Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

تشكر اللجنة العليا زمالة وايتهيد الصيفية للبحوث. تشكر MJS صناديق الشركات الناشئة وصندوق تطوير أعضاء هيئة التدريس في جامعة سان فرانسيسكو. تعترف MCH بالتمويل المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (NIH MIRA 5R35GM133684-02) والمؤسسة الوطنية للعلوم (NSF CAREER 2048265).

1. التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني: المعايرة بالتحليل الحجمي المباشر مع منافسة المخزن المؤقت
<ol><li>إعداد العينات<ol>
<li>تحضير محلول مخزن من 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol (bisTris) عند درجة الحموضة 7.4 باستخدام ماء فائق النقاء (مقاومة >18 MΩ). قم بإزالة أيونات المعادن النزرة عن طر?...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

توفر هذه المقالة طريقة قوية لقياس التقارب والديناميكا الحرارية لارتباط Cu(II) بالببتيدات. تعتبر المجمعات المزودة ب Cu(II) مناسبة بشكل مثالي لمراقبة نطاق امتصاص d-d في موقع المعدن بسبب تكوين الإلكترون d9 . على الرغم من أن معامل الانقراض صغير ، مما يتطلب تركيزات أكبر من المجمع لإنتاج إشارة مو...

تطورت البيولوجيا للاستفادة من الكيمياء المتنوعة لأيونات المعادن اللازمة للحياة للتكيف والبقاء على قيد الحياة في البيئة المحيطة بها. ما يقدر بنحو 25٪ -50٪ من البروتينات تستخدم أيونات المعادن للهيكل والوظيفة1. يرتبط الدور الخاص وحالة الأكسدة والاختزال لأيون المعدن ارتباطا مباشرا بتكوين وهندسة الروابط البيولوجية التي تنسقه. بالإضافة إلى ذلك ، يجب تنظيم أيونات المعادن النشطة بالأكسدة والاختزال مثل Cu (II) بإحكام خشية أن تتفاعل مع العوامل المؤكسدة عبر كيمياء تشبه فينتون لتشكيل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) 2،3،4. إن فهم أوضاع الربط والتقارب التي تقود الكيمياء الحيوية يجب أن يساعد في توضيح الدور البيولوجي لأيون المعدن.
تستخدم العديد من التقنيات لدراسة التفاعلات الملزمة للمعادن والببتيدات. هذه هي في الغالب تقنيات طيفية ولكنها تشمل أيضا محاكاة الكمبيوتر باستخدام الديناميكا الجزيئية ، كما يتضح من خلال تفاعلات Cu (II) مع جزء من بيتا أميلويد (Aβ)5. تقنية طيفية مستخدمة على نطاق واسع والتي يمكن الوصول إليها من قبل العديد من الجامعات هي الرنين المغناطيسي النووي (NMR). باستخدام الطبيعة البارامغناطيسية ل Cu(II) ، تمكن Gaggelli et al. من إظهار المكان الذي يرتبط فيه أيون المعدن على البتيد من خلال استرخاء النوى القريبة6. يمكن أيضا استخدام الرنين البارامغناطيسي الإلكتروني (EPR) لاستكشاف موقع ووضع ربط أيون المعدن شبه المغناطيسي7. يمكن للتقنيات الطيفية الأخرى مثل الثنائيات الدائرية (CD) أن تصف التنسيق حول Cu (II) في أنظمة مثل أنظمة الببتيد الثلاثي8 ، ويمكن أن يظهر قياس الطيف الكتلي قياس stoichiometry وأي بقايا يتم تنسيق أيون المعدن من خلال أنماط التجزئة 9,10.
بعض هذه التقنيات ، مثل الرنين المغناطيسي النووي ، خالية من الملصقات ولكنها تتطلب تركيزات كبيرة من الببتيد ، مما يشكل تحديات للدراسة. تم استخدام تقنية شائعة أخرى تسمى التحليل الطيفي الفلوري لربط موضع التيروزين أو التربتوفان مع التبريد من Cu(II)11,12. وبالمثل ، يمكن لهذه التقنية إظهار التغيرات الهيكلية نتيجة لربط Cu (II)13. ومع ذلك ، فإن التحديات التي تواجه دراسات ربط الببتيد المعدني هذه هي أنها تسبر الأحماض الأمينية الكروموفورية مثل التيروزين التي لا تمتلكها جميع الأنظمة ، وأن أيون المعدن يرتبط بموجب نموذج كلاسيكي ، وأن هذه التقنية قد لا تكون مواتية في ظل الظروف الفسيولوجية. في الواقع ، تظهر العديد من الببتيدات التي لا تحتوي على مثل هذه الأحماض الأمينية الكروموفورية أو ترتبط بموجب النماذج الكلاسيكية ، مما يحول دون استخدام هذه التقنيات14,15. توضح هذه المقالة بالتفصيل طرق تقييم خصائص الربط في هذه السيناريوهات في ظل الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.
قد تعتمد الروابط البيولوجية حالات بروتونات مختلفة يمكن أن تؤثر على ربط أيون المعدن مثل حلقة الإيميدازول على الهستيدين. إذا لم يتم الحفاظ على درجة الحموضة باستمرار ، فقد تكون النتائج معقدة أو متضاربة. لهذا السبب ، تعد المخازن المؤقتة مكونا أساسيا في دراسة تفاعلات البروتين المعدني / الببتيد. ومع ذلك ، فقد ثبت أن العديد من المخازن المؤقتة تتفاعل بشكل إيجابي مع أيونات المعادن16,17. بالإضافة إلى التنافس مع الجزيء البيولوجي محل الاهتمام ، قد يكون للمخزن المؤقت ذرات منسقة مماثلة قد يكون من الصعب تمييزها عن الذرات المنسقة للببتيد أو البروتين. في هذه الدراسة ، ينصب التركيز على التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني وقياس السعرات الحرارية بالمعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة (ITC) كتقنيتين تكميليتين لدراسة تفاعلات Cu (II) - الببتيد ، مع اعتبارات خاصة تتعلق باختيار المخزن المؤقت.
التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص هو تقنية سريعة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع لدراسة التفاعلات المرتبطة بالمعادن. يمكن أن يؤدي التشعيع بالضوء في الأشعة فوق البنفسجية (UV) أو الأطوال الموجية المرئية إلى امتصاص نطاقات d-d المتمركزة حول المعادن ، والتي توفر معلومات قيمة عن تصنيف الليغاند ، والهندسة المعدنية ، وتقاربات الارتباط الواضحة18,19. بالنسبة لهذه المجمعات ، يمكن للمعايرة المباشرة لأيونات المعادن إلى محاليل البروتين أو الببتيد أن تحدد كميا مقاييس stoichiometry الملزمة والتقاربات الملزمة الواضحة. في بعض الحالات ، مثل تكوينات الإلكترون d5 أو d10 ، لا يمتص المجمع الضوء (أي أنه صامت طيفيا). في هذه المجمعات الفلزية الانتقالية الصامتة طيفيا ، يمكن التحايل على هذه القيود باستخدام رباط منافس ، عند التنسيق مع أيون المعدن ، ينتج نطاقات نقل شحنة يمكن اكتشافها. وفي كلتا الحالتين، يقتصر هذا النهج على القياس الكمي فقط لقياس الستويشيومتري والتقارب الواضح بين الروابط، ولا يتم توفير أي نظرة ثاقبة على المحتوى الحراري الملزم دون تقريب.
واستكمالا للمعلومات التي تم الحصول عليها من التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص، يعد مركز التجارة الدولية تقنية جذابة للقياس الكمي المباشر والصارم للمحتوى الحراري20 الملزم. يقيس مركز التجارة الدولية مباشرة الحرارة المنبعثة أو المستهلكة أثناء حدث ملزم ، وبما أن المعايرة بالتحليل الحجمي تتم عند ضغط ثابت ، فإن الحرارة المقاسة هي المحتوى الحراري لجميع التوازنات (ΔHITC). بالإضافة إلى ذلك ، يتم تحديد كمية قياس stoichiometry لحدث الربط (n) وتقارب الارتباط الظاهر (KITC). من هذه المعلمات ، يتم تحديد الطاقة الحرة (ΔG ITC) والإنتروبيا (ΔSITC) ، مما يوفر لقطة ديناميكية حرارية لحدث الربط. وبما أنه لا يعتمد على امتصاص الضوء، فإن مركز التجارة الدولية هو تقنية مثالية للأنواع الصامتة طيفيا، على سبيل المثال، d5 أو d10 مجمعات أيون معدنية. ومع ذلك ، نظرا لأن قياس السعرات الحرارية يقيس الحرارة ، فإن أي أنظمة عازلة لا مثيل لها وتوازن غير محسوب قد يؤثر سلبا على التحليل لتحديد الديناميكا الحرارية المرتبطة بأيون المعدن بدقة ، ويجب توخي الحذر الشديد لمعالجة هذه العوامل20. إذا تم تنفيذ ITC بدقة مناسبة ، فهي تقنية قوية لتحديد الديناميكا الحرارية لمجمعات البروتين المعدني / الببتيد.
هنا ، يتم استخدام ببتيد ملزم بالنحاس صامت كروموفوريا ، C-peptide ، لإثبات الاستخدام التكميلي للتقنيتين. الببتيد C هو منتج انقسام بقايا 31 (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) يتكون أثناء نضج الأنسولين. يفتقر إلى بقايا الكروموفوريك ولكن ثبت أنه يربط Cu (II) مع التقارب ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية14,15. يتكون موقع ربط Cu(II) من سلاسل جانبية من الغلوتامات والأسبارتات بالإضافة إلى المحطة N للببتيد14,15. تشبه هذه الذرات المنسقة إلى حد كبير تلك الموجودة في العديد من الأنظمة العازلة شائعة الاستخدام. هنا ، يظهر الاستخدام الترادفي لنطاقات نقل الشحنة d-d والشحنة في التحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني و ITC في تحديد الديناميكا الحرارية الملزمة Cu (II) بالببتيد C. يمكن تطبيق النهج من دراسة ارتباط Cu (II) بالببتيد C على أيونات المعادن الأخرى وأنظمة البروتين / الببتيد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

النحاس (II) هو معدن أساسي في النظم البيولوجية ، ويمنح خصائص كيميائية فريدة للجزيئات الحيوية التي يتفاعل معها. وقد أفيد أنه يرتبط مباشرة بمجموعة متنوعة من الببتيدات ويلعب أدوارا ضرورية ومرضية تتراوح من بنية الوساطة إلى خصائص نقل الإلكترون إلى نقل الوظيفة الحفازة. إن تحديد تقارب الارتباط والديناميكا الحرارية لمجمعات Cu(II)-peptide هذه في المختبر يوفر نظرة ثاقبة على القوة الدافعة الديناميكية الحرارية للربط ، والمسابقات المحتملة بين أيونات المعادن المختلفة للببتيد أو بين الببتيدات المختلفة ل Cu(II) ، وانتشار مركب Cu(II)-الببتيد في الجسم الحي. ومع ذلك، فإن تحديد الديناميكا الحرارية الملزمة يمكن أن يكون تحديا بسبب عدد لا يحصى من العوامل، بما في ذلك حساب جميع التوازنات المتنافسة ضمن تجربة المعايرة، خاصة في الحالات التي يكون فيها هناك نقص في المقابض الطيفية المنفصلة التي تمثل الببتيد، وأيون المعدن d-block، وتفاعلاتهما.
هنا ، يتم توفير مجموعة قوية من التجارب لتحديد كمي دقيق للديناميكا الحرارية Cu(II)-peptide. تركز هذه المقالة على استخدام التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص في وجود وغياب الروابط الكروموفورية لتوفير المقبض الطيفي اللازم على Cu(II) واستخدام كالوريمتر المعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة الخالي من الملصقات. في كلتا التقنيتين التجريبيتين ، يتم وصف العملية لحساب جميع التوازنات المتنافسة. في حين أن تركيز هذه المقالة ينصب على Cu(II) ، يمكن أن تنطبق مجموعة التجارب الموصوفة على ما وراء تفاعلات Cu(II) - الببتيد ، وتوفر إطارا للقياس الكمي الدقيق لأنظمة الببتيد المعدني الأخرى في ظل الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

وكان الهدف هو تحديد الديناميكا الحرارية لارتباط Cu(II) بالببتيد C وتأكيدها باستخدام التقنيات التكميلية للتحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني ومركز التجارة الدولية. نظرا للطبيعة القوية للتحليل الطيفي للامتصاص الإلكتروني ، تم إجراء معايرة مباشرة ل Cu (II) إلى 300 μM C-peptide (الشكل 1). ت?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

تركز هذه المقالة على استخدام التحليل الطيفي الإلكتروني للامتصاص وقياس السعرات الحرارية بالمعايرة بالتحليل الحجمي متساوي الحرارة لفحص وقياس الديناميكا الحرارية لارتباط Cu(II) بالببتيدات والبروتينات.

قياس التفاعلات الملزمة بين Cu(II) وبقايا الببتيد في وجود وغياب الكروموفور

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

ستسمح هذه الطريقة للباحث بالتحقيق في الأنظمة التي يصعب دراستها ، مثل الببتيدات وأيونات المعادن الانتقالية في الصف الأول ، وكلاهما يمثل تحديا عاما باستخدام تطبيقات أكثر قياسية. الميزة الرئيسية هنا هي استخدام تقنيات متعامدة لأنها تكمل بعضها البعض بشكل جيد ، وهذا يمكن أن يعطي المزيد من التبصر في النظام ويساعدنا على عدم تفويت أي ظاهرة. الطريقة المفصلة في هذا الفيديو مناسبة تماما لدراسة الأنظمة الأخرى.على الرغم من أننا نعرضه مع Cu (II) والببتيد ، إلا أنه يمكن استخدامه للعديد من تفاعلات الببتيد المعدني والبروتين المعدني المختلفة. أعتقد أن الجزء الأصعب سيكون العثور على خيار عازل جيد لأيون المعدن والببتيد. أود أن أستشير الأدبيات لمعرفة المخازن المؤقتة التي استخدمها الآخرون من قبل.سيوضح الإجراء سوهي تشوي ، طالب الدراسات العليا في مختبر الأبحاث الخاص بي. للبدء ، قم بتشغيل مقياس الطيف الضوئي الإلكتروني للامتصاص واتركه يسخن لمدة 15 إلى 20 دقيقة تقريبا قبل الاستخدام. ثم قم بتشغيل برنامج مقياس الطيف الضوئي وتكوين المعلمات ، مثل نطاق المسح الضوئي من 200 إلى 900 نانومتر ، ونطاق المسح الضوئي البالغ 200 نانومتر في الثانية ، وتصحيح خط أساس الحزمة المزدوجة.بعد ذلك ، قم بجمع خط أساس بدون كوفيت أو عينات في مسارات الحزمة. باستخدام اثنين من cuvettes متطابقة في مقياس الطيف الضوئي مزدوج الشعاع ، قم بتحميل cuvette واحد مع 115 ميكرولتر من الماء فائق النقاء والآخر cuvette مع 115 ميكرولتر من عينة الببتيد مع ضمان عدم وجود فقاعات هواء في cuvettes لأنها سوف تتداخل مع الإشارة. بعد ذلك ، ضع الكوفيت بماء فائق النقاء في الشعاع المرجعي والكوفيت مع الببتيد في شعاع العينة.ثم جمع طيف امتصاص الببتيد الخالي من المعادن. أضف كمية فرعية من محلول Cu(II) إلى الكوفيت مع عينة الببتيد وسجل الحجم لتحليله لاحقا. قم بتوصيل ذلك برفق لأعلى ولأسفل لخلط المحلول مع تجنب توليد فقاعات الهواء.بعد التوازن لمدة خمس دقائق ، أعد الكوفيت إلى حامل خلية العينة وسجل طيف الامتصاص. ثم كرر إضافة Cu(II)aliquots إلى محلول الببتيد لمختلف المعادلات وسجل الحجم الإجمالي ل Cu(II) المضاف إلى cuvette. بعد تهيئة البرنامج كما هو موضح سابقا في اثنين من cuvettes متطابقة تحميل كوفيت واحد مع 115 ميكرولتر من الماء النقي للغاية وكوفيت أخرى مع 115 ميكرولتر من حل مجمع النحاس الفين.ضع الكوفيت بالماء في الشعاع المرجعي والكوفيت بمحلول معقد من النحاس وفين في شعاع العينة. ثم جمع طيف امتصاص مجمع ligand المعدني. بعد ذلك ، أضف كمية stoichiometric من الببتيد إلى محلول مجمع النحاس وفين وقم بتوصيله بلطف لأعلى ولأسفل للخلط جيدا مع الحرص على عدم إدخال أي فقاعات هواء.بعد ذلك ، احتضن المحلول لمدة خمس دقائق للوصول إلى التوازن. ضع الكوفيت مرة أخرى في حامل خلية العينة وسجل طيف الامتصاص. في وقت لاحق ، كرر إضافة أليكوتس الببتيد إلى محلول مجمع النحاس وفين لمختلف المعادلات ، وسجل حجم الببتيد المضاف بحيث يمكن تحديد التركيز المخفف.قم أولا بتشغيل ITC وقم بتشغيل برنامج ITC لتشغيل الأداة. بعد التهيئة الأولى ، أعد توطين السحاحة واتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة. ثم قم بإزالة السحاحة والغطاء من الخلية المرجعية.بعد ذلك ، قم بإزالة أي ماء من الخلية المرجعية وشطفه ثلاث مرات باستخدام 450 ميكرولتر من الماء النقي للغاية المنزوع الغاز. اسحب الماء النقي للغاية ببطء إلى علامة 450 ميكرولتر لمحقنة التحميل مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء في المحقنة. ثم أدخل حقنة التحميل في الخلية المرجعية حتى تكون على بعد ملليمتر واحد تقريبا من الأسفل وحقن جزء من المحلول ببطء حتى يبقى 150 ميكرولتر في حقنة التحميل.بعد ذلك ، حرك مكبس حقنة التحميل بسرعة لأعلى ولأسفل بمقدار 25 ميكرولتر تقريبا عدة مرات لإزاحة أي فقاعات على سطح الخلية. ثم حقن ببطء حتى يصل المكبس إلى علامة 100 ميكرولتر على حقنة التحميل ، وبالتالي توزيع ما مجموعه 350 ميكرولتر من الماء النقي للغاية في الخلية المرجعية واستبدال غطاء الخلية المرجعية. بعد إزالة أي محلول متبقي من خلية العينة ، قم بتحميل 450 ميكرولتر من 10 ملليمولار EDTA باستخدام حقنة تحميل وانقع لمدة 10 دقائق لضمان إزالة أيونات المعادن النزرة لأن EDTA سيربط المعادن النزرة.بعد إزالة محلول EDTA ، اشطف حقنة التحميل جيدا بكميات وفيرة من الماء النقي للغاية. قم بتنظيف ITC وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة عن طريق شطف خلية العينة بالماء النقي للغاية. قم بإزالة أي ماء متبقي من خلية العينة ثم قم بتهيئة خلية العينة عن طريق الشطف ب 450 ميكرولتر من المخزن المؤقت ثلاث مرات على الأقل.بعد ذلك ، قم بإزالة المخزن المؤقت المتبقي الذي يقوم بتكييف خلية العينة وتحميل محلول الببتيد في خلية العينة باستخدام حقنة التحميل. ثم شطف حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي مع 200 ميكرولتر من المحلول المخزن مؤقتا عن طريق إزالة المكبس أولا. باستخدام ماصة صغيرة ، ماصة المحلول العازل من خلال الفتحة الموجودة في الجزء العلوي من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي الزجاجية من خلال المحقنة وإخراج الإبرة أدناه.في وقت لاحق ، أدخل المكبس بالكامل في حقنة المعايرة. ثم اغمس طرف إبرة حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في المحلول المعدني واسحب المكبس ببطء لأعلى مما يتسبب في ملء المحلول المعدني للمحقنة وينتج عنه حجم فراغ في الجزء العلوي من الجزء الزجاجي من حقنة المعايرة. لإزالة حجم الفراغ ، قم بتدوير حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي موازية للأرضية.ثم قم بإزالة المكبس وإمالة الجزء الزجاجي قليلا نحو الأرض. رج حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي بلطف بحيث ينتقل المحلول إلى الجزء الزجاجي من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي ويملأ معظم حجم الفراغ. ولكن تأكد من بقاء اثنين إلى ثلاثة ميكرولترات من حجم الفراغ.مع الحفاظ على المحقنة موازية للأرضية ، أعد إدخال المكبس. ثم امسك حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في وضع مستقيم واغمس طرف الإبرة مرة أخرى في المحلول المعدني. بعد ذلك ، ادفع المكبس لأسفل حتى يتوقف الهواء عن الخروج من الإبرة وقم بتحميل حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي عن طريق سحب المكبس ببطء إلى أعلى بقليل من علامة 50 ميكرولتر مع الحفاظ على طرف الإبرة في المحلول.أدخل بعناية الجزء الزجاجي من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي في السحاحة والمسمار حتى يضيق الإصبع. بعد ذلك ، باستخدام ممسحة حساسة خفيفة ، تمتص المحلول الذي يخرج من حقنة المعايرة بالتحليل الحجمي بسبب ضغط المكبس دون لمس طرف الإبرة. بعد ذلك ، أدخل السحاحة باستخدام حقنة معايرة في خلية العينة واربطها بإحكام.لإعداد معلمات برنامج ITC، حدد التحكم في الأداة. اضبط معدل التحريك ودرجة الحرارة. ثم ضمن تفاصيل التجربة، أدخل المحقنة وتركيزات الخلايا بوحدات الملليمولار.بعد ذلك، في القسم طريقة التجربة، حدد المعايرة بالتحليل الحجمي التدريجي. انقر فوق إعداد وحدد 20 حقنة من 2.5 ميكرولتر وإذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الدقة لمراقبة حدث الربط ، فقم بزيادة عدد الحقن وتقليل الحجم لكل حقنة. بعد ذلك ، أدخل التباعد الزمني بين كل حقنة بحيث يكون طويلا بما يكفي لتوازن الإشارة والعودة إلى خط الأساس ، عادة 300 ثانية.ثم انقر على الزر تشغيل لبدء التجربة وتحديد مكان حفظ البيانات. تم إجراء معايرة Cu(II) في C-Peptide مما يدل على أن إضافة 150 ميكرومولار من Cu(II) تسبب في زيادة فورية في النطاق عند 600 نانومتر تعزى إلى النطاق d-d من Cu(II) واستمرت في الزيادة حتى تمت إضافة 300 ملليمولار Cu(II). إضافة أخرى فوق 300 ميكرومولار Cu(II) لم تزد امتصاص حظر d-d مما يشير إلى التشبع وأن Cu(II) يرتبط بالببتيد C في مركب 1: 1 مع قيمة سجل K أكثر من ستة.تمت معايرة C-Peptide إلى ما يقرب من 10 مركب ميكرومولار من النحاس والفين وانخفض الامتصاص من نطاق نقل الشحنة عند 265 نانومتر مما يشير إلى أن C-Peptide كان قادرا على تخليب Cu(II) من رباط الفينانثرولين بقيمة سجل K من 7.4 إلى 7.8. يظهر مخطط الحرارة ITC معايرة 1.4 ملليمولار Cu (II) في 154 ميكرومولار C-Peptide في مخزن مؤقت MOPS 15 ملليمولار. وجد أن التقارب الملزم له قيمة سجل K تبلغ ثمانية مع تغير في المحتوى الحراري مثل 8 كيلوجول لكل مول.جيبس الطاقة الحرة كما ناقص 46 كيلوجول لكل مول ، والتغير في الإنتروبيا كما 120 جول لكل مول لكل كلفن. المعايرة بالتحليل الحجمي التي يتم التحكم فيها من 1.4 ملليمولار Cu(II) إلى 15 ملليمولار MOPS المخزن المؤقت في غياب C-Peptide لا يظهر أي ارتباط في مخطط الحرارة. أود أن أقول التأكد من أن كل شيء نظيف.إذا كانت هناك أيونات معدنية أو ببتيدات متبقية من التجارب السابقة ، فيمكن أن يؤثر ذلك بشكل كبير على قياس stoichiometry ويوفر منافسة غير معروفة في تجارب الربط. الديكروزم الدائري هو طريقة أخرى لدراسة تفاعلات الببتيد المعدني أو البروتين المعدني لأنه ينظر إلى الدائرية. يمكن لمطياف الكتلة أيضا استجواب هذه المجمعات من خلال النظر في التغيرات في الكتلة.تم استخدام هذه المجموعة من التقنيات من قبل العديد من المختبرات التي تدرس أيونات المعادن التي تتفاعل مع الببتيدات أو البروتينات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

الآلي الصوتية الاستغناء عن التخفيف المسلسل من الببتيد ناهضات في الفعالية تحديد فحوصات

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

تصميم عالية تقارب الأجسام المضادة مستضد حركية ملزم باستخدام أربعة منصات جهاز الاستشعار البيولوجي

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

تخصيص صفائف الببتيد للكشف عن Alloantibodies هلا في زرع الأعضاء

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

تحقيق قوة مباشرة لقياس التكامل الميكانيكية بين النواة وسيتوسكيليتون

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

وجود خلية من خلايا U937 في غياب الطرد المركزي عالية السرعة

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...