Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Авторы благодарят доктора Энн Битон и всех членов лаборатории за их вклад в рукопись. Особая благодарность докторам Тому Реху, Джулии Поллак и Рассу Тейлору за внедрение первичных культур MG в качестве инструмента скрининга для S.G.W. во время постдокторантуры в Вашингтонском университете в Сиэтле. Исследование финансировалось грантом Имперской инновационной программы (EIP) для S.G.W. и стартовыми фондами от SUNY Optometry до S.G.W., а также премией R01EY032532 от Национального института глаз (NEI) для S.G.W.

Процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Колледже оптометрии SUNY.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол культивирования состоит из трех фаз: роста, трансфекции и фазы преобразования. Краткое изложение...

Этот протокол описывает, как вырастить MG из диссоциированных сетчаток мыши для исследований перепрограммирования с использованием миРНК. Как показано и подтверждено в различных предыдущих исследованиях, подавляющее большинство (80%-90%) клеток, обнаруженных в этих культурах, составляют...

Мюллеровская глия (MG) является преобладающей глией в нервной сетчатке. Они имеют аналогичные функции по сравнению с другими глиями в других частях центральной нервной системы, таких как поддержание водного и ионного гомеостаза, питание нейронов и защита тканей. У MG есть еще одна увлекательная особенность: хотя они являются зрелыми глиями, они все еще экспрессируют многие гены, экспрессируемые в клетках-предшественниках сетчатки (RPC) во время позднего развития 1,2. Предполагается, что это сходство является причиной естественной регенерации нейронов на основе MG в сетчатке рыб после повреждения сетчатки 3,4. Во время этого процесса MG повторно входят в клеточный цикл и дедифференцируются в RPC, которые затем дифференцируются во все шесть типов нейронов сетчатки. Хотя это явление встречается естественным образом у рыб, МГ млекопитающих не превращаются в нейроны 5,6. Однако они могут быть перепрограммированы. Было показано, что различные факторы перепрограммируют MG в RPC/ нейроны; среди этих факторов — основной фактор транскрипции спираль-петля-спираль (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1), который участвует в регенерации рыб 7,8. У мышей Ascl1 экспрессируется только в RPC во время ретиногенеза, но отсутствует в зрелых MG или нейронах сетчатки9.
Перепрограммирование клеток непосредственно in vivo является не только методологически сложной задачей, но и требует одобрения институционального комитета по уходу за животными и их использованию. Для получения одобрения требуются предварительные данные об используемом или измененном факторе (факторах), концентрациях, нецелевых эффектах, основных механизмах, токсичности и эффективности. Системы клеточных культур позволяют тестировать эти критерии перед использованием в моделях in vivo. Более того, поскольку МГ составляют только около 5% всей популяции клеток сетчатки10, культуры МГ позволяют изучать их функцию11, а также их поведение, включая миграцию12,13, пролиферацию14, стрессовую реакцию на травму / повреждение15,16, их взаимодействие с другими типами клеток, такими как микроглия17 или ганглиозные клетки сетчатки (RGC)18, или их нейрогенный потенциал 19,20,21. Многие исследователи используют увековеченные клеточные линии для своих исследований, поскольку они имеют неограниченный пролиферативный потенциал и могут легко поддерживаться и трансфицироваться. Первичные клетки, однако, предпочтительнее для биологически значимых анализов, чем увековеченные клетки, поскольку они имеют истинные клеточные характеристики (экспрессия генов и белков) и, что более важно, они представляют собой определенную стадию развития и, следовательно, имеют «возраст». Возраст животного (и, следовательно, клеток, полученных от животного) является особенно важным фактором в клеточном перепрограммировании, поскольку пластичность клеток уменьшается с прогрессирующей стадией развития22.
Этот протокол подробно описывает, как перепрограммировать первичный МГ с миРНК в качестве текущего метода in vitro для изучения регенерации. Эта модель первичной культуры MG была создана в 2012 году для оценки характеристик пролиферации клеток MG у нокаутирующих мышей P53 (trp53-/- мышей)23. Было показано, что культивируемые МГ сохраняют свои глиальные свойства (т.е. экспрессию белков S100β, Pax6 и Sox2, оцененных с помощью иммунофлуоресцентной маркировки), и что они напоминают in vivo MG (микрочип ОЧИЩЕННОГО FACS MG)23. Вскоре после этого глиальная мРНК и экспрессия белка были проверены и подтверждены в другом подходе с использованием вирусных векторов20. Несколько лет спустя было подтверждено, что подавляющее большинство клеток, обнаруженных в этих культурах, являются MG с помощью MG-специфической Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl репортерной мыши24. Кроме того, количественная оценка набора миРНК как в FACS-очищенных МГ, так и в культивируемых первичных МГ показала, что уровни МГ миРНК (mGLiomiRs) не сильно различаются в культивируемых МГ во время фазы роста. Однако удлиненные периоды культивирования вызывают изменения в уровнях миРНК и, следовательно, в уровнях мРНК и экспрессии белка, поскольку миРНК являются трансляционными регуляторами25.
В 2013 году эта модель культуры MG была использована для тестирования различных факторов транскрипции в отношении их способности перепрограммировать MG в нейроны сетчатки20. Ascl1 оказался очень надежным и надежным фактором перепрограммирования. Сверхэкспрессия Ascl1 через вирусные векторы индуцировала морфологические изменения, экспрессию нейронных маркеров и приобретение нейрональных электрофизиологических свойств. Что еще более важно, идеи и результаты, полученные в результате этих первых экспериментов in vitro, были успешно перенесены в приложения in vivo 22,26, демонстрируя, что первичные культуры MG представляют собой надежный и надежный инструмент для скрининга начальных факторов и оценки глиальных признаков до реализации in vivo.
Несколько лет назад было показано, что обогащенная мозгом миРНК miR-124, которая также высоко экспрессируется в нейронах сетчатки, может индуцировать экспрессию Ascl1 в культивируемом MG21. Экспрессия Ascl1 в живых клетках визуализировалась с помощью репортерской мыши Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Мышь-репортер — это генетически модифицированная мышь, в ДНК которой вставлен ген репортера. Этот ген-репортер кодирует репортерный белок, который находится в этом исследовании tdTomato, красный флуоресцентный белок. Этот белок-репортер сообщает о экспрессии интересующего гена, в данном случае Ascl1. Другими словами, клетки, которые экспрессируют Ascl1 , станут красными. Поскольку Ascl1 экспрессируется только в RPC9, эта мышь Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl позволяет отслеживать преобразование MG в Ascl1 , экспрессирующие RPC, что означает, что преобразующие клетки будут экспрессировать красный флуоресцентный tdTomato репортерный белок. Это необратимая маркировка, так как ДНК этих клеток изменяется. Следовательно, любая последующая дифференцировка нейронов будет визуализирована, потому что метка tdTomato остается в дифференцирующих клетках. Если Ascl1 , экспрессирующие RPC, полученные из MG (с меткой tdTomato), дифференцируются в нейроны, эти нейроны все равно будут иметь свою красную метку. Таким образом, эта мышь позволяет не только маркировать RPC, полученные из MG, для визуализации живых клеток, но также позволяет картировать судьбу и отслеживать родословную этих MG-производных (красных) RPC. Совсем недавно был идентифицирован набор миРНК в RPC и MG культуры Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-репортерных мышей были использованы для скрининга и тестирования влияния этих микроРНК на способность перепрограммирования и эффективность27. Было обнаружено, что один из кандидатов, RPC-miRNA miR-25, способен перепрограммировать культивируемый MG в клетки, экспрессирующие Ascl1 (Ascl1-Tomato+). Эти перепрограммированные клетки со временем принимают нейронные особенности, включая морфологию нейронов (малые соматы и короткие или длинные тонкие процессы), экспрессию нейронных транскриптов, измеренных с помощью scRNA-Seq, а также экспрессию нейронных белков, подтвержденных с помощью иммунофлуоресцентной маркировки27.
Здесь протокол подробно описывает, как выращивать и трансфектировать MG от мышей P12, адаптированных из предыдущей работы 21,24,27. Для этого протокола выбрана вышеупомянутая miRNA miR-25, миРНК, высоко экспрессируемая в RPC, с низкими уровнями экспрессии в MG или нейронах сетчатки. Для сверхэкспрессии miR-25 используется мышиная имитация miR-25, т.е. искусственные молекулы миРНК. В качестве контроля выбраны имитации миРНК из Caenorhabditis elegans, которые не имеют функции в клетках млекопитающих. Визуализация преобразования MG в RPC осуществлялась с помощью RPC-репортерной мыши (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), мыши со смешанным фоном (штаммы C57BL/6, S129 и ICR). Эта культура, однако, может быть выполнена со всеми штаммами мышей, включая штаммы дикого типа. В последние несколько лет оригинальный протокол был изменен для сокращения продолжительности фазы роста и общего периода культивирования и обеспечения более надежного статуса клеток глии и минимизации степени клеточной дегенерации, которая происходит в длительные периоды культивирования. Обычное временное окно трансфекции также было продлено с 3 ч до 2 дней. Как упоминалось ранее, хотя текущий протокол описывает культуры MG как инструмент для исследований регенерации, метод не только полезен для тестирования факторов перепрограммирования, но также может быть адаптирован для других применений, включая исследования о миграционном или пролиферативном поведении MG, парадигмах, связанных с повреждением травм / клеток, и / или идентификации основных механизмов и путей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

Мюллеровская глия (MG) является преобладающей глией в нервной сетчатке и может функционировать как регенеративный источник для нейронов сетчатки. У низших позвоночных, таких как рыбы, регенерация, вызванная MG, происходит естественным образом; у млекопитающих, однако, требуется стимуляция определенными факторами или генетические/эпигенетические манипуляции. Поскольку МГ составляют только 5% популяции клеток сетчатки, существует необходимость в модельных системах, которые позволяют изучать исключительно эту клеточную популяцию. Одной из этих модельных систем являются первичные культуры MG, которые воспроизводимы и могут использоваться для различных применений, включая скрининг и идентификацию молекул / факторов, тестирование соединений или факторов, мониторинг клеток и / или функциональные тесты. Эта модель используется для изучения потенциала мышиного МГ для преобразования в нейроны сетчатки после добавления или ингибирования микроРНК (миРНК) путем трансфекции искусственных микроРНК или их ингибиторов. Использование MG-специфических репортерных мышей в сочетании с иммунофлуоресцентной маркировкой и секвенированием одноклеточной РНК (scRNA-seq) подтвердило, что 80%-90% клеток, обнаруженных в этих культурах, являются MG. Используя эту модель, было обнаружено, что миРНК могут перепрограммировать MG в клетки-предшественники сетчатки (RPC), которые впоследствии дифференцируются в нейроноподобные клетки. Преимущества этого метода заключаются в том, что кандидаты на миРНК могут быть проверены на их эффективность и результат перед их использованием в приложениях in vivo .

Этот протокол описывает, как вырастить MG из сетчатки мыши P12 и как перепрограммировать эти клетки с miR-25 в нейроны сетчатки с помощью мыши-репортера Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC. Этот метод был использован в предыдущей работе, в которой подробно сообщалось о других подходящих мик...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Первичные культуры глии Мюллера, полученные из сетчатки мышей, представляют собой очень прочный и надежный инструмент для изучения глиального превращения в клетки-предшественники сетчатки после лечения микроРНК. Отдельные молекулы или комбинации могут быть протестированы перед их последующим применением подходов in vivo .

Первичные клеточные культуры для изучения потенциала регенерации мышиной глии Мюллера после лечения микроРНК

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Этот протокол позволяет изучить потенциал и способность глии Мюллера превращаться в клетки-предшественники сетчатки после лечения специфическими факторами, такими как микроРНК. Преимущество этого метода заключается в том, что кандидаты на микроРНК могут быть проверены на их эффективность и результат перед их использованием в приложениях in vivo. Помочь в демонстрации процедуры будет Seoyoung Kang, аспирант из лаборатории Стефани Воль.Во-первых, ненадолго окуните удаленное глазное яблоко в трубку с этанолом, чтобы избежать переноса бактерий от животного. Затем ненадолго промойте глазное яблоко в 10-сантиметровой чашке Петри, прежде чем поместить его в 24-луночную тарелку на льду. После того, как глазные яблоки удалены и очищены, поместите один глаз в тарелку для рассечения, помещенную под рассекающий микроскоп с источником света.Теперь зафиксируйте одно глазное яблоко, захватив зрительный нерв и окружающую соединительную ткань вокруг склеры с помощью 5 тонких щипцов Дюмона и осторожно прижмите его к тарелке для рассечения. Затем сделайте отверстие в центре роговицы, используя иглу 30 калибра, чтобы обеспечить более легкий доступ для венозных ножниц. Затем рассекните роговицу вокруг цилиарного тела с помощью венозных ножниц и аккуратно удалите роговицу, хрусталик, радужную оболочку и стекловидное тело с помощью 5 тонких щипцов Дюмона.Позже рассекните склеру венозными ножницами до тех пор, пока зрительный нерв не будет достигнут, и осторожно извлеките сетчатку с помощью тонких щипцов Дюмона 5. Теперь используйте второй Dumont 5 тонких щипцов, чтобы надавить на сетчатку и полностью удалить стекловидное тело. Перенос сетчатки разрезается примерно на 2,5 сантиметра кончика стерильной переносной пипетки для увеличения диаметра.Теперь, используя этот наконечник, подберите целые сетчатки, не повреждая ткани, и перенесите сетчатку в новую стерильную чашку Петри с холодным HBSS и качайте чашку. Затем, используя новую стерильную переносную пипетку, осторожно протолкните сетчатку, чтобы смыть пигментные эпителиальные клетки сетчатки. Немедленно поместите изолированную сетчатку в новый чистый колодец из 24 луночной пластины, заполненной одним миллилитром HBSS, сохраняя при этом 24-луночную пластину на льду во время рассечения.Готовят смесь диссоциации Papain DNase I, как описано в рукописи. Теперь с увеличенным наконечником переносной пипетки поднимите сетчатку. Подождите, пока сетчатка осядет в нижней части кончика и выпустите сетчатку без чрезмерного HBSS в трубку, содержащую смесь Папаин Днказы I.Далее поместите трубку на нутатор в инкубаторе и инкубируйте в течение 10 минут при 37 градусах Цельсия и с 5% углекислым газом. Затем диссоциируйте клетки, тщательно пипетируя вверх и вниз одной миллилитровой пипеткой. После диссоциации клеток добавьте 275 микролитров ингибитора овомукуоидной протеазы из набора диссоциации папаина, чтобы нейтрализовать папаин и мягко перемешать, пипетируя вверх и вниз.Поместите трубки в центрифугу и вращайтесь при четырех градусах Цельсия в течение восьми минут с относительной центробежной силой 300. Добавьте эпидермальный фактор роста к расчетному объему питательной среды, предварительно нагретой при 37 градусах Цельсия. Осторожно извлеките трубки из центрифуги.Не касаясь гранулы в нижней части трубки, удалите супернатант осторожно и полностью. Теперь повторно суспендируют клеточную гранулу с 500 микролитрами эпидермального фактора роста, дополненного питательной средой. Затем переместите клеточную суспензию в одну лунку из меченой 12-луночной пластины.Промыть трубку еще 500 микролитрами эпидермальной добавляемой фактором роста питательной среды и добавить ее в лунку. Осторожно покачайте плиту колодца, затем поместите пластину в инкубатор при температуре 37 градусов по Цельсию с углекислым газом. Начните с проверки на слияние клеток от 90% до 100%.Затем удалите среду и добавьте один миллилитр холодного HBSS для мытья лунки. Аккуратно покачайте пластину и удалите HBSS без каких-либо следов. Позже добавляют 500 микролитров предварительно подогретого трипсина, содержащего раствор, чтобы отделить клетки от лунки.Качать аккуратно и насиживать в течение двух минут в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия. После перемещения пластины из инкубатора в шкаф биобезопасности аспирируйте раствор, содержащий трипсин, при наклоне. Рассейте его осторожно и медленно по лунке несколько раз, пока клетки не отделятся полностью.Затем переложите эту клеточную суспензию в стерильную трубку размером 1,5 миллилитра и поместите трубки в центрифугу. Вращайте в 300 раз г в течение восьми минут при четырех градусах Цельсия и верните трубки обратно в шкаф биобезопасности. Удалите супернатант, не прикасаясь к грануле.Теперь осторожно повторно суспендируйте гранулу клетки, добавив 600 микролитров предварительно нагретой питательной среды и пипеткой вверх и вниз примерно 30-40 раз. Наконец, засевают 100 микролитров полученной клеточной суспензии в центр шести покрытых покрытием слипов пластины 24 скважины. Поместите пластину на инкубатор и дайте клеткам осесть для последующей трансфекции с использованием микро-Имитирования РНК.На рисунке показаны контрольные условия через пять дней после трансфекции с несколькими положительными клетками Ascl1-Tomato. Однако после лечения miR-25 обнаруживается гораздо больше положительных клеток Ascl1-Tomato. Количественная оценка показала четырехкратное увеличение числа ascl1-томатных положительных клеток в обработанных miR-25 скважинах по сравнению с контрольной группой.Самое главное, что подавляющее большинство положительных клеток Ascl1-Tomato, обнаруженных в обработанных riR-25 колодцах, приняли нейронную морфологию. Особенности этой морфологии нейронов включали уменьшение размера клеточной сомы, развитие тонких процессов и образование крошечных сетей. Количественная оценка показала, что около 70% всех положительных клеток Ascl1-Tomato имели нейронные особенности.Иммунофлуоресцентная маркировка показывает, что положительные клетки Ascl1-Tomato с нейрональной морфологией экспрессируют нейронные маркеры OTX2 и MAP2, подтверждая нейронную идентичность. Количественная оценка этих клеток показала, что после сверхэкспрессии miR-25 присутствует около 40 положительных нейронов Ascl1-Tomato на поле по сравнению с пятью нейронными клетками на поле в контрольной группе. Идентифицированные нейрональные клетки составляют около 70% от общей популяции ascl1-Tomato положительных клеток образцов, обработанных miR-25.Кроме того, количественная оценка абсолютного числа совместно экспрессирующих нейронов OTX2 и MAP2 показала, что после обработки miR-25 было обнаружено около 60 нейронов на поле по сравнению с 10 нейронами на поле в контрольной группе. Крайне важно работать в чистой и дезинфицированной среде с чистыми и стерильными инструментами и работать осторожно, избегая любого сурового обращения. Последующие приложения могут быть, например, количественной оценкой белка, анализом ДНК или РНК или электрофизиологическими исследованиями.Этот метод помог нам исследовать первоначальные вопросы о ядерном перепрограммировании, которое относится к области регенеративной медицины. И существует большой спектр факторов и условий, которые можно проверить, чтобы исследовать новые вопросы.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Дифференциация человеческих нервных стволовых клеток линии на трехмерной культур, анализ микроРНК и предполагаемые гены-мишени

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Использование Титон системы для изучения молекулярных механизмов регенерации данио рерио

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Гепатоцитов конкретных абляция в данио рерио по изучению желчных приводом печени Регенерация

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Оптимизация раны царапинам анализе для обнаружения изменений в мышиной мезенхимальных стромальных клеток миграции после повреждения по растворимый экстракт сигаретного дыма

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Разработка Этанол-индуцированной фиброзных модели печени в данио рерио для изучения прогениторных клеток-гепатоцитов опосредуется Регенерация

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Эффективный метод получения Дедифференцированные жировых клеток

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Человек Первичная трофобласта клеточной культуры модель для изучения защитных эффектов мелатонина Против Гипоксия / реоксигенация-индуцированное Срыв

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Использование первичных культур нейросферы для изучения первичных ресничек

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Выделение и характеристика основных крыса клапан интерстициальных клеток: Новая модель для изучения кальцификации клапана аорты

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Методы для изучения регенерации в Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...