Name: detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines
Uploaded: 2022-06-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines at JoVE.com

Agradecemos al Dr. Xin-Ru Wang de la Universidad de Minnesota por sus perspicaces sugerencias y orientación. Este trabajo fue apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81760374).

1. Materiales y reactivos
<ol><li>Utilice soluciones y medios libres de pirógenos para el cultivo celular (consulte la Tabla de materiales).</li>
	<li>Use agua ultrapura para preparar todas las soluciones.</li>
	<li>Tenga cuidado al seleccionar el suero fetal bovino (FBS) para el cultivo celular, después de un proceso de verificación de lotes. NOTA: Como los lotes fbs están sujetos a cambios regulares, es imposible indicar el catálogo y los números de lote relevantes en este p...

<ol>
	<li>Wiwatanaratanabutr, I., Kittayapong, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+crowding+and+temperature+on+Wolbachia+infection+density+among+life+cycle+stages+of+Aedes+albopictus.">Effects of crowding and temperature on Wolbachia infection density among life cycle stages of Aedes albopictus.</a> Journal of Invertebrate Patholology. 102 (3), 220-224 (2009).</li><li>Sinkins, S. P., Braig, H. R., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+superinfections+and+the+expression+of+cytoplasmic+incompatibility.">Wolbachia superinfections and the expression of cytoplasmic incompatibility.</a> Proceedings of Biologial Sciences. 261 (1362), 325-330 (1995).</li><li>Dobson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+distributed+throughout+insect+somatic+and+germ+line+tissues.">Wolbachia infections are distributed throughout insect somatic and germ line tissues.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 29 (2), 153-160 (1999).</li><li>O'Neill, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+cultivation+of+Wolbachia+pipientis+in+an+Aedes+albopictus+cell+line.">In vitro cultivation of Wolbachia pipientis in an Aedes albopictus cell line.</a> Insect Molecular Biology. 6 (1), 33-39 (1997).</li><li>Sinha, A., Li, Z., Sun, L., Carlow, C. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+Wolbachia+wAlbB+endosymbiont+of+Aedes+albopictus.">Complete genome sequence of the Wolbachia wAlbB endosymbiont of Aedes albopictus.</a> Genome Biology and Evoution. 11 (3), 706-720 (2019).</li><li>Sinkins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+and+cytoplasmic+incompatibility+in+mosquitoes.">Wolbachia and cytoplasmic incompatibility in mosquitoes.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 34 (7), 723-729 (2004).</li><li>Fallon, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytological+properties+of+an+Aedes+albopictus+mosquito+cell+line+infected+with+Wolbachia+strain+wAlbB.">Cytological properties of an Aedes albopictus mosquito cell line infected with Wolbachia strain wAlbB.</a> In Vitro Cellular Developmental Biology - Animals. 44 (5-6), 154-161 (2008).</li><li>Hilgenboecker, K., Hammerstein, P., Schlattmann, P., Telschow, A., Werren, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+species+are+infected+with+Wolbachia?-A+statistical+analysis+of+current+data.">How many species are infected with Wolbachia?-A statistical analysis of current data.</a> Microbiology Letters. 281 (2), 215-220 (2008).</li><li>Werren, J. H., Baldo, L., Clark, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia:+master+manipulators+of+invertebrate+biology.">Wolbachia: master manipulators of invertebrate biology.</a> National Review of Microbiology. 6 (10), 741-751 (2008).</li><li>Kittayapong, P., Baisley, K. J., Baimai, V., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Wolbachia+infections+in+Southeast+Asian+mosquitoes+(Diptera:+Culicidae).">Distribution and diversity of Wolbachia infections in Southeast Asian mosquitoes (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 37 (3), 340-345 (2000).</li><li>O'Neill, S. L., Hoffmann, A., Werren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Influential passengers: inherited microorganisms and arthropod reproduction. , (1997).</li><li>McGraw, E. A., O'Neill, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+insecticides:+new+thinking+on+an+ancient+problem.">Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem.</a> National Review of Microbiology. 11 (3), 181-193 (2013).</li><li>Bourtzis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harnessing+mosquito-Wolbachia+symbiosis+for+vector+and+disease+control.">Harnessing mosquito-Wolbachia symbiosis for vector and disease control.</a> Acta Tropica. 132, 150-163 (2014).</li><li>Turelli, M., Hoffmann, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+spread+of+an+inherited+incompatibility+factor+in+California+Drosophila.">Rapid spread of an inherited incompatibility factor in California Drosophila.</a> Nature. 353 (6343), 440-442 (1991).</li><li>Hoffmann, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+establishment+of+Wolbachia+in+Aedes+populations+to+suppress+dengue+transmission.">Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission.</a> Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).</li><li>Walker, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wMel+Wolbachia+strain+blocks+dengue+and+invades+caged+Aedes+aegypti+populations.">The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations.</a> Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).</li><li>Hughes, G. L., Koga, R., Xue, P., Fukatsu, T., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+infections+are+virulent+and+inhibit+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+in+Anopheles+gambiae.">Wolbachia infections are virulent and inhibit the human malaria parasite Plasmodium falciparum in Anopheles gambiae.</a> PLoS Pathogens. 7 (5), 1002043 (2011).</li><li>Bian, G., Xu, Y., Lu, P., Xie, Y., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endosymbiotic+bacterium+Wolbachia+induces+resistance+to+dengue+virus+in+Aedes+aegypti.">The endosymbiotic bacterium Wolbachia induces resistance to dengue virus in Aedes aegypti.</a> PLoS Pathogens. 6 (4), 1000833 (2010).</li><li>Moreira, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Wolbachia+symbiont+in+Aedes+aegypti+limits+infection+with+dengue,+Chikungunya,+and+Plasmodium.">A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium.</a> Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).</li><li>Caragata, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+cholesterol+modulates+pathogen+blocking+by+Wolbachia.">Dietary cholesterol modulates pathogen blocking by Wolbachia.</a> PLoS Pathogens. 9 (6), 1003459 (2013).</li><li>Zhang, G., Hussain, M., O'Neill, S. L., Asgari, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+uses+a+host+microRNA+to+regulate+transcripts+of+a+methyltransferase,+contributing+to+dengue+virus+inhibition+in+Aedes+aegypti.">Wolbachia uses a host microRNA to regulate transcripts of a methyltransferase, contributing to dengue virus inhibition in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10276-10281 (2013).</li><li>Tortosa, P., Courtiol, A., Moutailler, S., Failloux, A. B., Weill, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chikungunya-Wolbachia+interplay+in+Aedes+albopictus.">Chikungunya-Wolbachia interplay in Aedes albopictus.</a> Insect Molecular Biology. 16 (7), 677-684 (2008).</li><li>Lu, P., Bian, G., Pan, X., Xi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+induces+density-dependent+inhibition+to+dengue+virus+in+mosquito+cells.">Wolbachia induces density-dependent inhibition to dengue virus in mosquito cells.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (7), 1754 (2012).</li><li>Ghosh, A., Jasperson, D., Cohnstaedt, L. W., Brelsfoard, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+of+Culicoides+sonorensis+biting+midge+cell+lines+with+Wolbachia+pipientis.">Transfection of Culicoides sonorensis biting midge cell lines with Wolbachia pipientis.</a> Parasite Vectors. 12 (1), 483 (2019).</li><li>Zhou, W., Rousset, F., O'Neill, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogeny+and+PCR-based+classification+of+Wolbachia+strains+using+wsp+gene+sequences.">Phylogeny and PCR-based classification of Wolbachia strains using wsp gene sequences.</a> The Royal Society Publishing. Proceedings B. 265 (1395), 509-515 (1998).</li><li>Park, M. S., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+PaAtg8+and+roles+of+autophagy+in+adaptation+to+starvation+with+respect+to+the+fat+body+and+midgut+of+the+Americana+cockroach,+Periplaneta+americana.">Cloning of PaAtg8 and roles of autophagy in adaptation to starvation with respect to the fat body and midgut of the Americana cockroach, Periplaneta americana.</a> Cell Tissue Research. 356 (2), 405-416 (2014).</li><li>Geng, S. C., Li, X. L., Fang, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porcine+circovirus+3+capsid+protein+induces+autophagy+in+HEK293T+cells+by+inhibiting+phosphorylation+of+the+mammalian+target+of+rapamycin.">Porcine circovirus 3 capsid protein induces autophagy in HEK293T cells by inhibiting phosphorylation of the mammalian target of rapamycin.</a> Journal of Zhejiang University Science B. 21 (7), 560-570 (2020).</li><li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets:+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data.">Droplet digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).</li><li>Kosea, H., Karr, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+Wolbachia+pipientis+in+the+Drosophila+fertilized+egg+and+embryo+revealed+by+an+anti-Wolbachia+monoclonal+antibody.">Organization of Wolbachia pipientis in the Drosophila fertilized egg and embryo revealed by an anti-Wolbachia monoclonal antibody.</a> Mechanisms of Development. 51 (2-3), 275-288 (1995).</li><li>Ye, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wolbachia+reduces+the+transmission+potential+of+dengue-infected+Aedes+aegypti.">Wolbachia reduces the transmission potential of dengue-infected Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (6), (2015).</li><li>Jensenius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+immunofluorescence,+Western+blotting,+and+cross-adsorption+assays+for+diagnosis+of+African+tick+bite+fever.">Comparison of immunofluorescence, Western blotting, and cross-adsorption assays for diagnosis of African tick bite fever.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 11 (4), 786-788 (2004).</li></ol>

La detección de la infección intracelular por Wolbachia es esencial para el estudio de las interacciones Wolbachia-huésped y la confirmación de la transfección exitosa de células con nuevas cepas. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína. Estos cuatro métodos experimentales corroboraron y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las cél...

El mosquito tigre asiático Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), que es un vector clave del virus del dengue (DENV) en Asia y otras partes del mundo1, es un huésped natural de dos tipos de bacterias intracelulares, Wolbachia (wAlbA y wAlbB), que se distribuyen por toda la línea germinal y el tejido somático 2,3. La línea celular Aa23 derivada de embriones de A. albopictus consta de al menos dos tipos de células morfológicas, las cuales apoyan la infección4 y pueden curarse de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos (Aa23-T). Dado que Aa23 conserva sólo wAlbB, es un modelo útil para el estudio de las interacciones huésped-endosimbionte 4,5,6.
Wolbachia es de transmisión materna e infecta aproximadamente el 65% de las especies de insectos 8,9 y el 28% de las especies de mosquitos10. Infecta una variedad de tejidos y forma una relación simbiótica íntima con el huésped, generalmente induciendo incompatibilidad citoplasmática (IC)11 y reemplazo poblacional mediante la manipulación del sistema reproductivo huésped12,13. Estas respuestas del huésped se han observado en poblaciones naturales de Drosophila simulans14 y en A. aegypti en una jaula de laboratorio y ensayo de campo15. Una importante manipulación no reproductiva provocada por Wolbachia es la resistencia inducida del huésped a una variedad de patógenos, incluidos el DENV, el virus Chikungunya (CHIKV) y el virus del Nilo Occidental (WNV)16,17, que puede estar mediado por un sistema inmune innato mejorado del simbionte18,19, la competencia entre Wolbachia y los virus por los recursos esenciales del huésped20 y la manipulación de las vías de defensa viral del huésped21 .
Este protocolo ha sido desarrollado para estudiar estos mecanismos subyacentes de las respuestas antivirales del huésped inducidas por Wolbachia. Utiliza cuatro métodos de detección de la infección intracelular por Wolbachia de células Aa23. Estos métodos proporcionan una sólida base teórica para los estudios de la infección intracelular por Wolbachia de otras especies huésped. El primer método, la PCR, una técnica poderosa que permite la amplificación enzimática de regiones específicas de ADN sin utilizar procedimientos de clonación convencionales, se utilizó para detectar adn de Wolbachia y determinar la presencia/ausencia de infección por Wolbachia 22. El segundo método mide la densidad de copia de ADN de Wolbachia utilizando PCR cuantitativa (qPCR) para una detección y medición confiables de los productos generados durante cada ciclo de PCR que es directamente proporcional a la cantidad de plantilla antes de la PCR23. El tercer método detecta la presencia de proteínas Wolbachia intracelulares, utilizando Western Blot, una de las herramientas más poderosas para detectar proteínas específicas en mezclas complejas mediante la combinación del alto poder de separación de la electroforesis, la especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de las reacciones enzimáticas cromogénicas. El método final es un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) que combina inmunología, bioquímica y microscopía para detectar la proteína de superficie wolbachia (wsp) a través de una reacción antígeno-anticuerpo para confirmar la absorción celular de Wolbachia y determinar su localización celular.
Este artículo describe los cuatro métodos enumerados anteriormente para verificar la existencia de Wolbachia en las células, que se pueden utilizar para detectar si la Wolbachia exógena se transfectó con éxito y la Wolbachia en la célula se eliminó. Después de determinar si Wolbachia está presente en las células o no, se puede realizar una variedad de análisis diferentes, incluyendo genómica, proteómica o metabolómica. Este protocolo demuestra la detección de Wolbachia a través de células Aa23, pero también se puede utilizar en otras células.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>SteREO Discovery V8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scietific</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>Pipetman</td>
			<td>F167380</td>
			<td>P10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cerium doped yttrium aluminum garnet</td>
			<td>MSE Supplies</td>
			<td></td>
			<td>Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip holder</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control software</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Cargille Laboratories</td>
			<td>16482</td>
			<td>Type A low viscosity 150 cSt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inSituX platform</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IR light source&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LED1085L</td>
			<td>LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Outer ring&#160;</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump lasers&#160;</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>LD785-SE400</td>
			<td>785 nm, 400 mW, &#216;9 mm, E Pin Code, Laser Diode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raspberry Pi</td>
			<td>Raspberry Pi Fundation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retaining ring</td>
			<td>Thorlabs Incorporated</td>
			<td>SM1RR</td>
			<td>SM1 retaining ring for &#216;1&#34; lens tubes and mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedless quartz crystal</td>
			<td>University Wafers, Inc.</td>
			<td>U01-W2-L-190514</td>
			<td>25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shim</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-ray beam stop</td>
			<td>In-house developed</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting wolbachia strain walbb in aedes albopictus cell lines

Como endosimbionte albergado maternalmente, Wolbachia infecta grandes proporciones de poblaciones de insectos. Los estudios han informado recientemente de la regulación exitosa de la transmisión del virus del ARN utilizando mosquitos transfectados por Wolbachia. Las estrategias clave para controlar los virus incluyen la manipulación de la reproducción del huésped a través de la incompatibilidad citoplasmática y la inhibición de las transcripciones virales a través del cebado inmune y la competencia por los recursos derivados del huésped. Sin embargo, los mecanismos subyacentes de las respuestas de los mosquitos transfectados por Wolbachia a la infección viral son poco conocidos. Este artículo presenta un protocolo para la identificación in vitro de la infección por Wolbachia a nivel de ácido nucleico y proteína en las células Aa23 de Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) para mejorar la comprensión de las interacciones entre Wolbachia y sus insectos vectores. A través del uso combinado de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la PCR cuantitativa, el western blot y los métodos analíticos inmunológicos, se ha descrito un protocolo morfológico estándar para la detección de células infectadas por Wolbachia que es más preciso que el uso de un solo método. Este enfoque también se puede aplicar a la detección de la infección por Wolbachia en otros taxones de insectos.

Antes de que se detectara Wolbachia , se observaron células Aa23 y Aa23-T bajo un microscopio de luz para determinar cualquier diferencia morfológica entre las dos líneas celulares. Las células Aa23 y Aa23-T tienen al menos dos morfologías celulares, pero no hay una diferencia morfológica obvia entre los dos tipos de células (Figura 1). Aquí, las células Aa23 se utilizaron como un sistema modelo para detectar la infección por Wolbachia utilizando ...

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Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Se utilizaron cuatro métodos para detectar Wolbachia intracelular, que se complementaron entre sí y mejoraron la precisión de detección de la infección por Wolbachia de Aa23 derivada de Aedes albopictus y Aa23-T curada de la infección nativa por Wolbachia utilizando antibióticos.

Detección de Wolbachia Strain wAlbB en líneas celulares de Aedes albopictus

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Este protocolo ayuda a verificar la existencia de Wolbachia en las células, que es la base para comprender la interacción entre Wolbachia y su huésped. En este protocolo, se utilizaron cuatro métodos para detectar con éxito la infección intracelular por Wolbachia, lo que corroboró y mejoró la precisión de detección de la infección por Wolbachia de las células. La demostración del procedimiento será Qiuqiu Xiao, un postgrado del Laboratorio Clave de Biología y Características de Patógenos Modernos.Comience observando células Aa23 y Aa23-T no teñidas a un aumento de 100x utilizando microscopía de luz. Cultive las células durante cinco a siete días para alcanzar una confluencia del 70 al 80% por matraz. Usando una pipeta, transfiera 1 ml del medio de cultivo a un tubo de microcentrífuga.Centrifugar a 100 RCF durante cinco minutos para cosechar las células. Retire el sobrenadante y almacene el pellet celular resultante a menos 20 grados centígrados. Cultive las células durante cinco a siete días para alcanzar una confluencia del 90 al 100% por matraz.Resuspender los pellets en 0,40 ml de PBS y transferir 50 microlitros de esta solución a un tubo de microcentrífuga. Agregue cinco microlitros de 20 mg / ml de proteinasa K e incube a 55 grados Celsius durante una hora. Luego incuba los tubos a 99 grados Celsius durante 15 minutos para obtener el ADN crudo y almacenarlo a menos 20 grados Celsius.Para realizar la PCR, prepare una mezcla de reacción total de 20 microlitros y establezca las condiciones de PCR como se describe en el manuscrito de texto. Detecte el ADN en un gel de agarosa al 1% utilizando un generador de imágenes de gel. Realice la amplificación cuantitativa por PCR utilizando TB Green en un sistema de PCR en tiempo real y registre los resultados de cada reacción.Analizar el ADN en un volumen total de reacción de 20 microlitros y establecer las condiciones cuantitativas de PCR como se describe en el manuscrito de texto. Calcule los números de copia de los genes WSP y RPS6 en las células de acuerdo con la curva estándar establecida. A continuación, calcule la densidad relativa de Wolbachia por el número de copia de wsp/RPS6.Analice los datos utilizando una prueba t de muestras independiente. Agregue 200 microlitros de tampón de lisis a la bolita celular e incube en hielo durante 30 minutos. Centrifugar los lisados a 12.000 RCF durante 10 minutos a cuatro grados centígrados y aspirar el sobrenadante.Analice la concentración wsp del sobrenadante utilizando un kit de ensayo de proteína BCA, siguiendo las instrucciones del fabricante. Cargue cantidades iguales de proteína en un gel 15% SDS-PAGE. Transfiera la proteína a las membranas de nitrocelulosa y bloquee las membranas con leche desnatada al 5% durante dos horas a temperatura ambiente.Luego lave las membranas tres veces con TBST. Incubar las membranas durante la noche a 4 grados centígrados con 100 microlitros de anticuerpo policlonal anti-wsp preparado diluyendo el anticuerpo primario con leche desnatada al 5%. Lave el anticuerpo primario tres veces con TBST.Agregue 100 microlitros de anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante a las membranas e incube en un agitador durante una hora a temperatura ambiente. Lave las membranas tres veces con TBST y mezcle 20 microlitros de solución A y 20 microlitros de solución B en el kit de detección de quimioluminiscencia en una proporción de uno a uno. Sumerja toda la membrana en la solución de luminiscencia simultáneamente y observe las señales utilizando un sistema de imágenes multifuncional.En una placa de Petri confocal láser, incube las células Aa23 y Aa23-T durante tres o cuatro días a 28 grados Celsius bajo un 5% de dióxido de carbono atmosférico. Cuando la célula alcance el 60 a 70% de confluencia, lave las células tres veces con PBS. Fije las células en un ml de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.Lave las células fijas con PBST durante cinco minutos y vuelva a lavar las células dos veces con PBS. Incubar la placa de Petri en un ml de albúmina sérica bovina al 3% durante una hora a 37 grados centígrados. Agregue 100 microlitros de anticuerpo policlonal anti-wsp de ratón y suero de ratón a los portaobjetos e incube durante la noche en una caja húmeda a cuatro grados centígrados.Retire la placa de Petri de la caja húmeda y devuélvala a temperatura ambiente. Lávelos tres veces con PBS y retire el PBS. Proteja los siguientes procedimientos de la luz.Incubar la placa de Petri con 100 microlitros de un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado alexa Fluor 488 a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Incubar la placa de Petri de muestra con 50 microlitros de DAPI diluidos en PBS a 10 microgramos/ml a 37 grados Celsius durante cinco minutos y luego lavarlos tres veces con PBS. Observe la inmunotinción bajo un microscopio confocal.Antes de detectar Wolbachia, se observaron células Aa23 y Aa23-T bajo un microscopio de luz para determinar las diferencias morfológicas entre las dos líneas celulares. Las células Aa23 y AA23-T tenían al menos dos morfologías celulares, pero no se observaron diferencias morfológicas aparentes entre los dos tipos de células. Utilizando los cebadores de diagnóstico 81F/691R, se detectó amplificación positiva del gen Wolbachia wsp en células Aa23 pero no en células Aa23-T.El análisis de la densidad de Wolbachia en las líneas celulares mostró una relación wsp/rps6 de 2,4 en las células Aa23, pero no Wolbachia en las células Aa23-T. El análisis de Western blot de extractos de proteínas mostró una fuerte señal wsp para Aa23, pero no se detectó ninguna señal para Aa23-T. El ensayo de inmunofluorescencia indirecta detectó la proteína wsp en las células Aa23, mientras que solo se detectó ADN teñido con DAPI en las células Aa23-T.Asegúrese de que los matraces de cultivo se incuban a 28 grados centígrados bajo un 5% de dióxido de carbono atmosférico durante cinco a siete días. Este procedimiento puede ser seguido por microscopía electrónica donde uno necesita prestar especial atención a la preparación y seccionamiento de la muestra. Los cuatro métodos experimentales utilizados en este estudio confirmaron la precisión de detección de la infección por Wolbachia en las células, que también es aplicable a otros tipos de células y tejidos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivation of Thymic Lymphoma T-cell Lines from Atm-/- and p53-/- Mice

Derivación de linfoma tímico líneas de células T de Atm - / -</sup Y P53 - / -</sup Ratones

Established cell lines are a critical research tool that can reduce the use of laboratory animals in research. Certain strains of genetically modified ...

Investigación

Inmunología e Infección

Establishment of Epstein-Barr Virus Growth-transformed Lymphoblastoid Cell Lines

Establecimiento de Epstein-Barr transformado al crecimiento líneas celulares linfoblastoides

Infection of B cells with Epstein-Barr virus (EBV) leads to proliferation and subsequent immortalization, resulting in establishment of lymphoblastoid ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

La detección de glucógeno en las células mononucleares de sangre periférica con ácido periódico de Schiff tinción

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

Prevención de Estrés Térmico efectos adversos en ratas<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

La detección de la corteza Fragmentos Durante la germinación de esporas bacterianas

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

Un simple Blood Red lisis celular Método para el establecimiento de líneas de células B linfoblastoides

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection

Un método eficiente y Simple para establecer líneas de células T de pacientes con infección crónica activa Virus Epstein - Barr y NK

A number of methods have been described to establish NK/T cell lines from patients with lymphoma or lymphoproliferative syndrome. These methods employed ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Métodos para la detección de amiloides siguiente infección de pulmonar endotelial células citotóxicas por Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus

Análisis de competencia vectorial en mosquitos Aedes aegypti con el virus Zika

The procedures presented describe a generalized methodology to infect Aedes aegypti mosquitoes with Zika virus under laboratory conditions to determine ...

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Propagación del parásito microsporidiano Edhazardia aedis en mosquitos Aedes aegypti

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...