Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
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SC remercie la bourse de recherche d’été Whitehead. MJS remercie les Startup Funds et le Faculty Development Fund de l’Université de San Francisco. MCH reconnaît le financement des National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) et de la National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

1. Spectroscopie d’absorption électronique : titrage direct avec compétition tampon
<ol><li>Préparation des échantillons<ol>
<li>Préparer une solution tamponnée de 50 mM de 2-[bis(2-hydroxyéthyl)amino]-2-(hydroxyméthyl)propane-1,3-diol (bisTris) à pH 7,4 en utilisant de l’eau ultrapure (résistance >18 MΩ). Éliminer les ions métalliques traces en incubant avec une résine à haute affinité pendant au moins 2 h avec filtration ultérieure.</li>
		<li>Dissoudre ou diluer une quantité co...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. 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H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

Cet article fournit une méthode robuste pour quantifier l’affinité et la thermodynamique de la liaison cu(II) aux peptides. Les complexes avec Cu(II) sont parfaitement adaptés pour surveiller la bande d’absorption d-d sur le site métallique en raison de sa configuration électronique d9 . Bien que le coefficient d’extinction soit faible, nécessitant ainsi de plus grandes concentrations du complexe pour produire un signal fiable, les titrages de Cu(II) en peptide peuvent rapidement fournir un aperçu...

La biologie a évolué pour utiliser la chimie diversifiée des ions métalliques nécessaires à l’adaptation et à la survie de la vie dans son environnement. On estime que 25% à 50% des protéines utilisent des ions métalliques pour la structure et la fonction1. Le rôle particulier et l’état redox de l’ion métallique sont directement liés à la composition et à la géométrie des ligands biologiques qui le coordonnent. En outre, les ions métalliques redox-actifs tels que Cu(II) doivent être étroitement régulés de peur qu’ils n’interagissent avec les agents oxydants via une chimie de type Fenton pour former des espèces réactives de l’oxygène (ROS)2,3,4. Comprendre les modes de liaison et l’affinité qui sous-tendent sa biochimie devrait aider à élucider le rôle biologique de l’ion métallique.
De nombreuses techniques sont utilisées pour étudier les interactions de liaison des métaux et des peptides. Il s’agit principalement de techniques spectroscopiques, mais elles comprennent également des simulations informatiques utilisant la dynamique moléculaire, comme en témoignent les interactions Cu(II) avec un fragment de bêta-amyloïde (Aβ)5. Une technique spectroscopique largement utilisée et accessible à de nombreuses universités est la résonance magnétique nucléaire (RMN). En utilisant la nature paramagnétique de Cu(II), Gaggelli et al. ont pu montrer où l’ion métallique se lie sur un pétide par relaxation des noyaux voisins6. La résonance paramagnétique électronique (EPR) peut également être utilisée pour sonder l’emplacement et le mode de liaison des ions métalliques paramagnétiques7. D’autres techniques spectroscopiques telles que le dichroïsme circulaire (CD) peuvent décrire la coordination autour de Cu(II) dans des systèmes tels que les systèmes tripeptides8, et la spectrométrie de masse peut montrer la stœchiométrie et les résidus auxquels l’ion métallique est coordonné par des modèles de fragmentation 9,10.
Certaines de ces techniques, telles que la RMN, sont sans étiquette, mais nécessitent de grandes concentrations de peptides, ce qui pose des défis pour l’étude. Une autre technique courante appelée spectroscopie de fluorescence a été utilisée pour relier la position d’une tyrosine ou d’un tryptophane à la trempe à partir d’un Cu(II)11,12. De même, cette technique peut montrer des changements structurels à la suite de la liaison Cu(II)13. Cependant, les défis avec ces études de liaison métal-peptide sont qu’ils sondent les acides aminés chromophoriques tels que la tyrosine que tous les systèmes n’ont pas, que l’ion métallique se lie sous un modèle classique, et que la technique peut ne pas être propice dans des conditions physiologiques. En effet, plusieurs peptides émergent qui ne contiennent pas de tels acides aminés chromophoriques ou se lient selon les modèles classiques, empêchant l’utilisation de ces techniques14,15. Cet article détaille les approches pour évaluer les propriétés de liaison dans ces scénarios dans des conditions physiologiquement pertinentes.
Les ligands biologiques peuvent adopter différents états de protonation qui peuvent affecter la liaison aux ions métalliques tels que l’anneau imidazole sur l’histidine. Si le pH n’est pas maintenu de manière constante, les résultats peuvent être alambiqués ou contradictoires. Pour cette raison, les tampons sont un composant essentiel dans l’étude des interactions métal-protéine/peptide. Cependant, il a été démontré que de nombreux tampons interagissent favorablement avec les ions métalliques16,17. En plus de rivaliser avec la molécule biologique d’intérêt, le tampon peut avoir des atomes de coordination similaires qui peuvent être difficiles à distinguer des atomes de coordination du peptide ou de la protéine. Dans cette étude, l’accent est mis sur la spectroscopie d’absorption électronique et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) en tant que deux techniques complémentaires pour étudier les interactions Cu(II)-peptide, avec des considérations particulières concernant le choix du tampon.
La spectroscopie d’absorption électronique est une technique rapide et largement accessible pour étudier les interactions de liaison des métaux. L’irradiation avec de la lumière dans les longueurs d’onde ultraviolettes (UV) ou visibles peut entraîner l’absorption de bandes d-d centrées sur le métal, qui fournissent des informations précieuses sur la classification des ligands, les géométries des métaux et les affinités de liaison apparentes18,19. Pour ces complexes, les titrages directs d’ions métalliques dans des solutions protéiques ou peptidiques peuvent quantifier les stœchiométries de liaison et les affinités de liaison apparentes. Dans certains cas, comme les configurations d’électrons d5 ou d10, le complexe n’absorbe pas la lumière (c.-à-d. est spectroscopiquement silencieux). Dans ces complexes de métaux de transition spectroscopiquement silencieux, ces limitations peuvent être contournées en utilisant un ligand concurrent qui, lors de la coordination avec l’ion métallique, donne des bandes de transfert de charge détectables. Dans les deux cas, cette approche se limite à quantifier uniquement la stœchiométrie et l’affinité de liaison apparente, et aucun aperçu de l’enthalpie de liaison n’est fourni sans approximations.
Complétant les informations obtenues par spectroscopie d’absorption électronique, l’ITC est une technique attrayante pour la quantification directe et rigoureuse de l’enthalpie de liaison20. L’ITC mesure directement la chaleur libérée ou consommée lors d’un événement de liaison et, puisque le titrage a lieu à pression constante, la chaleur mesurée est l’enthalpie de tous les équilibres (ΔHITC). De plus, la stœchiométrie de l’événement de liaison (n) et l’affinité de liaison apparente (KITC) sont quantifiées. À partir de ces paramètres, l’énergie libre (ΔGITC) et l’entropie (ΔSITC) sont déterminées, fournissant un instantané thermodynamique de l’événement de liaison. Comme il ne repose pas sur l’absorption de la lumière, l’ITC est une technique idéale pour les espèces spectroscopiquement silencieuses, par exemple, les complexes d’ions métalliques d5 ou d10 . Cependant, étant donné que la calorimétrie mesure la chaleur, tout système tampon non apparié et tout équilibre non comptabilisé peuvent nuire à l’analyse visant à déterminer avec précision la thermodynamique de liaison aux ions métalliques, et il faut prendre grand soin de traiter ces facteurs20. S’il est effectué avec la rigueur appropriée, l’ITC est une technique robuste pour déterminer la thermodynamique des complexes métal-protéine/peptide.
Ici, un peptide de liaison au cuivre chromophoriquement silencieux, le C-peptide, est utilisé pour démontrer l’utilisation complémentaire des deux techniques. Le peptide C est un produit de clivage de 31 résidus (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formé pendant la maturation de l’insuline; il manque de résidus chromophoriques mais il a été démontré qu’il lie le Cu(II) avec une affinité physiologiquement pertinente14,15. Le site de liaison Cu(II) est constitué des chaînes latérales d’un glutamate et d’un aspartate ainsi que du N-terminus du peptide14,15. Ces atomes de coordination ressemblent beaucoup à ceux de nombreux systèmes tampons couramment utilisés. Ici, l’utilisation en tandem des bandes d-d et de transfert de charge en spectroscopie d’absorption électronique et ITC dans la quantification de la thermodynamique de liaison Cu(II) au peptide C est montrée. L’approche de l’étude de la liaison Cu(II) au peptide C peut être appliquée à d’autres ions métalliques et systèmes protéine/peptide.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

Le cuivre(II) est un métal essentiel dans les systèmes biologiques, conférant des propriétés chimiques uniques aux biomolécules avec lesquelles il interagit. Il a été rapporté qu’il se lie directement à une variété de peptides et joue des rôles à la fois nécessaires et pathologiques allant de la structure médiatrice aux propriétés de transfert d’électrons en passant par la transmission de la fonction catalytique. La quantification de l’affinité de liaison et de la thermodynamique de ces complexes Cu(II)-peptide in vitro donne un aperçu de la force motrice thermodynamique de la liaison, des compétitions potentielles entre différents ions métalliques pour le peptide ou entre différents peptides pour Cu(II), et de la prévalence du complexe Cu(II)-peptide in vivo. Cependant, la quantification de la thermodynamique de liaison peut être difficile en raison d’une myriade de facteurs, y compris la prise en compte de tous les équilibres concurrents dans une expérience de titrage, en particulier dans les cas où il y a un manque de poignées spectroscopiques discrètes représentant le peptide, l’ion métallique d-bloc et leurs interactions.
Ici, un ensemble robuste d’expériences est fourni pour la quantification précise de la thermodynamique des peptides Cu(II). Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique en présence et en l’absence de ligands chromophoriques pour fournir la poignée spectroscopique nécessaire sur Cu(II) et l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme sans étiquette. Dans les deux techniques expérimentales, un processus est décrit pour tenir compte de tous les équilibres concurrents. Bien que cet article se concentre sur le Cu(II), l’ensemble d’expériences décrites peut s’appliquer au-delà des interactions Cu(II)-peptide et fournir un cadre pour une quantification précise d’autres systèmes métal-peptide dans des conditions physiologiquement pertinentes.

L’objectif était de quantifier et de corroborer la thermodynamique de la liaison du Cu(II) au peptide C en utilisant les techniques complémentaires de spectroscopie d’absorption électronique et d’ITC. En raison de la nature robuste de la spectroscopie d’absorption électronique, un titrage direct de Cu(II) en peptide C de 300 μM a été effectué (Figure 1). L’ajout de 150 μM de Cu(II) a provoqué une augmentation immédiate de la bande à 600 nm, attribuée à la bande d-d de...

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Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Cet article se concentre sur l’utilisation de la spectroscopie d’absorption électronique et de la calorimétrie de titrage isotherme pour sonder et quantifier la thermodynamique de la liaison du Cu(II) aux peptides et aux protéines.

Quantifier les interactions de liaison entre le Cu(II) et les résidus peptidiques en présence et en absence de chromophores

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Cette méthode permettra au chercheur de sonder des systèmes difficiles à étudier, tels que les peptides et les ions de métaux de transition de première rangée, qui sont généralement difficiles à utiliser des applications plus standard. Le principal avantage ici est d’utiliser des techniques orthogonales car elles se complètent bien, ce qui peut donner plus d’informations sur le système et nous aider à ne manquer aucun phénomène. La méthode détaillée dans cette vidéo est très bien adaptée à l’étude d’autres systèmes.Bien que nous le montrions avec Cu(II) et un peptide, il peut être utilisé pour de nombreuses interactions différentes entre peptide métallique et protéine métallique. Je pense que la partie la plus difficile sera de trouver un bon choix de tampon pour votre ion métallique et votre peptide. Je consulterais la littérature pour voir quels tampons ont été utilisés par d’autres auparavant.Sohee Choi, une étudiante diplômée de mon laboratoire de recherche, fera la démonstration de la procédure. Pour commencer, allumez le spectrophotomètre d’absorption électronique et laissez-le chauffer pendant environ 15 à 20 minutes avant utilisation. Ensuite, lancez le logiciel du spectrophotomètre et configurez les paramètres, tels que la plage de balayage de 200 à 900 nanomètres, la plage de balayage de 200 nanomètres par seconde et la ligne de base à double faisceau corrigée.Ensuite, collectez une ligne de base sans cuvettes ni échantillons dans les trajets du faisceau. À l’aide de deux cuvettes assorties dans le spectrophotomètre à double faisceau, chargez une cuvette avec 115 microlitres d’eau ultrapure et l’autre cuvette avec 115 microlitres de l’échantillon de peptide tout en vous assurant qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les cuvettes car celles-ci interféreront avec le signal. Ensuite, placez la cuvette avec de l’eau ultrapure dans le faisceau de référence et la cuvette avec peptide dans le faisceau d’échantillon.Ensuite, collectez le spectre d’absorption du peptide sans métal. Ajouter une quantité substœchiométrique de la solution de Cu(II) dans la cuvette avec l’échantillon de peptide et enregistrer le volume pour analyse ultérieure. Faites-le doucement monter et descendre pour mélanger la solution tout en évitant la génération de bulles d’air.Après avoir équilibré pendant cinq minutes, remettre la cuvette dans le porte-cellule d’échantillon et enregistrer le spectre d’absorption. Répétez ensuite l’addition de Cu(II)aliquotes dans la solution peptidique pour divers équivalents et notez le volume total de Cu(II) ajouté à la cuvette. Après avoir initialisé le logiciel comme décrit précédemment dans deux cuvettes appariées, chargez une cuvette avec 115 microlitres d’eau ultra pure et une autre cuvette avec 115 microlitres de la solution complexe cuivre-phén.Placer la cuvette avec de l’eau dans le faisceau de référence et la cuvette avec une solution complexe cuivre-phén dans le faisceau d’échantillonnage. Ensuite, collectez le spectre d’absorption du complexe de ligand métallique. Ensuite, ajoutez une quantité stœchiométrique de peptide à la solution complexe cuivre-phén et canalisez doucement de haut en bas pour bien mélanger tout en veillant à ne pas introduire de bulles d’air.Ensuite, incuber la solution pendant cinq minutes pour atteindre l’équilibre. Remettez la cuvette dans le porte-cellule d’échantillon et enregistrez le spectre d’absorption. Plus tard, répétez l’ajout d’aliquotes peptidiques dans la solution complexe cuivre-phén pour divers équivalents et notez le volume de peptide ajouté afin que la concentration diluée puisse être déterminée.Allumez d’abord l’ITC et lancez le logiciel ITC pour faire fonctionner l’instrument. Après la première initialisation, relogez la burette et suivez les instructions à l’écran. Retirez ensuite la burette et le couvercle de la cellule de référence.Ensuite, retirez l’eau de la cellule de référence et rincez trois fois avec 450 microlitres d’eau ultra pure dégazée. Aspirez lentement de l’eau ultra pure jusqu’à la marque de 450 microlitres d’une seringue de chargement en prenant soin de ne pas introduire de bulles d’air dans la seringue. Insérez ensuite la seringue de chargement dans la cellule de référence jusqu’à ce qu’elle soit à environ un millimètre du fond et injectez lentement une partie de la solution jusqu’à ce qu’il reste 150 microlitres dans la seringue de chargement.Ensuite, déplacez le piston de la seringue de chargement rapidement de haut en bas d’environ 25 microlitres plusieurs fois pour déloger les bulles à la surface de la cellule. Ensuite, injectez lentement jusqu’à ce que le piston atteigne la marque des 100 microlitres sur la seringue de chargement, distribuant ainsi un total de 350 microlitres d’eau ultra pure dans la cellule de référence et remplacez le couvercle de la cellule de référence. Après avoir retiré toute solution résiduelle de la cellule d’échantillon, chargez 450 microlitres d’EDTA 10 millimolaires à l’aide d’une seringue de chargement et faites tremper pendant 10 minutes pour vous assurer que les ions de métaux traces sont éliminés, car l’EDTA liera les métaux traces.Après avoir retiré la solution d’EDTA, rincez soigneusement la seringue de chargement avec de grandes quantités d’eau ultra pure. Nettoyez l’ITC conformément aux instructions du fabricant en rinçant la cellule d’échantillon avec de l’eau ultra pure. Retirer toute eau résiduelle de la cellule d’échantillon, puis conditionner la cellule d’échantillon en rinçant avec 450 microlitres de tampon au moins trois fois.Ensuite, retirez le tampon résiduel qui conditionne la cellule échantillon et chargez la solution peptidique dans la cellule d’échantillon à l’aide de la seringue de chargement. Rincez ensuite la seringue de titrage avec 200 microlitres de la solution tamponnée en retirant d’abord le piston. À l’aide d’une micropipette, pipeter la solution tampon à travers le trou situé sur le dessus de la seringue de titrage en verre à travers la seringue et sortir l’aiguille en dessous.Plus tard, insérez complètement le piston dans la seringue de titrage. Ensuite, trempez l’extrémité de l’aiguille de la seringue de titrage dans la solution métallique et tirez lentement le piston vers le haut, ce qui fait que la solution métallique remplit la seringue et entraîne un volume vide au sommet de la partie verre de la seringue de titrage. Pour éliminer le volume vide, tournez la seringue de titrage parallèlement au sol.Retirez ensuite le piston et inclinez légèrement la partie vitrée vers le sol. Agiter doucement la seringue de titrage afin que la solution se déplace vers la partie verre de la seringue de titrage et remplisse la majeure partie du volume vide. Mais assurez-vous qu’il reste deux à trois microlitres de volume vide.Tout en gardant la seringue parallèle au sol, réinsérez le piston. Tenez ensuite la seringue de titrage à la verticale et replongez l’extrémité de l’aiguille dans la solution métallique. Ensuite, poussez le piston vers le bas jusqu’à ce que l’air cesse de sortir de l’aiguille et chargez la seringue de titrage en tirant lentement vers le haut jusqu’à ce que juste au-dessus de la marque des 50 microlitres tout en gardant l’extrémité de l’aiguille dans la solution.Insérez délicatement la partie en verre de la seringue de titrage dans la burette et vissez jusqu’à ce que les doigts soient serrés. Ensuite, à l’aide d’un essuie-glace léger et délicat, absorbez la solution qui sort de la seringue de titrage en raison de la compression du piston sans toucher le bout de l’aiguille. Ensuite, insérez la burette avec une seringue de titrage dans la cellule d’échantillon et fixez-la solidement.Pour configurer les paramètres du logiciel ITC, sélectionnez Instrument Control. Régler la vitesse d’agitation et la température. Ensuite, sous Détails de l’expérience, entrez les concentrations de la seringue et de la cellule en unités millimolaires.Ensuite, dans la section Méthode d’expérience, sélectionnez Titrage incrémentiel. Cliquez sur Configuration et spécifiez 20 injections de 2,5 microlitres et si une plus grande résolution est nécessaire pour observer l’événement de liaison, augmentez le nombre d’injections et diminuez le volume par injection. Ensuite, entrez l’espacement temporel entre chaque injection afin qu’il soit suffisamment long pour que le signal s’équilibre et revienne à la ligne de base, généralement 300 secondes.Cliquez ensuite sur le bouton Exécuter pour démarrer l’expérience et spécifier l’emplacement d’enregistrement des données. Le titrage du Cu(II) a été effectué dans le peptide C, démontrant que l’ajout de 150 micromolaires de Cu(II) provoquait une augmentation immédiate de la bande à 600 nanomètres attribuée à la bande d-d de Cu(II) et continuait d’augmenter jusqu’à ce que 300 millimolaires de Cu(II) soient ajoutés. Un ajout supplémentaire supérieur à 300 micromolaires de Cu(II) n’a pas augmenté l’absorption de l’interdiction d-d indiquant une saturation et que le Cu(II) se lie au peptide C dans un complexe 1:1 avec une valeur log K supérieure à six.Le peptide C a été titré en environ 10 complexes cuivre-phén micromolaires et l’absorption de la bande de transfert de charge à 265 nanomètres a diminué, ce qui indique que le peptide C était capable de chélater le Cu(II) du ligand phénanthroline avec une valeur log K de 7,4 à 7,8. Le thermogramme ITC montre le titrage de 1,4 millimolaire Cu(II) en 154 micromolaires C-Peptide dans un tampon MOPS millimolaire. L’affinité de liaison s’est avérée avoir une valeur log K de huit avec un changement d’enthalpie de 8 kilojoules par mole.L’énergie libre de Gibbs est de moins 46 kilojoules par mole et le changement d’entropie de 120 joules par mole par kelvin. Un titrage contrôlé de 1,4 millimolaire Cu(II) dans un tampon MOPS millimolaire en l’absence de peptide C ne montre aucune liaison dans le thermogramme. Je dirais de s’assurer que tout est propre.S’il reste des ions métalliques ou des peptides d’expériences antérieures, cela peut affecter considérablement la stœchiométrie et fournir une compétition inconnue dans les expériences de liaison. Le dichroïsme circulaire est une autre méthode pour étudier les interactions entre peptides métalliques ou protéines métalliques, car il examine la chiralité. La spectrométrie de masse peut également interroger ces complexes en examinant les changements de masse.Cet ensemble de techniques a été utilisé par de nombreux laboratoires qui étudient les ions métalliques interagissant avec des peptides ou des protéines.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

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Recherche

Biochimie

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