do pigmento da retina. Coloque imediatamente a retina isolada em um novo poço limpo da placa de 24 poços preenchida com um mililitro de HBSS enquanto mantém a placa de 24 poços no gelo durante a dissecção.Prepare a mistura de dissociação de Papain DNase I, conforme descrito no manuscrito. Agora com uma pipeta de transferência de ponta ampliada, pegue as retinas. Aguarde até que as retinas se acomodem na parte inferior da ponta e solte as retinas sem HBSS excessivos no tubo contendo mistura Papain DNase I.Em seguida, coloque o tubo em um nutador na incubadora e incubar por 10 minutos a 37 graus Celsius e com 5% de dióxido de carbono. Em seguida, dissociar as células, encanar cuidadosamente para cima e para baixo com uma pipeta de um mililitro. Depois que as células forem dissociadas, adicione 275 microliters de inibidor de protease ovomucoid do kit de dissociação papain para neutralizar o Papain e misturar suavemente por pipetação para cima e para baixo.Coloque tubos em uma centrífuga e gire a quatro graus Celsius por oito minutos a uma força centrífuga relativa de 300. Adicione o fator de crescimento epidérmico ao volume calculado de crescimento médio pré aquecido a 37 graus Celsius. Remova cuidadosamente os tubos da centrífuga.Sem tocar na pelota na parte inferior do tubo, remova o sobrenatante com cuidado e completamente. Agora resuspenja a pelota celular com 500 microliters de fator de crescimento epidérmico complementado meio de crescimento. Em seguida, transfira a suspensão da célula para um poço da placa de 12 poços.Enxágüe o tubo com outros 500 microliters do fator de crescimento epidérmico complementou o crescimento médio e adicione-o ao poço. Balance a placa do poço cuidadosamente, em seguida, coloque a placa na incubadora a 37 graus Celsius com dióxido de carbono. Comece verificando a confluência celular de 90% a 100%.Em seguida, retire o meio e adicione um mililitro de HBSS frio para lavar o poço. Balance suavemente a placa e remova o HBSS sem nenhum traço esquerdo. Mais tarde, adicione 500 microliters de uma trippsina pré aquecida contendo solução para separar as células do poço.Bata suavemente e incubar por dois minutos em incubadora Celsius de 37 graus. Depois de mover a placa da incubadora para o armário de bio segurança, aspire a solução de trypsin contendo enquanto inclina. Disperse-o cuidadosamente e lentamente sobre o poço várias vezes até que as células se desprendem completamente.Em seguida, transfira esta suspensão celular para um tubo estéril de 1,5 mililitro e coloque tubos na centrífuga. Gire a 300 vezes g por oito minutos a quatro graus Celsius e traga tubos de volta para o armário de bio segurança. Remova o supernatante sem tocar na pelota.Agora, ressuspenque cuidadosamente a pelota celular adicionando 600 microliters de meio de crescimento pré-aquecido e pipetando para cima e para baixo aproximadamente 30 a 40 vezes. Finalmente, sementes 100 microliters da suspensão celular obtida no centro de seis deslizamentos de cobertura revestidos da placa de 24 poços. Coloque a placa na incubadora e deixe as células se contentarem com a transfecção subsequente usando micro RNA imitações.A figura mostra condições de controle cinco dias após a transfecção com algumas células positivas Ascl1-Tomate presentes. Após um tratamento miR-25, no entanto, muitas mais células positivas Ascl1-Tomate são encontradas. A quantificação revelou um aumento de quatro vezes no número de células positivas Ascl1-Tomate nos poços tratados miR-25 em comparação com os controles.Mais importante, a grande maioria das células positivas ascl1-tomate encontradas nos poços tratados riR-25 adotou uma morfologia neuronal. As características dessa morfologia neuronal incluíram redução do tamanho da soma celular, o desenvolvimento de processos finos e a formação de pequenas redes. A quantificação revelou que cerca de 70% de todas as células positivas ascl1-tomate tinham características neuronais.A rotulagem imunofluorescente mostra que as células positivas de Ascl1-Tomate com morfologia neuronal expressam os marcadores neurais OTX2 e MAP2, confirmando a identidade neuronal. A quantificação dessas células revelou que após a superexpressão miR-25, cerca de 40 neurônios positivos ascl1-tomate por campo estão presentes em comparação com cinco células neuronais por campo em controles. As células neuronais identificadas constituem cerca de 70% da população celular positiva Ascl1-Tomate total das amostras tratadas miR-25.Além disso, a quantificação do número absoluto de neurônios coexpressos OTX2 e MAP2 mostrou que após o tratamento do miR-25, cerca de 60 neurônios por campo foram encontrados em comparação com 10 neurônios por campo em controles. É imprescindível trabalhar em um ambiente limpo e higienizado com ferramentas limpas e estéreis e trabalhar com cuidado evitando qualquer tratamento severo. Aplicações a jusante podem ser, por exemplo, quantificação de proteínas, análise de DNA ou RNA, ou estudos eletrofisiológicos.Essa técnica nos ajudou a explorar questões iniciais sobre a reprogramação nuclear que pertence ao campo da medicina regenerativa. E há uma longa gama de fatores e condições que podem ser testados para explorar novas questões.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Biologia do Desenvolvimento

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Uso do Sistema de Teton para estudar os mecanismos moleculares de Regeneração Zebrafish

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablação específicas do hepatócito em Zebrafish para estudar a regeneração do fígado-driven biliar

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Otimização do Ensaio Wound zero para detectar mudanças na Murino estromais mesenquimais migração celular após a lesão por Extract fumo do cigarro Solúvel

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Desenvolvimento de um modelo de fígado fibrótica induzida por etanol no peixe-zebra para estudar Progenitor mediada por células de regeneração de hepatócitos

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Um método eficiente para obter células de gordura desdiferenciado

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Trophoblast primário humano Cultura celular modelo para estudar os efeitos protetores da melatonina contra a hipóxia / Disruption induzida pela reoxigenação

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Usando culturas neurosphere primárias para o Estudo Primário Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolamento e caracterização de rato primário válvula células intersticiais: um novo modelo para estudar a calcificação da válvula aórtica

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Métodos para o estudo da regeneração em Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...