Name: an optimized single-molecule pull-down assay for quantification of protein phosphorylation
Uploaded: 2022-06-06T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation at JoVE.com

이 작업은 국립 보건원 R35GM126934, R01AI153617 및 R01CA248166에서 DSL로 지원했습니다. EMB는 ASERT-IRACDA 프로그램(NIH K12GM088021)과 UNM MARC 프로그램(NIH 2T34GM008751-20)에 의해 JAR을 통해 지원되었다. 우리는 NIH P30CA118100이 지원하는 뉴 멕시코 대학 종합 암 센터 형광 현미경 공유 자원을 사용하여 감사하게 인정합니다. 우리는 SiMPull의 원래 개발이이 작품에 영감을 준 Ankur Jain 박사와 Taekijip Ha 박사를 인정하고 싶습니다. ES-C 현재 주소 : 면역 역학 그룹, 통합 암 면역학 실험실, 암 연구 센터, 국립 암 연구소, 베데스다

1. 커버슬립 준비
참고 :이 단계에서는 니트릴 장갑, 안전 안경 또는 안면 보호막의 이중 레이어와 실험실 코트가 포함 된 개인 보호 장비 (PPE)를 착용해야합니다.
<ol><li>피라냐 에칭을 수행하여 유리에서 유기 파편을 제거하십시오. 주의: 피라냐 용액은 강한 산화제로서 유기물과 접촉할 때 부식성이 강하고 반응성이 높습니다. 유기 파편과의 반응은 발열성이?...

<ol>
	<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Signaling+by+Receptor+Tyrosine+Kinases.">Cell Signaling by Receptor Tyrosine Kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li><li>Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+protein+modifications+with+interaction+domains.">Reading protein modifications with interaction domains.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (7), 473-483 (2006).</li><li>Coba, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+drive+combinatorial+multistate+postsynaptic+density+networks.">Neurotransmitters drive combinatorial multistate postsynaptic density networks.</a> Science Signaling. 2 (68), (2009).</li><li>Gibson, S. K., Parkes, J. H., Liebman, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+modulates+the+affinity+of+light-activated+rhodopsin+for+g+protein+and+arrestin.">Phosphorylation modulates the affinity of light-activated rhodopsin for g protein and arrestin.</a> Biochemistry. 39 (19), 5738-5749 (2000).</li><li>Stites, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+mechanistic+models+to+integrate+and+analyze+multiple+proteomic+datasets.">Use of mechanistic models to integrate and analyze multiple proteomic datasets.</a> Biophysical Journal. 108 (7), 1819-1829 (2015).</li><li>Hause, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+binary+interaction+mapping+of+SH2+domains+via+fluorescence+polarization+reveals+novel+functional+diversification+of+ErbB+receptors.">Comprehensive binary interaction mapping of SH2 domains via fluorescence polarization reveals novel functional diversification of ErbB receptors.</a> PLOS ONE. 7 (9), 44471 (2012).</li><li>Lau, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+encoding+of+the+effect+of+a+partial+agonist+on+individual+opioid+receptors+by+multisite+phosphorylation+and+threshold+detection.">Quantitative encoding of the effect of a partial agonist on individual opioid receptors by multisite phosphorylation and threshold detection.</a> Science Signaling. 4 (185), (2011).</li><li>Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+and+analysis:+next+generation+Western+blotting+techniques.">Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques.</a> Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).</li><li>Brunner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benchmarking+multiple+fragmentation+methods+on+an+orbitrap+fusion+for+top-down+phospho-proteoform+characterization.">Benchmarking multiple fragmentation methods on an orbitrap fusion for top-down phospho-proteoform characterization.</a> Analytical Chemistry. 87 (8), 4152-4158 (2015).</li><li>Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+using+multiple+proteases+for+large-scale+mass+spectrometry-based+proteomics.">Value of using multiple proteases for large-scale mass spectrometry-based proteomics.</a> Journal of Proteome Research. 9 (3), 1323-1329 (2010).</li><li>Curran, T. G., Zhang, Y., Ma, D. J., Sarkaria, J. N., White, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MARQUIS:+A+multiplex+method+for+absolute+quantification+of+peptides+and+posttranslational+modifications.">MARQUIS: A multiplex method for absolute quantification of peptides and posttranslational modifications.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-11 (2015).</li><li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+cellular+protein+complexes+using+single-molecule+pull-down.">Probing cellular protein complexes using single-molecule pull-down.</a> Nature. 473 (7348), 484-488 (2011).</li><li>Jain, A., Liu, R., Xiang, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+pull-down+for+studying+protein+interactions.">Single-molecule pull-down for studying protein interactions.</a> Nature Protocols. 7 (3), 445-452 (2012).</li><li>Kim, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pairwise+detection+of+site-specific+receptor+phosphorylations+using+single-molecule+blotting.">Pairwise detection of site-specific receptor phosphorylations using single-molecule blotting.</a> Nature Communications. 7 (1), 1-10 (2016).</li><li>Salazar-Cavazos, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multisite+EGFR+phosphorylation+is+regulated+by+adaptor+protein+abundances+and+dimer+lifetimes.">Multisite EGFR phosphorylation is regulated by adaptor protein abundances and dimer lifetimes.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (7), 695 (2020).</li><li>Huyer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+inhibition+of+protein-tyrosine+phosphatases+by+vanadate+and+pervanadate.">Mechanism of inhibition of protein-tyrosine phosphatases by vanadate and pervanadate.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (2), 843-851 (1997).</li><li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li><li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Objective+lenses+for+confocal+microscopy.">Objective lenses for confocal microscopy.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 145-161 (2006).</li><li>Hendriks, C. L. L., van Vliet, L. J., Rieger, B., van Kempen, G. M. P., van Ginkel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dipimage: a scientific image processing toolbox for MATLAB. , (1999).</li><li>fitgeotrans: Fit geometric transformation to control point pairs. The MathWorks Inc Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html">https://www.mathworks.com/images/ref/fitgeotrans.html</a> (2013)</li><li>Raghavachari, N., Bao, Y. P., Li, G., Xie, X., M&#252;ller, U. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+autofluorescence+on+DNA+microarrays+and+slide+surfaces+by+treatment+with+sodium+borohydride.">Reduction of autofluorescence on DNA microarrays and slide surfaces by treatment with sodium borohydride.</a> Analytical Biochemistry. 312 (2), 101-105 (2003).</li><li>Wang, X., Park, S., Zeng, L., Jain, A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+single-cell+single-molecule+pull-down.">Toward single-cell single-molecule pull-down.</a> Biophysical Journal. 115 (2), 283-288 (2018).</li><li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies.">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (86), e50549 (2014).</li></ol>

여기에 기술된 프로토콜은 단일 단백질 수준에서 수용체 인산화의 정량적 측정을 가능하게 하도록 최적화되었다. SiMPull 프로토콜에 대한 몇 가지 간단하지만 중요한 변형이 개발되어 NaBH4 처리로 자가 형광을 감소시키고 항체 해리를 방지하기 위해 샘플의 후고정을 포함하여 포스포티 로신 검출을 위한 측정의 신뢰성을 향상시켰다. 녹색 채널 마스크를 사용하여 항-PY 항체와의 공국소화?...

막-관련 신호전달은 리간드-유도된 막 수용체 활성화 및 신호를 전파하는 하류 부속 단백질의 모집의 조합에 의해 조정된다. 수용체 세포질 꼬리에서 주요 티로신의 인산화는 신호전달 복합체 또는 신호전달복합체 1,2의 형성을 개시하는데 매우 중요하다. 따라서 생물학에서 중요한 질문은 신호 전달 파트너를 모집하고 세포 결과를 지시하기 위해 인산화 패턴을 만들고 유지하는 방법입니다. 이는 시그널 로솜 3,4,5,6,7의 조성을 지시함으로써 신호전달 출력을 조작하는 수단을 제공할 수 있는 풍부하고 특정한 포스포티로신 패턴 모두에서 수용체 인산화의 이질성을 이해하는 것을 포함한다. 그러나, 단백질 인산화를 심문하는 현재의 방법에는 한계가 있다. 웨스턴 블롯 분석은 단백질 인산화의 경향을 설명하는 데 탁월하지만 반 정량적8이며 수천 ~ 수백만 개의 수용체가 함께 평균화되기 때문에 시스템의 이질성에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 웨스턴 블롯은 특정 티로신에 대한 포스포 특이적 항체를 사용하여 샘플을 프로빙하는 것을 허용하지만, 동일한 단백질 내의 다중 부위 인산화 패턴에 대한 정보를 제공 할 수는 없습니다. 정량적 인포프로테오믹스는 포스포티로신 풍부도에 대해 보고하지만, 관심있는 잔기가 효소적 소화에 의해 생성되는 동일한 펩티드(전형적으로 7-35개 아미노산) 내에 위치할 필요가 있기 때문에 다중 부위 인산화를 검출하는 데는 한계가 있다 9,10,11.
상기 언급된 한계를 극복하기 위해, 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석은 단일 분자 수준에서 무손상 수용체의 인산화 상태를 정량화하도록 적응되었다. SiMPull은 Jain et al.12,13에 의해 거대 분자 복합체를 심문하기위한 강력한 도구로 처음 입증되었습니다. SiMPull에서, 거대분자 복합체를 항체-기능화된 유리 커버슬립 상에서 면역침전 (IP)시킨 다음, 단백질 서브유닛 수 및 복합 성분12를 갖는 co-IP에 대한 단일 분자 현미경을 통해 분석하였다. SiMBlot이라고 불리는 Kim et al.14의 변형은 변성 단백질의 인산화를 분석하기 위해 SiMPull의 변형을 사용한 최초의 사례였다. SiMBlot 프로토콜은 NeutrAvidin-코팅된 커버슬립을 사용하여 비오티닐화된 세포 표면 단백질을 포획하는 데 의존하며, 이 커버슬립은 포스포 특이적 항체 표지(14)로 인산화를 위해 프로브된다. 이러한 발전에도 불구하고, 번역 후 변형의 정량화를보다 강력하고 광범위한 단백질에 적용 할 수 있도록 개선이 필요했습니다.
본 프로토콜은 다양한 리간드 조건 및 종양원성 돌연변이(15)에 반응하여 무손상 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 인산화 패턴을 정량화하는데 사용된 최적화된 SiMPull 접근법을 기술한다. 이 연구는 EGFR에 초점을 맞추는 반면,이 접근법은 양질의 항체를 사용할 수있는 모든 막 수용체 및 관심있는 세포질 단백질 (POI)에 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 샘플 자동 형광을 줄이는 단계, 최대 20개의 샘플을 동시에 준비하여 최소한의 시료 부피를 필요로 하는 샘플 어레이 설계, 항체 표지 및 고정 조건 최적화가 포함됩니다. 데이터 분석 알고리즘은 인산화된 단백질의 단일 분자 검출 및 정량화를 위해 개발되었다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>MTC Bio</td>
			<td>C2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>T50 Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Tissue Culture dish</td>
			<td>CELLTREAT</td>
			<td>229620</td>
			<td>Storage of piranha etched glass/arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Functionalized Glass storage/ KOH reuse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Lysis Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Tissue Culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8% Glutaraldehyde Aqueous Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>16020</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone (C3H6O)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>270725</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 NHS Ester</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal-Free Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Human EGFR (External Domain) &#8211; Biotin</td>
			<td>Leinco Technologies, Inc</td>
			<td>E101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-7020 AF647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath-sonicator</td>
			<td>Branson</td>
			<td>1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>23227</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-PEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>Biotin-PEG-SVA, MW 5,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-420-1</td>
			<td>Tyrode&#39;s Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C4901</td>
			<td>Tyrode&#39;s Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scraper</td>
			<td>Bioworld</td>
			<td>30900017-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conical Filtering Flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S15464</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coplin Jar</td>
			<td>WHEATON</td>
			<td>900470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24 x 60 #1.5</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>63793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DipImage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://diplib.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>DML19-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>emCCD camera</td>
			<td>Andor iXon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Optima</td>
			<td>Bio-Techne</td>
			<td>S12450H</td>
			<td>Heat Inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fusion 360 software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geneticin G418 Disulfate</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>G030-5GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid (CH3COOH)</td>
			<td>JT Baker</td>
			<td>JTB-9526-01</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Stir Rod</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D9434</td>
			<td>Tyrode&#39;s Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>78446</td>
			<td>Lysis Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Tyrode&#39;s Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (HCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH7204-1</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%)</td>
			<td></td>
			<td>HX0645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>HX0635-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630 (NP-40)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td>Lysis Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444960-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in-house vacuum line</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O)</td>
			<td>MPBio</td>
			<td>2191421</td>
			<td>Tyrode&#39;s Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (CH3OH)</td>
			<td>IBIS Scientific</td>
			<td>MX0486-1</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>92245</td>
			<td>Suggested conjugation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mPEG</td>
			<td>Laysan Bio</td>
			<td>mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane</td>
			<td>UCT United Chemical</td>
			<td>A0700</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanogrid</td>
			<td>Miraloma Tech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeutrAvidin Biotin Binding Protein</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen (compressed gas)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVIDIA GPU with CUDA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus iX71 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M Sealing Film</td>
			<td>The Lab Depot</td>
			<td>HS234526C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS pH 7.4</td>
			<td>Caisson Labs</td>
			<td>PBL06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC-200 Analog Hot Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>6795-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2236BF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>529552</td>
			<td>Tyrode&#39;s Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide (KOH)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1050330500</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter</td>
			<td>Raise 3D</td>
			<td>PMS:2035U/RAL:3028</td>
			<td>Printing temperature range: 205-235 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pro2 3D printer</td>
			<td>Raise 3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 1 L beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PYREX 100 mL storage bottles</td>
			<td>Corning</td>
			<td>1395-100</td>
			<td>CH3OH/C3H6O reuse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 250 mL beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 4 L beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quad-view Image Splitter</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>Model QV2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>EP-5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10027-446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm)</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>LF405/488/561/635-4X4M-B-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological pipette controller</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Serological Pipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>smite single molecule analysis package</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://github.com/LidkeLab/smite.git</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Borohydride (NaBH4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>452874</td>
			<td>Tyrode&#39;s Buffer Component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td>Activate by successive heat and pH cycling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH3247-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Orthovanadate (Na3VO4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid (H2SO4)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>258105</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TetraSpeck Microspheres</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7279</td>
			<td>multi-fluorescent beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (Trizma) base</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue stain, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25300120</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optimized single-molecule pull-down assay for quantification of protein phosphorylation

인산화는 단백질 기능을 조절하고 세포 신호 전달 결과를 지시하는 필요한 번역 후 변형입니다. 단백질 인산화를 측정하는 현재의 방법은 개별 단백질에 걸친 인산화에서 이질성을 보존할 수 없다. 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석은 유리 커버슬립 상의 단백질의 면역침전을 통해 거대분자 복합체의 조성을 조사하기 위해 개발되었으며, 이어서 단일 분자 이미징이 뒤따랐다. 현재의 기술은 단일 분자 수준에서 전장 막 수용체의 인산화 상태의 강력한 정량화를 제공하는 SiMPull의 적응입니다. 이러한 방식으로 수천 개의 개별 수용체를 이미징하면 단백질 인산화 패턴을 정량화 할 수 있습니다. 본 프로토콜은 샘플 준비에서 이미징에 이르기까지 최적화된 SiMPull 절차를 자세히 설명합니다. 유리 제제 및 항체 고정 프로토콜의 최적화는 데이터 품질을 더욱 향상시킵니다. 현재 프로토콜은 샘플 내에서 인산화된 수용체의 분획을 계산하는 단일 분자 데이터 분석을 위한 코드를 제공합니다. 이 연구는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 인산화에 초점을 맞추는 반면, 프로토콜은 다른 막 수용체 및 세포질 신호 분자로 일반화 될 수 있습니다.

SiMPull 프로세스를 묘사하는 만화가 그림 1A에 나와 있습니다. 커버슬립은 비오티닐화 항-EGFR 항체의 앵커로서 NeutrAvidin을 사용하여 총 단백질 용해물로부터 EGFR-GFP를 포획하여 기능화된다. 결합되지 않은 단백질을 세척한 후, 인산화된 수용체는 항-포스포티로신(anti-PY) 항체15로 표지된다. 도 1B 는 소수성 어레이의 이미지를 보여주며, ?...

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An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

본 프로토콜은 개선된 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석을 사용하여 단백질 인산화를 정량화하기 위한 샘플 준비 및 데이터 분석을 기술한다.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...

이 SiMPull 프로토콜은 항체 표지 및 고정 조건을 개선하고 녹색 채널에서 발견되는 자기 형광을 줄이며 강력한 단일 분자 분석 알고리즘을 제공함으로써 단백질 인산화의 정량화를 가능하게합니다. SiMPull의 주요 장점은 개별 손상되지 않은 단백질의 인산화 상태를 조사 할 수 있다는 것입니다. 이 방법을 사용하면 웨스턴 블롯팅 및 질량 사양 분석과 같은 전통적인 기술을 통해 액세스 할 수없는 새로운 정보를 얻을 수 있습니다.우리는 프로토콜을 시연하는 데 도움이되는 연구원 팀을 보유하고 있습니다. 먼저, 줄리안 로조 (Julian Rojo)는 피라냐가 커버 글라스를 에칭하는 방법을 보여줄 것입니다. Rachel Grattan은 커버 글라스를 코팅하는 단계를 보여줍니다.엘리자베스 베일리(Elizabeth Bailey)는 배열과 이미지 샘플을 그리는 방법을 보여줄 것입니다. 시작하기 위해, 피라냐는 30분 동안 5분마다 반응 비이커를 부드럽게 교반함으로써 커버 슬립을 에칭한다. 약한 염기를 서서히 첨가함으로써 피라냐 용액을 중화시켰다.유리 막대로 에칭 된 커버 슬립을 Buchner 깔때기에 옮기고 이중 증류수로 다섯 분 동안 헹구십시오. 그런 다음 커버 슬립을 유리 코플린 병에 넣고 메탄올로 덮으십시오. 뚜껑을 밀봉 필름으로 밀봉하고 10 분 동안 초음파 처리하십시오.초음파 처리 후, 메탄올을 유리 저장 병에 비우십시오. 아세톤으로이 단계를 반복하십시오. 커버 슬립을 코플린 항아리에 이중 증류수로 세 번 헹구십시오.덮개 슬립에서 물을 배수하고 Bunsen 버너의 불꽃을 통해 흔들어서 말립니다. 커버 슬립을 마른 코플린 병에 넣으십시오. 그런 다음 아미노실란 용액을 코플린 병에 첨가하여 커버슬립아미노실란화를 수행한다.빛으로부터 보호하기 위해 밀봉 필름을 덮고 적용하십시오. 덮개 슬립을 메탄올로 헹구고 사용 된 용액을 버리십시오. 다시 커버 슬립을 두 분 동안 이중 증류수로 세 번 헹구십시오.과도한 수분과 공기를 10 분 동안 완전히 말리십시오. 다음으로, 소수성 장벽 펜으로 그리드 어레이를 그립니다. 표지 슬립에 식별자를 표시하여 적절한 방향을 식별합니다.잉크가 건조 된 후 커버 슬립을 가습 챔버에 넣으십시오. 153 밀리그램의 mPEG와 3.9 밀리그램의 비오틴-PEG를 10 밀리몰 중탄산나트륨 및 볼텍스의 609 마이크로리터에 재현탁시킨다. 실온에서 1분부터 10, 000 x g에서 원심분리하여 기포를 제거하였다.제곱 당 10 ~ 15 마이크로 리터의이 용액을 적용하여 오버플로없이 어레이를 완전히 덮으십시오. 커버 슬립을 어둠 속의 습도 챔버에 실온에서 서너 시간 동안 보관하십시오. 그런 다음 커버 슬립을 이중 증류수로 채워진 세 개의 비커에 순차적으로 10 초 동안 담그어 씻으십시오.질소 가스를 사용하여 커버 슬립에서 모든 습기를 제거하십시오. 커버 슬립을 질소로 채워진 50밀리리터 원뿔형 튜브에 다시 보관하고 밀봉 필름으로 밀봉합니다. 튜브를 씰링 필름으로 감싸고 영하 20도에 놓습니다.비오틴-PEG 기능화된 어레이를 냉동실에서 제거하고 이를 실온으로 평형화시킨다. 커버 슬립을 어레이를 위로 향하게 하여 밀봉 필름이 늘어선 100밀리미터 조직 배양 접시 위에 놓습니다. 어레이의 각 사각형을 실온에서 4분 동안 PBS 중의 밀리리터당 10밀리그램의 나트륨 보로하이드라이드로 인큐베이션한다.PBS로 세 번 씻으십시오. 다음으로 T50에서 밀리리터당 0.2밀리그램의 NeutrAvidin으로 5분 동안 인큐베이션한 다음, T50 BSA로 세 번 세척한다. 인큐베이션을 T50 BSA에서 밀리리터당 두 마이크로그램의 비오티닐화 POI 특이적 항체로 10분 동안 반복한 다음, 세척하였다.먼저, 용해물을 피펫팅하여 혼합한 해동. 용해물 1 마이크로리터를 얼음처럼 차가운 T50 BSA PPI 100 마이크로리터에 희석한다. 용해물을 어레이 상에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 세척하였다.얼음처럼 차가운 T50 BSA PPI에서 AF647 접합된 항포스포티로신 항체를 준비하고, 어레이 상에서 한 시간 동안 인큐베이션한다. 목표에 기름 한 방울을 입금하십시오. 나노 그리드를 이미징 무대에 놓습니다.전송 된 백색광을 사용하여 그리드 패턴에 중점을 둡니다. 그리드의 일련의 20 개의 이미지를 획득하고 픽셀이 포화되지 않았는지 확인하고 이미지 시리즈를 신탁으로 저장하십시오. 나노그리드의 초점을 해제하여 통풍이 잘되는 패턴을 만들고, 게인 보정을 위해 일련의 20개의 이미지를 획득하고, 이미지를 게인으로 저장합니다.그런 다음 카메라에 모든 빛을 차단하여 카메라 오프셋을위한 일련의 20 개의 이미지를 획득하고 이미지 배경을 저장하십시오. 간단한 이미지를 얻으려면 먼저 오일 목표를 청소하고 목표에 추가 오일을 입금하십시오. 커버 슬립 어레이를 현미경 스테이지에 고정합니다.각 샘플에 대한 이미지를 획득하고, 먼저 원-적색 채널에서, 이어서 더 낮은 파장의 형광단을 획득한다. 30~45분마다 버퍼 수준을 확인하고 필요에 따라 보충하십시오. 이 기술을 사용하여, EGFR-GFP를 총 단백질 용해물로부터 포획하였다.소수성 잉크의 자가형광을 샘플의 초점면을 찾기 위한 가이드로서 사용하였다. 원시 데이터 이미지는 카메라 칩에서 분리 된 스펙트럼 채널로 수집되었습니다. 데이터 수집을 위해 녹색 및 원거리 채널의 오버레이가 추가로 검사되었습니다.채널 등록은 나노그리드로부터 획득한 이미지에 대해 수행되었다. 신탁 이미지의 오버레이는 불완전한 등록을 보여주었습니다. 정렬은 원간 및 녹색 채널 좌표에 로컬 가중 평균 변환을 적용하여 수행되었으며, 이는 후속 SiMPull 데이터를 등록하는 데 사용되었습니다.GFP 및 AF647 채널로부터의 배경 광자 수 위의 단일 방출기를 박스화하고 위치를 식별하기 위해 가우시안 현지화를 수행하였다. F647에서 EGFR-GFP의 공동국소화는 인산화된 수용체를 확인하기 위해 수행되었다. 및 공국소화의 백분율을 인산화된 수용체의 분획을 결정하기 위해 사용하였다.피라냐 에칭된 유리를 나트륨 보로하이드라이드로 처리했을 때 배경 검출이 감소하였다. 용해물에서 EGFR-GFP의 강력한 결합은 최소한의 비특이적 PY99-AF647 결합으로 관찰되었으며, 이 기술을 이용한 표면 기능화의 보유를 보여준다. SiMPull은 단백질 인산화에 대한 정보를 제공하며 광범위한 자기 신호 전달 질문을 해결할 수 있습니다.이것은 정상 및 질병 상태 모두에서 신호 전달에 대한 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

적외선 형광 염료로 표지 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 전기 영동 이동성 시프트 분석을위한 최적화 된 프로토콜

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

연구

생화학

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

마그네틱 핀셋으로 G-quadruplexes의 단일 분자 조작

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3 색 단일 분자 무서 워를 사용 하 여 단백질 상호 작용의 상관 관계를 연구 하

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

단일 분자 수준에서 동질성을 라벨의 프로테옴 와이드 정량화

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

MeCP2 단백질 변이체에 대한 전기 화학 발광 기반 분석

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...