Name: genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow
Uploaded: 2022-04-01T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Vi tackar alla tidigare och nuvarande medlemmar i Nobile och Hernday laboratorier för feedback på manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) tilldelningsnummer R35GM124594 och av Kamangar-familjen i form av en begåvad stol till C.J.N. Detta arbete stöddes också av NIH National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) tilldelningsnummer R15AI137975 till A.D.H.C.L.E. stöddes av NIH National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) stipendienummer F31DE028488. Innehållet är författarnas eget ansvar och representerar inte finansiärernas åsikter. Finansiärerna hade ingen roll i utformningen av studien; vid insamling, analys eller tolkning av data, i skrivandet av manuskriptet eller i beslutet att offentliggöra resultaten.

1. Epitopmärkning av C. albicans stammar
<ol><li>Ladda upp genen av intresse, tillsammans med dess 1 kb uppströms och nedströms flankerande sekvenser, från Candida Genome Database till primerdesignverktyget (se materialförteckningen). Designa ett guide-RNA (gRNA) genom att markera 50 bp uppströms och nedströms från stoppkodonet och klicka på gRNA-urvalsverktyget till höger. Välj Designa och analysera guider. Använd genomet...

<ol>
	<li>Gulati, M., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms:+development,+regulation,+and+molecular+mechanisms.">Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms.</a> Microbes and Infection. 18 (5), 310-321 (2016).</li><li>Lohse, M. B., Gulati, M., Johnson, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+regulation+of+single-and+multi-species+Candida+albicans+biofilms.">Development and regulation of single-and multi-species Candida albicans biofilms.</a> Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 19-31 (2018).</li><li>Nobile, C. J., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+albicans+biofilms+and+human+disease.">Candida albicans biofilms and human disease.</a> Annual Review of Microbiology. 69 (1), 71-92 (2015).</li><li>Nobile, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recently+evolved+transcriptional+network+controls+biofilm+development+in+Candida+albicans.">A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans.</a> Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).</li><li>Iracane, E., Vega-Est&#233;vez, S., Buscaino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+and+off:+epigenetic+regulation+of+C.+albicans+morphological+switches.">On and off: epigenetic regulation of C. albicans morphological switches.</a> Pathogens. 10 (11), 1463 (2021).</li><li>Qasim, M. N., Valle Arevalo, A., Nobile, C. J., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+chromatin+accessibility+in+regulating+the+Candida+albicans+white-opaque+phenotypic+switch.">The roles of chromatin accessibility in regulating the Candida albicans white-opaque phenotypic switch.</a> Journal of Fungi. 7 (1), 37 (2021).</li><li>Mancera, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+complex+transcription+network+controlling+biofilm+formation+in+candida+species.">Evolution of the complex transcription network controlling biofilm formation in candida species.</a> eLife. 10, 64682 (2021).</li><li>Lohse, M. B., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+Wor4,+a+new+transcriptional+regulator+of+white-opaque+switching.">Identification and characterization of Wor4, a new transcriptional regulator of white-opaque switching.</a> G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (3), 721-729 (2016).</li><li>Hernday, A. D., Noble, S. M., Mitrovich, Q. M., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+molecular+biology+in+Candida+albicans.">Genetics and molecular biology in Candida albicans.</a> Methods in Enzymology. 470, 737-758 (2010).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li><li>Zentner, G. E., Kasinathan, S., Xin, B., Rohs, R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChEC-seq+kinetics+discriminates+transcription+factor+binding+sites+by+DNA+sequence+and+shape+in+vivo.">ChEC-seq kinetics discriminates transcription factor binding sites by DNA sequence and shape in vivo.</a> Nature Communications. 6, 8733 (2015).</li><li>Schmid, M., Durussel, T., Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIC+and+ChEC:+Genomic+mapping+of+chromatin+proteins.">ChIC and ChEC: Genomic mapping of chromatin proteins.</a> Molecular Cell. 16 (1), 147-157 (2004).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> eLife. 6, 21856 (2017).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+in+situ+genome-wide+profiling+with+high+efficiency+for+low+cell+numbers.">Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1006-1019 (2018).</li><li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient,+rapid,+and+recyclable+system+for+CRISPR-mediated+genome+editing+in+Candida+albicans.">An efficient, rapid, and recyclable system for CRISPR-mediated genome editing in Candida albicans.</a> American Society For Microbiology. 2 (2), 00149 (2017).</li><li>Ennis, C. L., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+markerless+CRISPR-mediated+system+for+genome+editing+in+Candida+auris+reveals+a+conserved+role+for+Cas5+in+the+caspofungin+response.">A markerless CRISPR-mediated system for genome editing in Candida auris reveals a conserved role for Cas5 in the caspofungin response.</a> Microbiology Spectrum. 9 (3), 0182021 (2021).</li><li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+CUT&amp;RUN+chromatin+profiling+tools.">Improved CUT&amp;RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, 46314 (2019).</li><li>Skrzypek, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Candida+Genome+Database+(CGD):+Incorporation+of+Assembly+22,+systematic+identifiers+and+visualization+of+high+throughput+sequencing+data.">The Candida Genome Database (CGD): Incorporation of Assembly 22, systematic identifiers and visualization of high throughput sequencing data.</a> Nucleic Acids Research. 45, 592-596 (2017).</li><li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features.">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Boyd, J., Rodriguez, P., Schjerven, H., Frietze, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssvQC:+an+integrated+CUT&amp;RUN+quality+control+workflow+for+histone+modifications+and+transcription+factors.">ssvQC: an integrated CUT&amp;RUN quality control workflow for histone modifications and transcription factors.</a> BMC Research Notes. 14 (1), 366 (2021).</li><li>Kent, W. J., Zweig, A. S., Barber, G., Hinrichs, A. S., Karolchik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BigWig+and+BigBed:+enabling+browsing+of+large+distributed+datasets.">BigWig and BigBed: enabling browsing of large distributed datasets.</a> Bioinformatics. 26 (17), 2204-2207 (2010).</li><li>Homann, O. R., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MochiView:+Versatile+software+for+genome+browsing+and+DNA+motif+analysis.">MochiView: Versatile software for genome browsing and DNA motif analysis.</a> BMC Biology. 8, 49 (2010).</li><li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT&amp;RUN.">High-resolution chromatin profiling using CUT&amp;RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85 (2019).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1930 (2019).</li><li>Rodriguez, D. L., Quail, M. M., Hernday, A. D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+circuits+regulating+developmental+processes+in+Candida+albicans.">Transcriptional circuits regulating developmental processes in Candida albicans.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 605711 (2020).</li><li>Zhu, Q., Liu, N., Orkin, S. H., Yuan, G. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;amp;RUNTools:+a+flexible+pipeline+for+CUT&amp;amp;RUN+processing+and+footprint+analysis.">CUT&amp;amp;RUNTools: a flexible pipeline for CUT&amp;amp;RUN processing and footprint analysis.</a> Genome Biology. 20 (1), 192 (2019).</li><li>Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., Van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+expressed+loci+are+vulnerable+to+misleading+ChIP+localization+of+multiple+unrelated+proteins.">Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (46), 18602-18607 (2013).</li></ol>

Detta protokoll presenterar en omfattande experimentell och beräkningsmässig pipeline för genomomfattande lokalisering av regulatoriska TF i C. albicans. Den är utformad för att vara mycket tillgänglig för alla med standard mikrobiologi och molekylärbiologi utbildning. Genom att utnyttja det höga dynamiska omfånget och låga provinmatningskraven i CUT & RUN-analysen och inkludera optimeringar för lokalisering av TF-DNA-bindningsinteraktioner i C. albicans biofilm och planktoniska kulturer, pr...

Candida albicans är en kliniskt relevant, polymorf mänsklig svamppatogen som finns i en mängd olika tillväxtsätt, såsom det planktoniska (fritt flytande) tillväxtsättet och som samhällen av tätt vidhäftade celler skyddade av en extracellulär matris, känd som biofilmslägetför tillväxt 1,2,3. I likhet med andra utvecklings- och cellulära processer är biofilmutveckling ett viktigt C. albicans virulensdrag som är känt för att styras på transkriptionsnivå av regulatoriska transkriptionsfaktorer (TF) som binder till DNA på ett sekvensspecifikt sätt4. Nyligen har kromatinregulatorer och histonmodifierare också dykt upp som viktiga regulatorer för C. albicans biofilmbildning5 och morfogenes6 genom att förmedla DNA-tillgänglighet. För att förstå den komplexa biologin hos denna viktiga svamppatogen är effektiva metoder för att bestämma genomomfattande lokalisering av specifika TF under distinkta utvecklings- och cellulära processer värdefulla.
Kromatinimmunutfällning följt av sekvensering (ChIP-seq) är en allmänt använd metod för att undersöka protein-DNA-interaktioner i C. albicans 5,6 och har till stor del ersatt den mer klassiska kromatinimmunutfällningen följt av microarray (ChIP-chip)9-metoden. Både ChIP-seq- och ChIP-chip-metoder kräver dock ett stort antal indataceller10, vilket kan vara en komplicerande faktor vid undersökning av TF i samband med specifika prover och tillväxtsätt, såsom biofilmer som samlats in från patienter eller djurmodeller av infektion. Dessutom ger kromatinimmunutfällningsanalysen (ChIP) ofta en betydande mängd bakgrundssignal i hela genomet, vilket kräver en hög anrikningsnivå för målet av intresse för att tillräckligt separera signal från brus. Medan ChIP-chipanalysen till stor del är föråldrad idag, gör sekvenseringsdjupen som är nödvändiga för ChIP-seq denna analys oöverkomligt dyr för många forskare, särskilt de som studerar flera TF och / eller kromatinassocierade proteiner.

Klyvning under mål och frisättning med nukleas (CUT &RUN) är ett attraktivt alternativ till ChIP-seq. Det utvecklades av Henikoff-laboratoriet 2017 för att kringgå begränsningarna av ChIP-seq och kromatin endogen klyvning följt av sekvensering chEC-seq11,12, en annan metod för att identifiera protein-DNA-interaktioner på en genomomfattande nivå, samtidigt som man tillhandahåller högupplöst, genomomfattande kartläggning av TF och kromatinassocierade proteiner13 . CUT &RUN förlitar sig på riktad matsmältning av kromatin i permeabiliserade kärnor med hjälp av bundna mikrokocknukleaser, följt av sekvensering av de smälta DNA-fragmenten 9,10. Eftersom DNA-fragment genereras specifikt vid de loci som är bundna av ett protein av intresse, snarare än att genereras i hela genomet via slumpmässig fragmentering som i ChIP-analyser, resulterar CUT &RUN-metoden i kraftigt reducerade bakgrundssignaler och kräver därför 1/10 av sekvenseringsdjupet jämfört med ChIP-seq11,13, 14. Dessa förbättringar leder i slutändan till betydande minskningar av sekvenseringskostnaderna och minskningar av det totala antalet indataceller som behövs som utgångsmaterial för varje prov.
Här beskrivs ett robust CUT&RUN-protokoll som har anpassats och optimerats för att bestämma genomomfattande lokalisering av TF i C. albicans-celler isolerade från biofilmer och planktoniska kulturer. En grundlig dataanalyspipeline presenteras också, vilket möjliggör bearbetning och analys av de resulterande sekvensdata och kräver att användarna har minimal expertis inom kodning eller bioinformatik. Kortfattat beskriver detta protokoll epitopmärkning av TF-kodande gener, skörd av biofilm och planktoniska celler, isolering av intakta permeabiliserade kärnor, inkubation med primära antikroppar mot det specifika proteinet eller epitopmärkta proteinet av intresse, tethering av det chimära A / G-mikrokocknukleaset (pAG-MNase) fusionsproteinerna till de primära antikropparna, genomisk DNA-återhämtning efter kromatinförtunning och beredning av genomiska DNA-bibliotek för sekvensering.
Det experimentella CUT & RUN-protokollet följs av en specialbyggd dataanalyspipeline, som tar rå DNA-sekvenseringsläsningar i FASTQ-format och implementerar alla nödvändiga bearbetningssteg för att ge en komplett lista över signifikant berikade loci bundna av TF av intresse (riktad mot den primära antikroppen). Observera att flera steg i det beskrivna biblioteksberedningsprotokollet har anpassats specifikt och optimerats för CUT &RUN-analys av TF (i motsats till nukleosomer). Medan de data som presenteras i detta manuskript genererades med hjälp av TF-specifika anpassningar av ett kommersiellt CUT & RUN-kit, har dessa protokoll också validerats med hjälp av individuellt framställda komponenter (dvs. pAG-MNas-enzym och magnetiska DNA-reningspärlor) och internt beredda buffertar, vilket avsevärt kan minska experimentella kostnader. De omfattande experiment- och dataanalysprotokollen beskrivs i detalj nedan i ett steg-för-steg-format. Alla reagenser och kritisk utrustning, liksom buffert- och medierecept, listas i materialförteckningen respektive tilläggsfil 1.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLGPM33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.65 mL low-adhesion tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490003-190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-152-341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M PIPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ61224AK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-well untreated cell culture plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Digitonin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CHR103MI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89039-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x phusion HF buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Item part of the Phusion high fidelity DNA polymerase; referred to in text as &#34;DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C5001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP magnetic beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;capillary electrophoresis instrument&#34;; user-dependepent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplitube PCR reaction strips with attached caps, Simport Scientific</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89133-910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto peptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchling primer design tool</td>
			<td>Benchling</td>
			<td></td>
			<td>https://www.benchling.com/molecular-biology/; Referred to in the text as &#34;the primer design tool&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betaine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAJ77507AB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcofluor white stain</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Genome Database</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concanavalin A (ConA) conjugated paramagnetic beads</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>&#160;86057-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conda software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curl tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CUTANA ChIC/CUT&#38;RUN kit</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>14-1048</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;the CUT&#38;RUN kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (D-glucose)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco D-mannitol</td>
			<td>&#160;BD Biosciences</td>
			<td>217020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable cuvettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Gel Loading Dye (6x)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DreamTaq green DNA polymerase buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EP0713</td>
			<td>Item part of the DreamTaq green DNA polymerase; referred to in the text as &#34;cPCR DNA polymerase buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli spike-in DNA</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>18-1401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELMI Microplate incubator</td>
			<td>ELMI</td>
			<td>TRMS-04</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;microplate incubator&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Enzyme Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>End Prep Reaction Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89125-170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;restriction enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest MssI Buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FD1344</td>
			<td>Item part of the FastDigest MssI kit; referred to in the text as &#34;restriction enzyme buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll 400</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler low range DNA ladder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FERSM1192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitBash workflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://gitforwindows.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GitHub source code</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/akshayparopkari/cut_run_analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH pH 7.5</td>
			<td>Boston BioProducts</td>
			<td>BBH-75-K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PX1830-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>52846-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ligation Enhancer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lithium acetate dihydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>215525683</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Colors Full-Length GFP polyclonal antibody</td>
			<td>Takara</td>
			<td>632592</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://pypi.org/project/MACS2/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 0.2 mL tubes</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>10-0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic separation rack, 1.5 mL tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>MR02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate and cuvette spectrophotometer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>EPOCH2TC</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;spectrophotometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MochiView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.johnsonlab.ucsf.edu/mochiview-downloads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NCBI GEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Adaptor for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Adapter&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Index X Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Reverse Uniquely Indexed Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;library prep kit&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Universal PCR Primer for Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Index Primers Set 1); referred to in the text as &#34;Universal Forward Library Amplification Primer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin sulfate (NAT)</td>
			<td>Goldbio</td>
			<td>N-500-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex TBE Gels, 10%, 15 well</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>EC62755BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutating mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82007-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient broth</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C6471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH110</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90982</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90982&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH119</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90985</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90985&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH137</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90986</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90986&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH139</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90987</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90987&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pADH140</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>90988</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 90988&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAG-MNase</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>15-1016 or 15-1116</td>
			<td>50 rxn or 250 rxn</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCE1</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>174434</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;plasmid repository ID# 174434&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes with clear lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion high fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F530S</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;DNA polymerase&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene glycol (PEG) 3350</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10791-816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P285-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 1x dsDNA HS assay kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33216</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;fluorometer&#34;; user-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit IgG negative control antibody</td>
			<td>Epicypher</td>
			<td>13-0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10109169001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roche Complete protease inhibitor (EDTA-free) tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5056489001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R6504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>M12820004</td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X centrifuge tube filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile inoculating loops</td>
			<td>VWR</td>
			<td>30002-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S11494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTO 13 nucleic acid stain</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S7575</td>
			<td>Referred to in the text as &#34;nucleic acid gel stain&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>User-dependent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (hydroxymethyl) aminomethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>252859-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Ligation Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Ligation Master Mix&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra II Q5 Master Mix</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;High Fidelity DNA Polymerase Master Mix &#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure salmon sperm DNA solution</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15632011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USER Enzyme</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Item part of the NEBNext Ultra II DNA Library Prep kit; referred to in the text as &#34;Uracil Excision Enzyme&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10153-834</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wget tool</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.candidagenome.org/download/sequence/C_albicans_SC5314/Assembly21/current/C_albicans_SC5314_A21_current_ 
			chromosomes.fasta.gz</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>C7341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymolyase 100T (lyticase, yeast lytic enzyme)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0439194</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide profiling of transcription factor-dna binding interactions in candida albicans: a comprehensive cut&amp;run method and data analysis workflow

Regulatoriska transkriptionsfaktorer styr många viktiga biologiska processer, inklusive cellulär differentiering, svar på miljöstörningar och påfrestningar och värdpatogeninteraktioner. Att bestämma den genomomfattande bindningen av regulatoriska transkriptionsfaktorer till DNA är avgörande för att förstå transkriptionsfaktorernas funktion i dessa ofta komplexa biologiska processer. Klyvning under mål och frisättning med nukleas (CUT &RUN) är en modern metod för genomomfattande kartläggning av in vivo protein-DNA-bindande interaktioner som är ett attraktivt alternativ till den traditionella och allmänt använda kromatinimmunutfällningen följt av sekvenseringsmetod (ChIP-seq). CUT&RUN är mottaglig för en experimentell installation med högre genomströmning och har ett betydligt högre dynamiskt omfång med lägre sekvenseringskostnader per prov än ChIP-seq. Här beskrivs ett omfattande CUT &RUN-protokoll och tillhörande arbetsflöde för dataanalys skräddarsydd för genomomfattande analys av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i den humana svamppatogenen Candida albicans . Detta detaljerade protokoll innehåller alla nödvändiga experimentella procedurer, från epitopmärkning av transkriptionsfaktorkodande gener till biblioteksberedning för sekvensering; Dessutom innehåller den ett anpassat beräkningsarbetsflöde för CUT &RUN-dataanalys.

Detta robusta CUT&RUN-protokoll anpassades och optimerades för att undersöka genomomfattande lokalisering av specifika TF i C. albicans biofilmer och planktoniska kulturer (se figur 2 för en översikt över den experimentella metoden). En grundlig dataanalyspipeline ingår också för att underlätta analysen av de resulterande CUT&RUN-sekvenseringsdata och kräver att användarna har minimal expertis inom kodning eller bioinformatik (se figur 3 för...

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow at JoVE.

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&RUN Method and Data Analysis Workflow

Detta protokoll beskriver en experimentell metod och dataanalysarbetsflöde för klyvning under mål och frisättning med nukleas (CUT & RUN) i den humana svamppatogenen Candida albicans.

Genomomfattande profilering av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i Candida albicans: En omfattande CUT &amp; RUN-metod och dataanalysarbetsflöde

Regulatory transcription factors control many important biological processes, including cellular differentiation, responses to environmental perturbations ...

Detta protokoll beskriver alla experimentella procedurer, från epitopmärkning av transkriptionsfaktorkodande gener genom beräkningsdataanalys, för att utföra genomomfattande profilering av transkriptionsfaktor-DNA-bindande interaktioner i Candida albicans via CUT & RUN. Detta är en mer tillgänglig, snabbare, känsligare, billigare teknik och ger data av högre kvalitet än traditionella ChIP-chip- och ChIP-seq-metoder. Även om vårt protokoll är utvecklat för Candida albicans-celler isolerade från biofilmer eller planktoniska kulturer, bör det vara praktiskt att anpassa det till praktiskt taget alla goda former av Candida albicans-celler.Efter inkubation av cellsuspensionen, överför en fem mikroliter alikvot till ett nytt PCR-rör. Till fem mikroliter isolerade kärnor och en fem mikroliter alikvot av intakta celler som tidigare lagrats vid fyra grader Celsius, tillsätt en mikroliter vardera av kalkofluorvit och SYTO 13. Inkubera vid 30 grader Celsius i mörkret i 30 minuter.Visuellt inspektera integriteten och renheten hos de isolerade kärnorna med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Leta efter isolerade kärnor som visar framträdande SYTO 13-färgning och se till att ingen cellväggsfärgning av det kalkofluorvita färgämnet. Upprepa inspektionen med intakta celler som en kontroll för cellväggfärgning med kalkofluorvitt färgämne.Placera rören på ett magnetställ och vänta tills uppslamningen är helt klar. Kassera supernatanten med en pipett. Tillsätt 50 mikroliter av antikroppsbufferten och blanda försiktigt genom pipettering.Tillsätt tre mikroliter av anti-GFP-polyklonal antikroppen till rören och inkubera rören på en mutterblandare vid 4 grader Celsius i två timmar. Centrifugera rören kort vid 100 gånger g vid rumstemperatur i fem sekunder och placera rören på ett magnetställ. När uppslamningen är klar, kassera supernatanten med en pipett.Medan rören med pärlorna fortfarande finns på magnetstället, lägg till 200 mikroliter iskall cellpermeabiliseringsbuffert direkt på pärlorna. Kassera supernatanten med en pipett. Upprepa två tvättar med den iskalla cellpermeabiliseringsbufferten.Tillsätt 50 mikroliter iskall cellpermeabiliseringsbuffert till varje rör och blanda försiktigt genom pipettering. Tillsätt 2,5 mikroliter av proteinet AG-MNas till varje prov och blanda genom pipettering. Placera proverna på en mutterblandare vid 4 grader Celsius och inkubera proverna i en timme.Centrifugera remsrören kort vid 100 gånger g vid rumstemperatur i fem sekunder och placera sedan rören på ett magnetställ. När uppslamningen är klar, kassera supernatanten med en pipett. Medan rören med pärlorna fortfarande finns på magnetstället, lägg till 200 mikroliter iskall cellpermeabiliseringsbuffert direkt på pärlorna.Kassera supernatanten med en pipett. Upprepa två tvättar med den iskalla cellpermeabiliseringsbufferten. Tillsätt 100 mikroliter av den iskalla cellpermeabiliseringsbufferten till proverna och pipettera försiktigt upp och ner fem gånger.Ta bort gelgjutningen från gellådan och öppna gelgjutningen enligt tillverkarens instruktioner. Ta försiktigt bort gelén från gelgjutningen och placera den i en gelhållande bricka som innehåller 100 ml enkelstyrka TBE. Tillsätt 10 mikroliter av nukleinsyragelfläcken i brickan och virvla försiktigt.Täck med folie för att skydda mot ljus och inkubera statiskt vid rumstemperatur i 10 minuter. Skölj sedan gelén två gånger med 100 ml avjoniserat kranvatten. Föreställ dig gelén under blått ljusbelysning med ett gult filterlock.För varje bibliotek, skär gelén något ovanför det cirka 125 basparets framträdande adapterdimerband och under 400 basparstegemärket. Punktera botten av ett 0,65 ml rör med en 22-gauge nål och placera det punkterade röret inuti ett sterilt två milliliter mikrofugerör. Överför gelskivan till det punkterade röret inuti mikrofugeröret på två milliliter.Centrifugera det två milliliter mikrofugeröret innehållande 0,65 ml punkterat rör och prov vid 10 000 gånger g vid rumstemperatur i två minuter för att samla geluppslamningen inuti två milliliter mikrofugeröret. Tillsätt 300 mikroliter iskall gelelueringsbuffert till geluppslamningen. Blanda på en mutterator vid rumstemperatur i minst tre timmar eller över natten.Överför all vätska och geluppslamning till en 0,22 mikrometer filterkolonn och centrifug vid 10 000 gånger g vid rumstemperatur i en minut. Ladda ned källkoden för CUT&RUN-analysen från GitHub-sidan genom att klicka på den gröna kodknappen, följt av alternativet Ladda ned ZIP. Packa upp mappen till en relevant plats på den lokala datorn.Installera Conda Environment och kör bara en gång. När Conda har installerats skapar du en virtuell miljö som medföljer relevant kommando. Aktivera den virtuella miljön varje gång det här arbetsflödet körs.Cellväggsförtunning och kärnintegritet bedömdes genom att visualisera både kontroll intakta celler och isolerade kärnor färgade med fluorescerande cellvägg och nukleinsyrafläckar. I motsats till de isolerade intakta kärnorna där cellväggsfärgning inte observeras, är både kärnorna och cellväggarna fluorescerande märkta i de intakta kontrollcellerna. Figuren visar CUT & RUN TF-bibliotek analyserade med hjälp av ett kapillärelektroforesinstrument.Framgångsrika CUT&RUN TF-bibliotek berikas för korta fragment mindre än 200 baspar. Suboptimala CUT&RUN TF-bibliotek visar anrikning för stora DNA-fragment. Figuren här visar att Ndt80 DNA-bindande motiv är berikade över alla Ndt80-bundna loci som identifierats av CUT & RUN, vilket indikerar att de ytterligare toppar som identifieras med denna metod sannolikt är bonafide Ndt80-bundna platser.Jämförande analys indikerade att CUT &RUN-protokollet identifierade de flesta av de tidigare kända bindningshändelserna för Ndt80 och Efg1 under biofilmbildning. Sammantaget överlappar både Ndt80 och Efg1 loci med tidigare publicerade kromatinimmunutfällning ChIP-data och identifieras endast med hjälp av CUT & RUN. Det gör det möjligt för oss att avsevärt öka omfattningen och takten i vår forskning med fokus på transkriptionsregulatoriska nätverk och Candida albicans.

Research

JoVE Journal

Biology

Genome-wide Profiling of Transcription Factor-DNA Binding Interactions in Candida albicans: A Comprehensive CUT&amp;RUN Method and Data Analysis Workflow

Genome-wide Analysis of Aminoacylation (Charging) Levels of tRNA Using Microarrays

Genome-wide Analysis of Aminoacylation Charging Levels of tRNA Using Microarrays

Genomvid Analys av Aminoacylation (laddning) Nivåerna av tRNA Använda Microarrays

tRNA aminoacylation, or charging, levels can rapidly change within a cell in response to the environment[1]. Changes in tRNA charging levels in both ...

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Genomvid Analys med hjälp av chip för att identifiera isoform-specifik gen mål

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

En kvantitativ Fitness analys Workflow

Quantitative Fitness Analysis (QFA) is an experimental and computational workflow for comparing fitnesses of microbial cultures grown in parallel1,2,3,4. ...

A Novel Bayesian Change-point Algorithm for Genome-wide Analysis of Diverse ChIPseq Data Types

A Novel Bayesian Change-punkt Algoritm för Genomvid analys av olika ChIPseq datatyper

ChIPseq is a widely used technique for investigating protein-DNA interactions. Read density profiles are generated by using next-sequencing of ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletioner i<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Av High Throughput PCR

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Polysome Fractionation and Analysis of Mammalian Translatomes on a Genome-wide Scale

Polysom ​​Fraktione och analys av däggdjur Translatomes på ett Genomvid Scale

mRNA translation plays a central role in the regulation of gene expression and represents the most energy consuming process in mammalian cells. ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Genomvid Kartläggning av narkotika DNA interaktioner i celler med COSMIC (Tvärbindning av små molekyler att isolera Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis

Komplett arbetsflöde för analys av Histon posttranslationella modifieringar med botten upp masspektrometri: Från Histon Extraction till dataanalys

Nucleosomes are the smallest structural unit of chromatin, composed of 147 base pairs of DNA wrapped around an octamer of histone proteins. Histone ...

Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine

Heltäckande arbetsflöde för Genome-wide identifiering och uttryck Meta-analys av ATL E3 Ubiquitin Ligase gen familjen i Grapevine

Classification and nomenclature of genes in a family can significantly contribute to the description of the diversity of encoded proteins and to the ...