Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Författarna tackar Dr. Ann Beaton och alla labbmedlemmar för deras input på manuskriptet. Särskilt tack till Drs. Tom Reh, Julia Pollak och Russ Taylor för att ha introducerat MG primära kulturer som ett screeningverktyg för SGS under postdoktoral utbildning vid University of Washington i Seattle. Studien finansierades av Empire Innovation Program (EIP) Grant till S.G.W. och startfonder från SUNY Optometry till S.G.W., samt R01EY032532-utmärkelsen från National Eye Institute (NEI) till S.G.W.

Försök med djurpersoner har godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid SUNY College of Optometry.
OBS: Detta kulturprotokoll består av tre faser: tillväxt, transfektion och omvandlingsfas. En sammanfattning av det övergripande protokollet med tidslinjen ges i figur 1.
1. Beredning av media och alla nödvändiga reagenser
OBS: Alla steg måste utföras i ett A2- el...

Detta protokoll beskriver hur man odlar MG från dissocierade musnäthinnor för omprogrammering av studier med miRNA. Som visats och bekräftats i en mängd tidigare studier är de allra flesta (80% -90%) av cellerna som finns i dessa kulturer MG 20,23,24. Denna metod är en mycket robust och pålitlig teknik och resultaten kan enkelt reproduceras om protokollet följs korrekt21,27<sup class="...

Müller glia (MG) är den dominerande glia i neural näthinnan. De har liknande funktioner jämfört med andra glia i andra delar av centrala nervsystemet, såsom att upprätthålla vatten- och jonhomeostas, närande neuroner och skydda vävnaden. MG har en annan fascinerande egenskap: även om de är mogna glia, uttrycker de fortfarande många gener uttryckta i retinala stamceller (RPC) under sen utveckling 1,2. Denna likhet antas vara orsaken till den naturligt förekommande MG-baserade neuronala regenereringen i fiskhinnan efter näthinneskada 3,4. Under denna process, MG återinträda i cellcykeln och de-differentiera till RPC som sedan differentierar till alla sex typer av retinala nervceller. Även om detta fenomen förekommer naturligt hos fisk, omvandlas däggdjurs MG inte till nervceller 5,6. De kan dock omprogrammeras. En mängd olika faktorer har visat sig omprogrammera MG till RPC/ nervceller; bland dessa faktorer är den grundläggande helix-loop-helix (bHLH) transkriptionsfaktorn achaete-scute homolog 1 (Ascl1) som är involverad i fiskregenerering 7,8. Hos möss uttrycks Ascl1 endast i RPC under retinogenes men saknas i mogna MG- eller retinalneuroner9.
Omprogrammering av celler direkt in vivo är inte bara metodologiskt utmanande utan kräver också godkännande från en institutionell djurvårds- och användningskommitté. För att få godkännande krävs preliminära uppgifter om den eller de faktorer som används eller ändras, koncentrationer, effekter utanför målet, underliggande mekanismer, toxicitet och effektivitet. Cellodlingssystem möjliggör testning för dessa kriterier före användning i in vivo-modeller. Eftersom MG endast utgör cirka 5 % av hela näthinnecellpopulationen10, tillåter MG-kulturer dessutom studier av deras funktion11 samt deras beteende, inklusive migration12,13, proliferation14, stressreaktion på skada/skada15,16, deras interaktion med andra celltyper såsom microglia17 eller retinala ganglionceller (RGCs)18, eller deras neurogena potential 19,20,21. Många forskare använder odödliga cellinjer för sina studier eftersom de har en obegränsad proliferativ potential och lätt kan underhållas och transinfekteras. Primära celler är dock att föredra för biologiskt relevanta analyser än odödliga celler eftersom de har sanna cellegenskaper (gen- och proteinuttryck) och, ännu viktigare, de representerar ett visst utvecklingsstadium och har därför en "ålder". Åldern hos ett djur (och följaktligen hos cellerna som erhållits från ett djur) är en särskilt avgörande faktor vid cellulär omprogrammering eftersom cell plasticitet minskar med framskridet utvecklingsstadium22.
Detta protokoll beskriver i detalj hur man omprogrammerar primär MG med miRNA som en aktuell in vitro-metod för att studera regenerering. Denna primära MG-odlingsmodell etablerades 2012 för att utvärdera cellproliferationsegenskaper hos MG hos P53 knock-out-möss (trp53-/- möss)23. Det visades att odlad MG behåller sina glialegenskaper (dvs uttryck av S100β-, Pax6- och Sox2-proteiner utvärderade via immunofluorescerande märkning) och att de liknar in vivo MG (mikroarray av FACS-renad MG)23. Kort därefter validerades och bekräftades glial mRNA och proteinuttryck i ett annat tillvägagångssätt med hjälp av virala vektorer20. Några år senare bekräftades att de allra flesta celler som finns i dessa kulturer är MG med hjälp av den MG-specifika Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reportermus24. Dessutom visade kvantifiering av uppsättningen miRNA i både FACS-renad MG och odlad primär MG att nivåerna av MG miRNA (mGLiomiRs) inte varierar mycket i odlad MG under tillväxtfasen. Långsträckta odlingsperioder orsakar emellertid förändringar i miRNA-nivåer och följaktligen i mRNA-nivåer och proteinuttryck eftersom miRNA är translationella regulatorer25.
I 2013, denna MG kulturmodell användes för att testa en mängd olika transkriptionsfaktorer med avseende på deras förmåga att omprogrammera MG till retinala nervceller20. Ascl1 befanns vara en mycket robust och pålitlig omprogrammeringsfaktor. Överuttryck av Ascl1 via virala vektorer inducerade morfologiska förändringar, uttryck av neuronala markörer och förvärv av neuronala elektrofysiologiska egenskaper. Ännu viktigare är att de insikter och resultat som erhölls från dessa första in vitro-experiment framgångsrikt överfördes till in vivo-applikationer 22,26, vilket visar att primära MG-kulturer representerar ett solidt och pålitligt verktyg för initiala faktorscreeningar och utvärdering av glialfunktioner före in vivo-implementering.
För några år sedan visade det sig att det hjärnberikade miRNA miR-124, som också uttrycks starkt i näthinneneuroner, kan inducera Ascl1-uttryck i odlad MG21. Ascl1-uttryck i levande celler visualiserades via en Ascl1-reportermus (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). En reportermus är en genetiskt konstruerad mus som har en reportergen införd i sitt DNA. Denna reportergen kodar för ett reporterprotein, som i denna studie är tdTomato, ett rött fluorescerande protein. Detta reporterprotein rapporterar uttrycket av en gen av intresse, i detta fall Ascl1. Med andra ord blir celler som uttrycker Ascl1 röda. Eftersom Ascl1 endast uttrycks i RPC9 tillåter denna Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-mus spårning av MG-omvandling till Ascl1 som uttrycker RPC, vilket innebär att konverterande celler kommer att uttrycka rött fluorescerande tdTomato-reporterprotein. Detta är irreversibel märkning eftersom DNA från dessa celler förändras. Följaktligen kommer all efterföljande neuronal differentiering att visualiseras eftersom tdTomato-etiketten förblir i differentierande celler. Om Ascl1 som uttrycker MG-härledda RPC (med tdTomato-etikett) differentieras till neuroner, kommer dessa neuroner fortfarande att ha sin röda etikett. Denna mus tillåter därför inte bara märkning av MG-härledda RPC för levande cellavbildning utan möjliggör också ödeskartläggning och spårning av dessa MG-härledda (röda) RPC. På senare tid identifierades uppsättningen miRNA i RPC och MG-kulturer av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermöss användes för att screena och testa effekten av dessa miRNA på omprogrammeringskapacitet och effektivitet27. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, befanns kunna omprogrammera odlad MG till Ascl1-uttryckande (Ascl1-Tomat+) celler. Dessa omprogrammerade celler antar neuronala egenskaper över tid, inklusive neuronal morfologi (liten somata och antingen korta eller långa fina processer), uttryck av neuronala transkript mätt via scRNA-Seq, samt uttryck av neuronala proteiner validerade via immunofluorescerande märkning27.
Här beskriver protokollet hur man odlar och transfekterar MG från P12-möss anpassat från det tidigare arbetet 21,24,27. Valt för detta protokoll är ovannämnda miRNA miR-25, ett miRNA som uttrycks starkt i RPC, med låga uttrycksnivåer i MG- eller retinalneuroner. För att överuttrycka miR-25 härmar murin miR-25, dvs artificiella miRNA-molekyler används. Som kontroll väljs miRNA av ett miRNA från Caenorhabditis elegans, som inte har någon funktion i däggdjursceller. Visualisering av omvandlingen av MG till RPC utfördes via RPC-reportermusen (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl), en mus med blandad bakgrund (C57BL / 6, S129 och ICR-stammar). Denna kultur kan dock utföras med alla musstammar, inklusive vildtypsstammar. Under de senaste åren har det ursprungliga protokollet modifierats för att minska tillväxtfasens varaktighet och den totala odlingsperioden och säkerställa en mer robust gliacellstatus och minimera graden av cellulär degenerering, som inträffar under långa odlingsperioder. Det vanliga transfektionstidsfönstret förlängdes också från 3 h till 2 dagar. Som nämnts tidigare, även om det nuvarande protokollet beskriver MG-kulturer som ett verktyg för regenereringsstudier, är metoden inte bara användbar för att testa omprogrammeringsfaktorer, utan kan också anpassas för andra applikationer, inklusive studier om MG-migrerande eller proliferativt beteende, skade- / cellskadarelaterade paradigmer och / eller identifiering av underliggande mekanismer och vägar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

Müller glia (MG) är den dominerande glia i neurala näthinnan och kan fungera som en regenerativ källa för retinala nervceller. Hos lägre ryggradsdjur som fisk sker MG-driven regenerering naturligt; hos däggdjur krävs dock stimulering med vissa faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulation. Eftersom MG endast utgör 5% av retinalcellpopulationen finns det ett behov av modellsystem som tillåter studier av denna cellpopulation uteslutande. Ett av dessa modellsystem är primära MG-kulturer som är reproducerbara och kan användas för en mängd olika applikationer, inklusive molekyl/ faktorscreening och identifiering, testning av föreningar eller faktorer, cellövervakning och / eller funktionella tester. Denna modell används för att studera potentialen hos murin MG att omvandlas till retinala nervceller efter tillskott eller hämning av mikroRNA (miRNA) via transfektion av artificiella miRNA eller deras hämmare. Användningen av MG-specifika reportermöss i kombination med immunofluorescerande märkning och encells RNA-sekvensering (scRNA-seq) bekräftade att 80%-90% av cellerna som finns i dessa kulturer är MG. Med hjälp av denna modell upptäcktes att miRNA kan omprogrammera MG till retinala stamceller (RPC), som därefter differentieras till neuronalliknande celler. Fördelarna med denna teknik är att miRNA-kandidater kan testas för deras effektivitet och resultat innan de används i in vivo-applikationer .

Detta protokoll beskriver hur man odlar MG från P12 mus näthinnor och hur man omprogrammerar dessa celler med miR-25 till retinala nervceller med hjälp av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC reportermus. Denna metod användes i tidigare arbete med att i detalj rapportera andra lämpliga miRNA (miMIK eller hämmare, som enstaka molekyler eller i kombination) för att omprogrammera MG till RPC som sedan antar neuronala cellegenskaper27. Denna metod har modifierats ...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Müller glia primära kulturer erhållna från mus näthinnor representerar ett mycket robust och pålitligt verktyg för att studera glialomvandlingen till retinala stamceller efter mikroRNA-behandling. Enstaka molekyler eller kombinationer kan testas innan de senare tillämpas in vivo-metoder .

Primära cellkulturer för att studera regenereringspotentialen hos Murine Müller Glia efter mikroRNA-behandling

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Detta protokoll gör det möjligt att studera potentialen och förmågan hos Muller glia att omvandlas till retinala stamceller efter behandling med specifika faktorer som mikroRNA. Fördelen med denna teknik är att mikroRNA-kandidater kan testas för deras effektivitet och resultat innan de används i in vivo-applikationer. Till hjälp för att demonstrera proceduren kommer att vara Seoyoung Kang, doktorand från Stefanie Wohls laboratorium.Doppa först den borttagna ögongloben kort i ett rör med etanol för att undvika överföring av bakterier från djuret. Tvätta sedan ögongloben kort i petriskålen på 10 centimeter innan du lägger den i 24-brunnsplattan på is. När ögonbollarna har tagits bort och rengjorts, placera ett öga i dissektionsskålen placerad under ett dissekerande mikroskop med en ljuskälla.Fixa nu en ögonglob genom att ta tag i synnerven och den omgivande bindväven runt sclera med Dumont 5 fina pincett och tryck den försiktigt mot dissektionsskålen. Gör sedan ett hål i hornhinnans centrum med en 30 gauge nål för att underlätta åtkomst för den venösa saxen. Dissekera sedan hornhinnan runt ciliärkroppen med venös sax och ta försiktigt bort hornhinnan, linsen, iris och glaskroppen med Dumont 5 fina pincett.Dissekera senare sclera med venös sax tills synnerven är uppnådd och extrahera försiktigt näthinnan med Dumont 5 fina pincett. Använd nu en andra Dumont 5 fina tångar för att trycka mot näthinnan och helt ta bort glaskroppen. Överför näthinnorna skär cirka 2,5 centimeter av spetsen på en steril överföringspipett för att förstora diametern.Använd nu detta tips, plocka upp hela näthinnor utan att skada vävnaden och överför näthinnorna till en ny steril petriskål med kall HBSS och gunga skålen. Därefter, med en ny steril överföringspipett, tryck försiktigt näthinnorna runt för att tvätta bort retinala pigmentepitelceller. Placera omedelbart den isolerade näthinnan i en ny ren brunn på 24-brunnsplattan fylld med en milliliter HBSS medan du håller 24-brunnsplattan på isen under dissektionen.Förbered Papain DNase I dissociationsblandning enligt beskrivningen i manuskriptet. Nu med en förstorad spetsöverföringspipett, plocka upp näthinnorna. Vänta tills näthinnorna sätter sig längst ner på spetsen och släpp näthinnorna utan överdriven HBSS i röret som innehåller Papain DNase I-blandning.Placera sedan röret på en nutator i inkubatorn och inkubera i 10 minuter vid 37 grader Celsius och med 5% koldioxid. Dissociera sedan cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ner med en milliliter pipett. Efter att cellerna har dissocierats, tillsätt 275 mikroliter ovomucoidproteashämmare från Papain-dissociationssatsen för att neutralisera Papain och blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner.Placera rören i en centrifug och snurra vid fyra grader Celsius i åtta minuter vid en relativ centrifugalkraft på 300. Tillsätt epidermal tillväxtfaktor till den beräknade volymen av tillväxtmedium som förvärmts vid 37 grader Celsius. Ta försiktigt bort rören från centrifugen.Utan att röra pelleten i botten av röret, ta bort supernatanten försiktigt och helt. Återsuspendera nu cellpelleten med 500 mikroliter epidermal tillväxtfaktor kompletterat tillväxtmedium. Överför sedan cellsuspensionen till en brunn på den märkta 12-brunnsplattan.Skölj röret med ytterligare 500 mikroliter av det epidermala tillväxtfaktorn kompletterat tillväxtmedium och tillsätt det till brunnen. Gunga brunnsplattan försiktigt och placera sedan plattan i inkubatorn vid 37 grader Celsius med koldioxid. Börja med att kontrollera om det finns 90% till 100% cellsammanflöde.Ta sedan bort mediet och tillsätt en milliliter kallt HBSS för att tvätta brunnen. Gunga försiktigt plattan och ta bort HBSS utan några vänstra spår. Senare tillsätt 500 mikroliter av en förvärmd trypsininnehållande lösning för att lossa cellerna från brunnen.Rocka försiktigt och inkubera i två minuter i 37 grader Celsius inkubator. Efter att ha flyttat plattan från inkubatorn till biosäkerhetsskåpet, aspirera trypsininnehållande lösningen medan du lutar. Sprid det försiktigt och långsamt över brunnen flera gånger tills cellerna lossnar helt.Överför sedan denna cellsuspension till ett sterilt 1,5 ml rör och sätt rören i centrifugen. Snurra på 300 gånger g i åtta minuter vid fyra grader Celsius och ta tillbaka rören i biosäkerhetsskåpet. Ta bort supernatanten utan att röra pelleten.Återsuspendera nu försiktigt cellpelleten genom att tillsätta 600 mikroliter förvärmt tillväxtmedium och pipettera upp och ner cirka 30 till 40 gånger. Slutligen glider frö 100 mikroliter av den erhållna cellsuspensionen i mitten av sex belagda täckglidningar av 24-brunnsplattan. Placera plattan på inkubatorn och låt cellerna sätta sig för efterföljande transfektion med hjälp av mikro-RNA-härmningar.Figuren visar kontrollförhållanden fem dagar efter transfektion med några Ascl1-Tomato-positiva celler närvarande. Efter en miR-25-behandling finns dock många fler Ascl1-Tomato-positiva celler. Kvantifieringen avslöjade en fyrfaldig ökning av antalet Ascl1-Tomato-positiva celler i miR-25-behandlade brunnar jämfört med kontroller.Viktigast av allt, de allra flesta Ascl1-Tomato-positiva cellerna som finns i de riR-25-behandlade brunnarna antog en neuronal morfologi. Funktionerna i denna neuronala morfologi inkluderade minskad cellsomastorlek, utveckling av fina processer och bildandet av små nätverk. Kvantifieringen avslöjade att cirka 70% av alla Ascl1-Tomato-positiva celler hade neuronala egenskaper.Immunofluorescerande märkning visar att Ascl1-Tomato-positiva celler med neuronal morfologi uttrycker de neurala markörerna OTX2 och MAP2, vilket bekräftar neuronal identitet. Kvantifieringen av dessa celler avslöjade att efter miR-25-överuttryck finns cirka 40 Ascl1-Tomato-positiva neuroner per fält jämfört med fem neuronala celler per fält i kontroller. De identifierade neuronala cellerna utgör cirka 70% av den totala Ascl1-Tomato-positiva cellpopulationen i de miR-25-behandlade proverna.Vidare visade kvantifiering av det absoluta antalet OTX2- och MAP2-samuttryckande neuroner att efter miR-25-behandling hittades cirka 60 neuroner per fält jämfört med 10 neuroner per fält i kontroller. Det är absolut nödvändigt att arbeta i en ren och sanerad miljö med rena och sterila verktyg och att arbeta noggrant genom att undvika hård behandling. Nedströms applikationer kan till exempel vara proteinkvantifiering, DNA- eller RNA-analys eller elektrofysiologiska studier.Denna teknik hjälpte oss att utforska initiala frågor om nukleär omprogrammering som tillhör området regenerativ medicin. Och det finns en lång rad faktorer och förutsättningar som kan testas för att utforska nya frågor.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiering av en mänsklig Neural Stem Cell Line den Tredimensionell kulturer, Analys av MicroRNA och Förmodade målgenerna

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Användning av Teton system att studera molekylära mekanismer Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyte specifika Ablation i Zebrafish att studera gallan driven leverregenerering

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Optimering av sår Scratch analys för att upptäcka förändringar i Murine Mesenkymala Stromal Cell Migration Efter Skador av lösliga cigarett rökextrakt

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Utveckling av en etanol-inducerad Fibrotisk Lever modell i Zebrafish att studera stamceller-medierad Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

En effektiv metod för att få avdifferentierade fettceller

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

Human Primary trofoblasten Cell Culture modell för att studera de skyddande effekterna av Melatonin mot hypoxi / ny syresättning-inducerad Störningar

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

Använda Primära neurosfärkulturer att studera Primary Cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolering och karakterisering av primära råtta ventil interstitiella celler: en ny modell att studera aortaklaffen förkalkning

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Metoder för studier av förnyelse i Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...