Name: primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Yazarlar, Dr. Ann Beaton'a ve tüm laboratuvar üyelerine makaleye katkıları için teşekkür eder. Seattle'daki Washington Üniversitesi'nde doktora sonrası eğitim sırasında MG birincil kültürlerini S.G.W.'ye bir tarama aracı olarak tanıttıkları için Dr. Tom Reh, Julia Pollak ve Russ Taylor'a özel teşekkürler. Çalışma, S.G.W.'ye Empire İnovasyon Programı (EIP) Hibesi ve SUNY Optometri'den S.G.W.'ye başlangıç fonlarının yanı sıra Ulusal Göz Enstitüsü'nden (NEI) S.G.W.'ye R01EY032532 ödülü ile finanse edildi.

Hayvan denekleri içeren prosedürler, SUNY College of Optometry'deki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Bu kültür protokolü üç aşamadan oluşur: büyüme, transfeksiyon ve dönüşüm aşaması. Zaman çizelgesi ile genel protokolün bir özeti Şekil 1'de verilmiştir.
1. Ortamın ve gerekli tüm reaktiflerin hazırlanması
NOT: Tüm ...

Bu protokol, miRNA'ları kullanarak yeniden programlama çalışmaları için ayrışmış fare retinalarından MG'nin nasıl yetiştirileceğini açıklar. Önceki çeşitli çalışmalarda gösterildiği ve doğrulandığı gibi, bu kültürlerde bulunan hücrelerin büyük çoğunluğu (% 80-90) MG 20,23,24'tür. Bu yöntem çok sağlam ve güvenilir bir tekniktir ve protokol doğru takip edilirse sonuçlar kolayca çoğaltı...

Müller glia (MG), nöral retinadaki baskın glialardır. Merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerindeki diğer glia'lara kıyasla, su ve iyon homeostazını korumak, nöronları beslemek ve dokuyu korumak gibi benzer işlevlere sahiptirler. MG'nin başka bir büyüleyici özelliği daha vardır: olgun glia olmalarına rağmen, geç gelişim sırasında retinal progenitör hücrelerde (RPC'ler) eksprese edilen birçok geni hala eksprese ederler 1,2. Bu benzerliğin, retina hasarından sonra balık retinasında doğal olarak oluşan MG bazlı nöronal rejenerasyonun nedeni olduğu varsayılmaktadır 3,4. Bu işlem sırasında, MG hücre döngüsüne tekrar girer ve daha sonra altı tip retinal nöronun hepsine farklılaşan RPC'lere farklılaşır. Bu fenomen balıklarda doğal olarak meydana gelmesine rağmen, memeli MG nöronlara dönüşmez 5,6. Bununla birlikte, yeniden programlanabilirler. MG'yi RPC'lere / nöronlara yeniden programlayan çeşitli faktörler gösterilmiştir; Bu faktörler arasında balık rejenerasyonunda rol oynayan temel sarmal-döngü-sarmal (bHLH) transkripsiyon faktörü achaete-scute homolog 1 (Ascl1) 7,8'dir. Farelerde, Ascl1 sadece retinogenez sırasında RPC'lerde eksprese edilir, ancak olgun MG veya retinal nöronlardayoktur 9.
Hücrelerin doğrudan in vivo olarak yeniden programlanması sadece metodolojik olarak zor değil, aynı zamanda kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanım komitesinin onayını gerektirir. Onay almak için, kullanılan veya değiştirilen faktör(ler), konsantrasyonlar, hedef dışı etkiler, altta yatan mekanizmalar, toksisite ve verimlilik hakkında ön veriler gereklidir. Hücre kültürü sistemleri, in vivo modellerde kullanılmadan önce bu kriterlerin test edilmesine izin verir. Dahası, MG tüm retinal hücre popülasyonunun sadece% 5'ini oluşturduğundan 10, MG kültürleri fonksiyonlarının 11'inin yanı sıra göç 12,13, proliferasyon 14, yaralanma / hasara stres reaksiyonu15,16, mikroglia 17 veya retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) gibi diğer hücre tipleriyle etkileşimleri de dahil olmak üzere davranışlarının incelenmesine izin verir. veya nörojenik potansiyelleri 19,20,21. Birçok araştırmacı, sınırsız bir proliferatif potansiyele sahip oldukları ve kolayca korunabildikleri ve transfekte edilebildikleri için çalışmaları için ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanır. Bununla birlikte, birincil hücreler, biyolojik olarak ilgili analizler için ölümsüzleştirilmiş hücrelerden daha tercih edilir, çünkü gerçek hücre özelliklerine (gen ve protein ekspresyonu) sahiptirler ve daha da önemlisi, gelişimde belirli bir aşamayı temsil ederler ve bu nedenle bir "yaş" vardır. Bir hayvanın yaşı (ve dolayısıyla bir hayvandan elde edilen hücrelerin), hücresel yeniden programlamada özellikle önemli bir faktördür, çünkü hücre plastisitesi, gelişimin ilerleme aşamasıyla azalır22.
Bu protokol, primer MG'nin miRNA'larla rejenerasyonu incelemek için akım in vitro bir yöntem olarak nasıl yeniden programlanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu MG birincil kültür modeli, P53 nakavt farelerde (trp53-/- fareler)23 MG'nin hücre proliferasyon özelliklerini değerlendirmek için 2012 yılında kurulmuştur. Kültürlenmiş MG'nin glial özelliklerini koruduğu (yani, immünofloresan etiketleme yoluyla değerlendirilen S100β, Pax6 ve Sox2 proteinlerinin ekspresyonu) ve in vivo MG'ye (FACS-saflaştırılmış MG'nin mikrodizisi) benzedikleri gösterilmiştir23. Kısa bir süre sonra, glial mRNA ve protein ekspresyonu, viral vektörler20 kullanılarak farklı bir yaklaşımla doğrulandı ve doğrulandı. Birkaç yıl sonra, MG'ye özgü Rlbp1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl muhabir faresi24 kullanılarak bu kültürlerde bulunan hücrelerin büyük çoğunluğunun MG olduğu doğrulandı. Dahası, hem FACS-saflaştırılmış MG hem de kültürlenmiş primer MG'deki miRNA setinin nicelleştirilmesi, MG miRNA'larının (mGLiomiR'ler) seviyelerinin, büyüme aşamasında kültürlenmiş MG'de çok fazla değişmediğini göstermiştir. Bununla birlikte, uzamış kültür dönemleri, miRNA'lar translasyonel düzenleyiciler olduğu için miRNA seviyelerinde ve dolayısıyla mRNA seviyelerinde ve protein ekspresyonunda değişikliklere neden olur25.
2013 yılında, bu MG kültür modeli, MG'yi retinal nöronlara yeniden programlama yeteneklerine göre çeşitli transkripsiyon faktörlerini test etmek için kullanılmıştır20. Ascl1'in çok sağlam ve güvenilir bir yeniden programlama faktörü olduğu bulunmuştur. Ascl1'in viral vektörler yoluyla aşırı ekspresyonu, morfolojik değişikliklere, nöronal belirteçlerin ekspresyonuna ve nöronal elektrofizyolojik özelliklerin kazanılmasına neden olmuştur. Daha da önemlisi, bu ilk in vitro deneylerden elde edilen içgörüler ve sonuçlar, primer MG kültürlerinin in vivo uygulamadan önce ilk faktör taramaları ve glial özelliklerin değerlendirilmesi için sağlam ve güvenilir bir araç olduğunu gösteren 22,26 in vivo uygulamalara başarıyla aktarılmıştır.
Birkaç yıl önce, retinal nöronlarda da yüksek oranda eksprese edilen beyinle zenginleştirilmiş miRNA miR-124'ün, kültürlü MG21'de Ascl1 ekspresyonunu indükleyebileceği gösterilmiştir. Canlı hücrelerdeki Ascl1 ekspresyonu, bir Ascl1 muhabir faresi (Ascl1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl) aracılığıyla görselleştirildi. Bir muhabir faresi, DNA'sına yerleştirilmiş bir muhabir genine sahip genetik olarak tasarlanmış bir faredir. Bu muhabir geni, bu çalışmada kırmızı bir floresan proteini olan tdTomato'da bulunan bir muhabir proteinini kodlar. Bu muhabir proteini, ilgilenilen bir genin, bu durumda, Ascl1'in ekspresyonunu bildirir. Başka bir deyişle, Ascl1'i eksprese eden hücreler kırmızıya döner. Ascl1 yalnızca RPC9'da ifade edildiğinden, bu Ascl1 CreERT: tdDomatesSTOPfl / fl faresi, MG dönüşümünün RPC'leri ifade eden Ascl1'e dönüştürülmesinin izlenmesine izin verir, yani dönüştürücü hücreler kırmızı floresan tdDomates raporlayıcı proteinini ifade edecektir. Bu, bu hücrelerin DNA'sı değiştirildiği için geri dönüşümsüz bir etiketlemedir. Sonuç olarak, sonraki herhangi bir nöronal farklılaşma görselleştirilecektir, çünkü tdDomates etiketi farklılaşan hücrelerde kalır. MG kaynaklı RPC'leri (tdDomates etiketli) ifade eden Ascl1 nöronlara farklılaşırsa, bu nöronlar hala kırmızı etiketlerine sahip olacaktır. Bu nedenle, bu fare, yalnızca MG türevli RPC'lerin canlı hücre görüntüleme için etiketlenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda bu MG türevi (kırmızı) RPC'lerin kader haritalamasına ve soy izlemesine de izin verir. Daha yakın zamanlarda, RPC'lerdeki miRNA seti tanımlandı ve bu miRNA'ların yeniden programlama kapasitesi ve verimliliği üzerindeki etkisini taramak ve test etmek için Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter farelerin MG kültürleri kullanıldı27. Bir aday, RPC-miRNA miR-25, kültürlenmiş MG'yi Ascl1 eksprese eden (Ascl1-Domates +) hücrelere yeniden programlayabildiği bulundu. Bu yeniden programlanmış hücreler, nöronal morfoloji (küçük somata ve kısa veya uzun ince süreçler), scRNA-Seq ile ölçülen nöronal transkriptlerin ekspresyonu ve immünofloresan etiketleme27 ile doğrulanan nöronal proteinlerin ekspresyonu dahil olmak üzere zamanla nöronal özellikleri benimser.
Burada, protokol, önceki çalışma21,24,27'den uyarlanmış P12 farelerinden MG'nin nasıl yetiştirileceğini ve transfekte edileceğini detaylandırıyor. Bu protokol için seçilen, yukarıda belirtilen miRNA miR-25, RPC'lerde yüksek oranda eksprese edilen, MG veya retinal nöronlarda düşük ekspresyon seviyelerine sahip bir miRNA'dır. MiR-25'i aşırı eksprese etmek için murin miR-25 taklitleri, yani yapay miRNA molekülleri kullanılır. Kontrol olarak, Caenorhabditis elegans'tan bir miRNA'nın taklitleri, memeli hücrelerinde hiçbir işlevi olmayan seçilir. MG'nin RPC'lere dönüşümünün görselleştirilmesi, RPC muhabir faresi (Ascl1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl), karışık arka plana sahip bir fare (C57BL/6, S129 ve ICR suşları) ile gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu kültür, vahşi tip suşlar da dahil olmak üzere tüm fare suşlarıyla gerçekleştirilebilir. Son birkaç yılda, orijinal protokol, büyüme fazı süresini ve genel kültür dönemini azaltmak ve daha sağlam bir glia hücresi durumu sağlamak ve uzun kültür dönemlerinde meydana gelen hücresel dejenerasyon derecesini en aza indirmek için değiştirilmiştir. Düzenli transfeksiyon süresi de 3 saatten 2 güne uzatıldı. Daha önce de belirtildiği gibi, mevcut protokol MG kültürlerini rejenerasyon çalışmaları için bir araç olarak tanımlasa da, yöntem sadece yeniden programlama faktörlerini test etmek için yararlı değildir, aynı zamanda MG göçü veya proliferatif davranışı, yaralanma / hücre hasarı ile ilgili paradigmalar ve / veya altta yatan mekanizmaların ve yolların tanımlanması ile ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere diğer uygulamalar için de uyarlanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Animals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#012882</td>
			<td>Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdTomato-STOPfl/fl mouse&#160; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J</td>
			<td>Jax laboratories</td>
			<td>#007914</td>
			<td>Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Z)-4-Hydroxytamoxifen, &#8805;98% Z isomer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td>reconstituted in ethanol, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100504-782</td>
			<td>2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>711-546-152</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>705-606-147</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human Otx2 Antibody, R&#38;D Systems</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AF1979</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit MAP2 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9942-200UL</td>
			<td>dilution 1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody</td>
			<td>Antibodies-Online</td>
			<td>ABIN334653</td>
			<td>dilution 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72132</td>
			<td>reconstituted in PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-504-044</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Phys Neuronal Medium</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>05790</td>
			<td>used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 &#176;C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.1643 
			231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR 
			IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY 
			dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY 
			-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C10340</td>
			<td>reconstitute following manual, 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl-cAMP</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>73886</td>
			<td>reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT-25950CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MT35010CV</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>51-985-034</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco&#160;TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-605-028</td>
			<td>used as solution containing trypsin, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-025-134</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse protein, natural</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-017-015</td>
			<td>
			frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 
			1643231638-1407032920.163831 
			5521&#38;_gac=1.124727416.164323 
			1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA 
			KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN 
			suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 
			26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>25-030-081</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>CN-001000-01-50</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td>
			<td>Horizon</td>
			<td>C-310564-05-0050</td>
			<td>reconstituted in RNase free water (200 &#181;M), frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-502-048</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>21-103-049</td>
			<td>used for growth medium in section 1.1, store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain Dissociation System</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LK003153</td>
			<td>reconstituted in Earle&#39;s Balanced Salt Solution, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>20-012-043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4538-50MG</td>
			<td>reconstituted in steriled water, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human BDNF Protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>248-BDB-050/CF</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse EGF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2028EG200</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rat GDNF Protein</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>512GF010</td>
			<td>reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab&#39;)2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>712-296-150</td>
			<td>dilution 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>OB100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L3000015</td>
			<td>store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plasticware/supplies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#181;L TIP&#160; sterile filter&#160; Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#181;L TIP sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-408-138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#181;L TIP&#160; sterile filter Pipette Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, &#38; 1000 &#181;L)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231300008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Transfer Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-669-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET&#160; sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-676-10H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder-Free Nitrile Exam Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-1597B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22293232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Filter, Pore Size=0.22 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-761-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 B2 Biosafety cabinet</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>1310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>9011800000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular Zoom Stereo Microscope</td>
			<td>Vision Scientific</td>
			<td>VS-1EZ-IFR07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11272-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>2231000508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors-sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McPherson-Vannas Scissors, 8 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal bead bath</td>
			<td>Lab Armor</td>
			<td>74309-714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers, economy #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501979</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10810-744</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

primary cell cultures to study the regeneration potential of murine m&#252;ller glia after microrna treatment

Müller glia (MG), nöral retinadaki baskın glia'dır ve retinal nöronlar için rejeneratif bir kaynak olarak işlev görebilir. Balıklar gibi alt omurgalılarda, MG güdümlü rejenerasyon doğal olarak gerçekleşir; Bununla birlikte, memelilerde, belirli faktörlerle stimülasyon veya genetik / epigenetik manipülasyon gereklidir. MG, retinal hücre popülasyonunun sadece% 5'ini oluşturduğundan, yalnızca bu hücre popülasyonunun incelenmesine izin veren model sistemlere ihtiyaç vardır. Bu model sistemlerden biri, tekrarlanabilir ve molekül / faktör taraması ve tanımlama, bileşiklerin veya faktörlerin test edilmesi, hücre izleme ve / veya fonksiyonel testler dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilen birincil MG kültürleridir. Bu model, yapay miRNA'ların veya inhibitörlerinin transfeksiyonu yoluyla mikroRNA'ların (miRNA'lar) takviyesi veya inhibisyonundan sonra murin MG'nin retinal nöronlara dönüşme potansiyelini incelemek için kullanılır. MG'ye özgü muhabir farelerin immünofloresan etiketleme ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) ile birlikte kullanılması, bu kültürlerde bulunan hücrelerin% 80-90'ının MG olduğunu doğruladı. Bu modeli kullanarak, miRNA'ların MG'yi retinal progenitör hücrelere (RPC'ler) yeniden programlayabildiği keşfedildi. Bu tekniğin avantajları, miRNA adaylarının in vivo uygulamalarda kullanılmadan önce verimlilikleri ve sonuçları açısından test edilebilmeleridir.

Bu protokol, P12 fare retinalarından MG'nin nasıl yetiştirileceğini ve bu hücrelerin miR-25 ile Ascl1CreERT: tdDomatesSTOPfl / fl RPC muhabir faresini kullanarak retinal nöronlara nasıl yeniden programlanacağını açıklar. Bu yöntem, MG'yi RPC'ye yeniden programlamak için diğer uygun miRNA'ları (mimikler veya inhibitörler, tek moleküller olarak veya kombinasyon halinde) ayrıntılı olarak rapor eden önceki çalışmalarda kullanılmış ve daha sonra nöronal hücre özell...

Watch this Scientific Journal Video about Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine MÃ¼ller Glia after MicroRNA Treatment at JoVE.com

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

Fare retinalarından elde edilen Müller glia primer kültürleri, mikroRNA tedavisinden sonra retinal progenitör hücrelere glial dönüşümü incelemek için çok sağlam ve güvenilir bir araçtır. Tek moleküller veya kombinasyonlar, daha sonra in vivo yaklaşımların uygulanmasından önce test edilebilir.

MikroRNA Tedavisi Sonrası Murine Müller Glia'nın Rejenerasyon Potansiyelini İncelemek için Birincil Hücre Kültürleri

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

Bu protokol, Muller glia'nın mikroRNA'lar gibi spesifik faktörlerle tedaviden sonra retinal progenitör hücrelere dönüşme potansiyelini ve kapasitesini incelemeye izin verir. Bu tekniğin avantajı, mikroRNA adaylarının in vivo uygulamalarda kullanılmadan önce verimlilikleri ve sonuçları açısından test edilebilmeleridir. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak kişi, Stefanie Wohl'un laboratuvarından doktora öğrencisi olan Seoyoung Kang olacak.İlk olarak, çıkarılan göz küresini, bakterilerin hayvandan taşınmasını önlemek için etanollü bir tüpe kısaca batırın. Ardından, göz küresini buz üzerindeki 24 kuyucuklu plakaya yerleştirmeden önce 10 santimetrelik Petri kabında kısaca yıkayın. Göz küreleri çıkarıldıktan ve temizlendikten sonra, bir gözü bir ışık kaynağı ile diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirilmiş diseksiyon kabına yerleştirin.Şimdi optik siniri ve skleranın etrafındaki bağ dokusunu Dumont 5 ince forseps ile tutarak bir göz küresini sabitleyin ve diseksiyon kabına dikkatlice bastırın. Daha sonra, venöz makaslara daha kolay erişim sağlamak için 30 gauge iğne kullanarak kornea merkezinde bir delik açın. Daha sonra, venöz makas kullanarak siliyer cismin etrafındaki korneayı diseke edin ve kornea, lens, iris ve vitreus gövdesini Dumont 5 ince forseps ile dikkatlice çıkarın.Daha sonra optik sinire ulaşılana kadar sklerayı venöz makasla diseke edin ve Dumont 5 ince forseps kullanarak retinayı dikkatlice çıkarın. Şimdi retinaya doğru itmek ve vitreus gövdesini tamamen çıkarmak için ikinci bir Dumont 5 ince forseps kullanın. Retinaların çapı büyütmek için steril bir transfer pipetinin ucunun yaklaşık 2,5 santimetresini keser.Şimdi bu ucu kullanarak, dokuya zarar vermeden tüm retinaları toplayın ve retinaları soğuk HBSS ile yeni bir steril Petri kabına aktarın ve çanağı sallayın. Daha sonra, yeni bir steril transfer pipeti kullanarak, retinal pigment epitel hücrelerini yıkamak için retinaları dikkatlice itin. İzole edilmiş retinayı derhal bir mililitre HBSS ile doldurulmuş 24 kuyu plakasının yeni bir temiz kuyusuna yerleştirin ve diseksiyon sırasında 24 kuyu plakasını buzun üzerinde tutun.Papain DNase I ayrışma karışımını makalede açıklandığı gibi hazırlayın. Şimdi büyütülmüş bir uç transfer pipeti ile retinaları alın. Retinalar ucun dibine yerleşene kadar bekleyin ve retinaları aşırı HBSS olmadan Papain DNaz I karışımını içeren tüpe bırakın.Daha sonra, tüpü inkübatördeki bir nutatöre yerleştirin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksit ile 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, bir mililitrelik pipetle dikkatlice yukarı ve aşağı pipetle çekerek hücreleri ayırın. Hücreler ayrıştıktan sonra, Papain'i nötralize etmek ve yukarı ve aşağı pipetleyerek, hafifçe karıştırmak için Papain ayrışma kitinden 275 mikrolitre ovomukoid proteaz inhibitörü ekleyin.Tüpleri bir santrifüje yerleştirin ve 300'lük göreceli bir merkezkaç kuvvetinde sekiz dakika boyunca dört santigrat derecede döndürün. 37 santigrat derecede önceden ısıtılmış hesaplanan büyüme ortamı hacmine epidermal büyüme faktörü ekleyin. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın.Tüpün altındaki pelete dokunmadan, süpernatantı dikkatlice ve tamamen çıkarın. Şimdi hücre peletini 500 mikrolitre epidermal büyüme faktörü takviyeli büyüme ortamı ile yeniden askıya alın. Ardından, hücre süspansiyonunu etiketli 12 kuyucuk plakasının bir kuyucuğuna aktarın.Tüpü, 500 mikrolitre epidermal büyüme faktörü takviyeli büyüme ortamı ile durulayın ve kuyuya ekleyin. Kuyu plakasını dikkatlice sallayın, ardından plakayı karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirin. %90 ila %100 hücre akıcılığını kontrol ederek başlayın.Ardından, ortamı çıkarın ve kuyuyu yıkamak için bir mililitre soğuk HBSS ekleyin. Plakayı yavaşça sallayın ve HBSS'yi iz bırakmadan çıkarın. Daha sonra, hücreleri kuyudan ayırmak için önceden ısıtılmış tripsin içeren bir çözeltiden 500 mikrolitre ekleyin.Yavaşça sallayın ve 37 santigrat derece inkübatörde iki dakika kuluçkaya yatırın. Plakayı inkübatörden biyo güvenlik kabinine taşıdıktan sonra, eğerken tripsin içeren çözeltiyi aspire edin. Hücreler tamamen ayrılana kadar dikkatlice ve yavaşça kuyunun üzerine birkaç kez dağıtın.Daha sonra, bu hücre süspansiyonunu steril bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve tüpleri santrifüje koyun. Dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 300 kez g'de döndürün ve tüpleri biyo güvenlik kabinine geri getirin. Pelet dokunmadan süpernatantı çıkarın.Şimdi 600 mikrolitre önceden ısıtılmış büyüme ortamı ekleyerek ve yaklaşık 30 ila 40 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücre peletini dikkatlice askıya alın. Son olarak, tohum 100 mikrolitre elde edilen hücre süspansiyonunun ortasındaki altı kaplamalı kapak 24 kuyu plakasının kapağıdır. Plakayı inkübatöre yerleştirin ve mikro RNA taklitlerini kullanarak hücrelerin sonraki transfeksiyona yerleşmesine izin verin.Şekil, transfeksiyondan beş gün sonra birkaç Ascl1-Domates pozitif hücresi bulunan kontrol koşullarını göstermektedir. Bununla birlikte, bir miR-25 tedavisinden sonra, daha birçok Ascl1-Domates pozitif hücresi bulunur. Niceliklendirme, miR-25 ile tedavi edilen kuyulardaki Ascl1-Domates pozitif hücrelerinin sayısında, kontrollere kıyasla dört kat artış olduğunu ortaya koydu.En önemlisi, riR-25 ile tedavi edilen kuyularda bulunan Ascl1-Domates pozitif hücrelerinin büyük çoğunluğu nöronal bir morfoloji benimsemiştir. Bu nöronal morfolojinin özellikleri arasında azalmış hücre soma boyutu, ince süreçlerin gelişimi ve küçük ağların oluşumu vardı. Niceliklendirme, tüm Ascl1-Domates pozitif hücrelerin yaklaşık% 70'inin nöronal özelliklere sahip olduğunu ortaya koydu.İmmünofloresan etiketleme, nöronal morfolojiye sahip Ascl1-Domates pozitif hücrelerin, nöronal kimliği doğrulayan nöral belirteçler OTX2 ve MAP2'yi eksprese ettiğini göstermektedir. Bu hücrelerin nicelleştirilmesi, miR-25 aşırı ekspresyonundan sonra, kontrollerde alan başına beş nöronal hücreye kıyasla, alan başına yaklaşık 40 Ascl1-Domates pozitif nöronun mevcut olduğunu ortaya koymuştur. Tanımlanan nöronal hücreler, miR-25 ile tedavi edilen örneklerin toplam Ascl1-Domates pozitif hücre popülasyonunun yaklaşık% 70'ini oluşturur.Ayrıca, OTX2 ve MAP2 birlikte eksprese eden nöronların mutlak sayısının nicelleştirilmesi, miR-25 tedavisinden sonra, kontrollerde alan başına 10 nörona kıyasla, alan başına yaklaşık 60 nöron bulunduğunu göstermiştir. Temiz ve steril aletlerle temiz ve sterilize edilmiş bir ortamda çalışmak ve her türlü sert muameleden kaçınarak dikkatli çalışmak zorunludur. Aşağı akış uygulamaları örneğin, protein miktarı, DNA veya RNA analizi veya elektrofizyolojik çalışmalar olabilir.Bu teknik, rejeneratif tıp alanına ait nükleer yeniden programlama ile ilgili ilk soruları araştırmamıza yardımcı oldu. Ve yeni soruları keşfetmek için test edilebilecek çok çeşitli faktörler ve koşullar var.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Gelişim Biyolojisi

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Optimization of the Wound Scratch Assay to Detect Changes in Murine Mesenchymal Stromal Cell Migration After Damage by Soluble Cigarette Smoke Extract

Yara Scratch Testi optimizasyonu Çözünür Sigara Duman Özü ile Hasar sonrası Fare Mezenkimal Stromal Hücre Göç Değişiklik Algılama

Cell migration is vital to many physiological and pathological processes including tissue development, repair, and regeneration, cancer metastasis, and ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

An Efficient Method to Obtain Dedifferentiated Fat Cells

Etkin Bir Yöntem Dediferansiye Yağ Hücreleri Elde

Tissue engineering and cell therapy hold great promise clinically. In this regard, multipotent cells, such as mesenchymal stem cells (MSCs), may be used ...

Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption

İnsan İlköğretim Trofoblast Melatonin Karşı Hipoksi Koruyucu Etkilerinin Eğitim için Hücre Kültürü Modeli / reoksijenasyon kaynaklı bozulması

This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density ...

Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

İlköğretim Cilia Eğitim için birincil Neurosphere Kültür Kullanımının

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Birincil fare malzemelerin yalıtım ve Vana interstisyel hücreleri: Aort Kapak kalsifikasyon eğitim için yeni bir Model

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...