Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

SC takker Whitehead Summer Research Fellowship. MJS takker startup-fondene og fakultetets udviklingsfond ved University of San Francisco. MCH anerkender finansiering fra National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) og National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

1. Elektronisk absorptionsspektroskopi: direkte titrering med bufferkonkurrence
<ol><li>Forberedelse af prøver<ol>
<li>Der fremstilles en bufferopløsning af 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol (bisTris) ved pH 7,4 ved anvendelse af ultrarent vand (>18 MΩ resistens). Fjern spormetalioner ved at inkubere med en harpiks med høj affinitet i mindst 2 timer med efterfølgende filtrering.</li>
		<li>Opløs eller fortynd en kendt mængde af peptidet i den metalfrie buffer.<b...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

Denne artikel giver en robust metode til kvantificering af affinitet og termodynamik af Cu (II) binding til peptider. Komplekser med Cu (II) er ideelt egnet til at overvåge d-d-absorptionsbåndet på metalstedet på grund af dets d 9-elektronkonfiguration. Selvom udryddelseskoefficienten er lille, hvilket kræver større koncentrationer af komplekset for at give et pålideligt signal, kan titreringer af Cu (II) til peptid hurtigt give indsigt i bindingsstøkiometrien og den omtrentlige bindingsaffinitet. Det ...

Biologi har udviklet sig til at udnytte den forskellige kemi af metalioner, der er nødvendige for, at livet kan tilpasse sig og overleve i det omgivende miljø. Anslået 25%-50% af proteinerne bruger metalioner til struktur og funktion1. Metalionens særlige rolle og redoxtilstand er direkte relateret til sammensætningen og geometrien af de biologiske ligander, der koordinerer den. Derudover skal redoxaktive metalioner såsom Cu(II) reguleres stramt, så de ikke interagerer med oxidationsmidler via Fenton-lignende kemi og danner reaktive iltarter (ROS)2,3,4. At forstå bindingstilstandene og affiniteten, der driver dens biokemi, bør hjælpe med at belyse metalionens biologiske rolle.
Mange teknikker bruges til at studere bindingsinteraktionerne mellem metaller og peptider. Disse er for det meste spektroskopiske teknikker, men omfatter også computersimuleringer ved hjælp af molekylær dynamik, set gennem Cu (II) interaktioner med et fragment af amyloid beta (Aβ)5. En meget anvendt spektroskopisk teknik, der er tilgængelig for mange universiteter, er nuklear magnetisk resonans (NMR). Ved at bruge den paramagnetiske natur af Cu (II) var Gaggelli et al. i stand til at vise, hvor metalionen binder på en petide gennem afslapning af nærliggende kerner6. Elektronparamagnetisk resonans (EPR) kan også bruges til at undersøge placeringen og tilstanden af den paramagnetiske metalionbinding7. Andre spektroskopiske teknikker såsom cirkulær dikroisme (CD) kan beskrive koordinationen omkring Cu (II) i systemer som tripeptidsystemer8, og massespektrometri kan vise støkiometri, og til hvilke rester metalionen koordineres gennem fragmenteringsmønstre 9,10.
Nogle af disse teknikker, såsom NMR, er etiketfri, men kræver store koncentrationer af peptid, hvilket udgør udfordringer for undersøgelse. En anden almindelig teknik kaldet fluorescensspektroskopi er blevet brugt til at relatere positionen af en tyrosin eller tryptophan med slukning fra en Cu (II) 11,12. På samme måde kan denne teknik vise strukturelle ændringer som følge af Cu (II) binding13. Udfordringerne med disse metal-peptidbindingsundersøgelser er imidlertid, at de undersøger kromoforiske aminosyrer som tyrosin, som ikke alle systemer har, at metalionen binder under en klassisk model, og at teknikken muligvis ikke er befordrende under fysiologiske forhold. Faktisk dukker der flere peptider op, der ikke indeholder sådanne kromoforiske aminosyrer eller binder under klassiske modeller, hvilket udelukker brugen af disse teknikker14,15. Denne artikel beskriver tilgange til vurdering af bindingsegenskaber i disse scenarier under fysiologisk relevante forhold.
Biologiske ligander kan vedtage forskellige protoneringstilstande, der kan påvirke metalionbinding, såsom imidazolringen på histidin. Hvis pH ikke opretholdes konsekvent, kan resultaterne være indviklede eller modstridende. Af denne grund er buffere en væsentlig komponent i undersøgelsen af metal-protein / peptidinteraktioner. Imidlertid har mange buffere vist sig at interagere positivt med metalioner16,17. Ud over at konkurrere med det biologiske molekyle af interesse kan bufferen have lignende koordinerende atomer, der kan være vanskelige at skelne fra de koordinerende atomer af peptidet eller proteinet. I denne undersøgelse er fokus på elektronisk absorptionsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) som to komplementære teknikker til undersøgelse af Cu (II) -peptidinteraktioner med særlige overvejelser vedrørende buffervalg.
Elektronisk absorptionsspektroskopi er en hurtig, bredt tilgængelig teknik til undersøgelse af metalbindende interaktioner. Bestråling med lys i ultraviolette (UV) eller synlige bølgelængder kan føre til absorption af metalcentrerede d-d-bånd, som giver værdifuld information om ligandklassificering, metalgeometrier og tilsyneladende bindingsaffiniteter 18,19. For disse komplekser kan direkte titreringer af metalioner i protein- eller peptidopløsninger kvantificere bindende stoichiometrier og tilsyneladende bindingsaffiniteter. I nogle tilfælde, såsom d5 eller d10 elektronkonfigurationer, absorberer komplekset ikke lys (dvs. er spektroskopisk tavs). I disse spektroskopisk tavse overgangsmetalkomplekser kan disse begrænsninger omgås ved hjælp af en konkurrerende ligand, der ved koordinering til metalionen giver detekterbare ladningsoverførselsbånd. I begge tilfælde er denne tilgang begrænset til kun at kvantificere støkiometri og tilsyneladende bindingsaffinitet, og der gives ingen indsigt i bindende entalpi uden tilnærmelser.
Som supplement til information opnået fra elektronisk absorptionsspektroskopi er ITC en attraktiv teknik til direkte og streng kvantificering af bindingentalpi20. ITC måler direkte den varme, der frigives eller forbruges under en bindingshændelse, og da titreringen finder sted ved konstant tryk, er den målte varme entalpi for alle ligevægte (ΔHITC). Derudover kvantificeres støkiometrien af bindingshændelsen (n) og den tilsyneladende bindingsaffinitet (KITC). Fra disse parametre bestemmes den frie energi (ΔGITC) og entropi (ΔSITC), hvilket giver et termodynamisk øjebliksbillede af bindingshændelsen. Da det ikke er afhængig af lysabsorption, er ITC en ideel teknik til spektroskopisk tavse arter, for eksempel d5 eller d10 metalionkomplekser. Da kalorimetri imidlertid måler varme, kan eventuelle uovertrufne buffersystemer og uligevægte, der ikke er redegjort for, påvirke analysen negativt for nøjagtigt at bestemme metalionbindende termodynamik, og der skal udvises stor omhu for at løse disse faktorer20. Hvis det udføres med den passende strenghed, er ITC en robust teknik til bestemmelse af termodynamikken af metalprotein / peptidkomplekser.
Her anvendes et kromoforisk lydløst kobberbindende peptid, C-peptid, til at demonstrere den komplementære anvendelse af de to teknikker. C-peptid er et 31-restspaltningsprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) dannet under insulinmodning; det mangler kromoforrester, men har vist sig at binde Cu(II) med fysiologisk relevant affinitet14,15. Cu(II)-bindingsstedet består af sidekæderne af et glutamat og et aspartat samt N-terminalen af peptidet14,15. Disse koordinerende atomer ligner meget dem i mange almindeligt anvendte buffersystemer. Her vises tandemanvendelsen af d-d- og ladningsoverførselsbåndene i elektronisk absorptionsspektroskopi og ITC til kvantificering af Cu (II) bindende termodynamik til C-peptid. Fremgangsmåden fra at studere Cu (II) binding til C-peptid kan anvendes på andre metalioner og protein / peptidsystemer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

Kobber (II) er et essentielt metal i biologiske systemer, der giver unikke kemiske egenskaber til de biomolekyler, som det interagerer med. Det er blevet rapporteret at binde direkte til en række peptider og spille både nødvendige og patologiske roller lige fra medierende struktur til elektronoverførselsegenskaber til at give katalytisk funktion. Kvantificering af bindingsaffiniteten og termodynamikken af disse Cu (II) -peptidkomplekser in vitro giver indsigt i bindingens termodynamiske drivkraft, potentielle konkurrencer mellem forskellige metalioner for peptidet eller mellem forskellige peptider for Cu (II) og forekomsten af Cu (II) -peptidkomplekset in vivo. Imidlertid kan kvantificering af bindings termodynamikken være udfordrende på grund af et utal af faktorer, herunder at tage højde for alle konkurrerende ligevægte inden for et titreringseksperiment, især i tilfælde, hvor der mangler diskrete spektroskopiske håndtag, der repræsenterer peptidet, d-blokmetalionen og deres interaktioner.
Her tilvejebringes et robust sæt eksperimenter til nøjagtig kvantificering af Cu (II) -peptid termodynamik. Denne artikel fokuserer på brugen af elektronisk absorptionsspektroskopi i nærvær og fravær af kromoforiske ligander for at tilvejebringe det nødvendige spektroskopiske håndtag på Cu (II) og brugen af etiketfri isotermisk titreringskalorimetri. I begge eksperimentelle teknikker beskrives en proces for at redegøre for alle konkurrerende ligevægte. Mens fokus i denne artikel er på Cu (II), kan det beskrevne sæt eksperimenter gælde ud over Cu (II) -peptidinteraktioner og give en ramme for nøjagtig kvantificering af andre metalpeptidsystemer under fysiologisk relevante betingelser.

Målet var at kvantificere og bekræfte termodynamikken af Cu (II) binding til C-peptid ved hjælp af de komplementære teknikker til elektronisk absorptionsspektroskopi og ITC. På grund af den robuste karakter af elektronisk absorptionsspektroskopi blev der udført en direkte titrering af Cu (II) til 300 μM C-peptid (figur 1). Tilsætning af 150 μM Cu(II) forårsagede en øjeblikkelig stigning i båndet ved 600 nm, der tilskrives d-d-båndet cu(II), og fortsatte med at stige, indtil 300 ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Denne artikel fokuserer på brugen af elektronisk absorptionsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri til at undersøge og kvantificere termodynamikken af Cu (II) binding til peptider og proteiner.

Kvantificering af bindingsinteraktionerne mellem Cu (II) og peptidrester i nærvær og fravær af kromoforer

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Denne metode vil gøre det muligt for forskeren at undersøge svært at studere systemer, som peptider og første række overgangsmetalioner, som begge generelt er udfordrende ved hjælp af mere standardapplikationer. Den største fordel her er at bruge ortogonale teknikker, fordi de supplerer hinanden godt, og det kan give mere indsigt i systemet og hjælpe os med ikke at gå glip af noget fænomen. Metoden, der er beskrevet i denne video, er meget velegnet til at studere andre systemer.Selvom vi viser det med Cu (II) og et peptid, kan det bruges til mange forskellige metalpeptid- og metalproteininteraktioner. Jeg tror, at det sværeste vil være at finde et godt buffervalg til din metalion og peptid. Jeg ville konsultere litteratur for at se, hvilke buffere der er blevet brugt af andre før.Sohee Choi, en kandidatstuderende i mit forskningslaboratorium, vil demonstrere proceduren. Til at begynde med skal du tænde det elektroniske absorptionsspektrofotometer og lade det varme op i ca. 15 til 20 minutter før brug. Start derefter spektrofotometersoftwaren, og konfigurer parametrene, såsom scanningsområde på 200 til 900 nanometer, scanningsområdet på 200 nanometer i sekundet og dobbeltstrålebasislinjen korrigeret.Derefter indsamles en basislinje uden kuvetter eller prøver i strålebanerne. Ved hjælp af to matchede kuvetter i dobbeltstrålespektrofotometeret skal du indlæse den ene kuvette med 115 mikroliter ultrarent vand og den anden kuvette med 115 mikroliter af peptidprøven, samtidig med at det sikres, at der ikke er luftbobler i kuvetterne, da disse vil forstyrre signalet. Derefter anbringes kuvetten med ultrarent vand i referencestrålen og kuvetten med peptid i prøvestrålen.Derefter samles absorptionsspektret af det metalfrie peptid. Der tilsættes en substoichiometrisk mængde Cu(II)-opløsning i kuvetten med peptidprøven, og volumen registreres til analyse senere. Rør det forsigtigt op og ned for at blande opløsningen, mens du undgår generering af luftbobler.Efter ækvilibrering i fem minutter sættes kuvetten tilbage i prøvecelleholderen og registrerer absorptionsspektret. Gentag derefter tilsætningen af Cu(II)aliquots i peptidopløsningen for forskellige ækvivalenter, og det samlede volumen Cu(II)tilsat kuvetten registreres. Efter initialisering af softwaren som beskrevet tidligere i to matchede kuvetter indlæses en kuvette med 115 mikroliter ultrarent vand og anden kuvette med 115 mikroliter af kobber-phen kompleks opløsning.Kuvetten anbringes med vand i referencestrålen og kuvetten med kobber-phen kompleks opløsning i prøvestrålen. Derefter samles absorptionsspektret af metalligandkomplekset. Derefter tilsættes en støkiometrisk mængde peptid til kobber-phen kompleksopløsningen og forsigtigt rør det op og ned for at blande grundigt, mens du er forsigtig med ikke at indføre luftbobler.Derefter inkuberes opløsningen i fem minutter for at nå ligevægt. Sæt kuvetten tilbage i prøvecelleholderen og registrer absorptionsspektret. Senere gentages tilsætningen af peptidaliquoter i kobber-phen-kompleksopløsningen for forskellige ækvivalenter, og der registreres mængden af tilsat peptid, så den fortyndede koncentration kan bestemmes.Tænd først ITC og start ITC-softwaren for at køre instrumentet. Efter den første initialisering skal du genhuse buretten og følge instruktionerne på skærmen. Fjern derefter buretten og dækslet fra referencecellen.Fjern derefter vand fra referencecellen og skyl tre gange med 450 mikroliter afgasset ultrarent vand. Træk langsomt ultrarent vand op til 450 mikroliter mærket på en læssesprøjte, og pas på ikke at indføre luftbobler i sprøjten. Indsæt derefter injektionssprøjten i referencecellen, indtil den er ca. en millimeter fra bunden, og injicer langsomt en del af opløsningen, indtil der er 150 mikroliter tilbage i påfyldningssprøjten.Flyt derefter læssesprøjtestemplet hurtigt op og ned med ca. 25 mikroliter flere gange for at fjerne eventuelle bobler på celleoverfladen. Derefter injiceres langsomt, indtil stemplet når 100 mikroliter mærket på påfyldningssprøjten, hvorved i alt 350 mikroliter ultrarent vand udleveres i referencecellen, og referencecelledækslet udskiftes. Efter fjernelse af en eventuel restopløsning fra prøvecellen indlæses 450 mikroliter 10 millimolar EDTA ved hjælp af en injektionssprøjte og blødlægges i 10 minutter for at sikre, at spormetalioner fjernes, fordi EDTA binder spormetaller.Efter fjernelse af EDTA-opløsningen skylles injektionssprøjten grundigt med rigelige mængder ultrarent vand. ITC rengøres i overensstemmelse med producentens anvisninger ved at skylle prøvecellen med ultrarent vand. Fjern eventuelt resterende vand fra prøvecellen, og konditioner derefter prøvecellen ved at skylle med 450 mikroliter buffer mindst tre gange.Fjern derefter den resterende buffer, der konditionerer prøvecellen, og læg peptidopløsningen i prøvecellen ved hjælp af påfyldningssprøjten. Skyl derefter titreringssprøjten med 200 mikroliter bufferopløsning ved først at fjerne stemplet. Brug en mikropipette til at lede bufferopløsningen gennem hullet øverst på glastitreringssprøjten gennem sprøjten og ud af kanylen nedenunder.Senere indsættes stemplet helt i titreringssprøjten. Dypp derefter spidsen af titreringssprøjtenålen i metalopløsningen, og træk langsomt stemplet op, hvilket får metalopløsningen til at fylde sprøjten og resulterer i et tomrumsvolumen øverst på glasdelen af titreringssprøjten. For at fjerne tomrumsvolumenet drejes titreringssprøjten parallelt med gulvet.Fjern derefter stemplet, og vip glasdelen let mod gulvet. Ryst forsigtigt titreringssprøjten, så opløsningen bevæger sig til glasdelen af titreringssprøjten og fylder det meste af tomrumsvolumenet. Men sørg for, at to til tre mikroliter tomrumsvolumen forbliver.Mens sprøjten holdes parallelt med gulvet, indsættes stemplet igen. Hold derefter titreringssprøjten oprejst, og dypp spidsen af nålen tilbage i metalopløsningen. Skub derefter stemplet ned, indtil luft ophører med at komme ud af nålen, og læg titreringssprøjten ved langsomt at trække stemplet op til lige over 50 mikroliter-mærket, mens nålens spids holdes i opløsningen.Indsæt forsigtigt glasdelen af titreringssprøjten i buretten, og skru, indtil fingeren er stram. Derefter absorberes den opløsning, der kommer ud af titreringssprøjten, ved hjælp af en let delikat visker på grund af kompression af stemplet uden at røre spidsen af nålen. Indsæt derefter buretten med en titreringssprøjte i prøvecellen og fastgør den sikkert.For at konfigurere parametrene for ITC-softwaren skal du vælge Instrumentstyring. Indstil omrøringshastigheden og temperaturen. Indtast derefter sprøjten og cellekoncentrationerne i millimolære enheder under Eksperimentdetaljer.Vælg derefter Inkrementel titrering i afsnittet Eksperimentmetode. Klik på Opsætning og angiv 20 injektioner på 2,5 mikroliter, og hvis der kræves mere opløsning for at observere bindingshændelsen, skal du øge antallet af injektioner og reducere volumenet pr. Injektion. Indtast derefter tidsafstanden mellem hver injektion, så den er lang nok til, at signalet balancerer og vender tilbage til baseline, typisk 300 sekunder.Klik derefter på knappen Kør for at starte eksperimentet og angive, hvor dataene gemmes. Titrering af Cu(II)blev udført til C-peptid, hvilket viste, at tilsætningen af 150 mikromolære Cu(II) forårsagede en øjeblikkelig stigning i båndet ved 600 nanometer, der tilskrives d-d-båndet af Cu(II), og fortsatte med at stige, indtil 300 millimolar Cu(II) blev tilføjet. Yderligere tilsætning over 300 mikromolære Cu(II)øgede ikke absorptionen af d-d-forbuddet, der indikerer mætning, og at Cu(II)binder til C-peptid i et 1:1-kompleks med en log K-værdi på mere end seks.C-peptid blev titreret til ca. 10 mikromolære kobber-phen-komplekser, og absorptionen fra ladningsoverførselsbåndet ved 265 nanometer faldt, hvilket indikerer, at C-peptidet var i stand til at chelate Cu (II) fra phenanthrolinliganden med en log K-værdi på 7,4 til 7,8. ITC-termogrammet viser titreringen af 1,4 millimolar Cu(II)i 154 mikromolære C-peptid i 15 millimolær MOPS-buffer. Bindingsaffiniteten viste sig at have en log K-værdi på otte med ændring i entalpi som 8 kilojoule pr. Mol.Gibbs fri energi som minus 46 kilojoule pr. mol, og ændring i entropi som 120 joule pr. mol pr. kelvin. En kontrolleret titrering af 1,4 millimolar Cu(II)i 15 millimolar MOPS-buffer i fravær af C-peptid viser ingen binding i termogrammet. Jeg vil sige at sørge for, at alt er rent.Hvis der er metalioner eller peptider tilbage fra tidligere eksperimenter, kan det drastisk påvirke støkiometrien og give ukendt konkurrence i bindingsforsøgene. Cirkulær dikroisme er en anden metode til at studere metalpeptid eller metalproteininteraktioner, fordi den ser på chiralitet. Massespektrometri kan også forhøre disse komplekser ved at se på ændringer i masse.Dette sæt teknikker er blevet brugt af mange laboratorier, der studerer metalioner, der interagerer med peptider eller proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiseret Akustisk Udlevering til seriel fortynding af peptid agonister i Potens Bestemmelse assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse af høj-affinitet antistof-antigen Bindende Kinetics Brug Fire Biosensor Platforme

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Personlig peptid Arrays for påvisning af HLA Alloantibodies i organtransplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering påvisning af LRRK2 aktivitet ved hjælp af SDS-PAGE med en fosfat-bindende Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

En direkte kraft sonde til at måle mekanisk Integration mellem kernen og cytoskelettet

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraktionering af U937 celler i mangel af højhastighedstog centrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...