Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
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SC dankt dem Whitehead Summer Research Fellowship. MJS dankt den Startup Funds und dem Faculty Development Fund an der University of San Francisco. MCH würdigt die Finanzierung durch die National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) und die National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

1. Elektronische Absorptionsspektroskopie: direkte Titration mit Pufferwettbewerb
<ol><li>Probenvorbereitung<ol>
<li>Es wird eine gepufferte Lösung von 50 mM2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(hydroxymethyl)propan-1,3-diol (bisTris) bei pH 7,4 unter Verwendung von Reinstwasser (>18 MΩ Beständigkeit) hergestellt. Entfernen Sie Spurenmetallionen, indem Sie mit einem hochaffinen Harz für mindestens 2 h mit anschließender Filtration inkubieren.</li>
		<li>Lösen oder verdünnen Sie eine bekannte Menge des...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

Dieser Artikel bietet eine robuste Methode zur Quantifizierung der Affinität und Thermodynamik der Cu(II)-Bindung an Peptide. Komplexe mit Cu(II) eignen sich aufgrund seiner d 9-Elektronenkonfiguration ideal zur Überwachung des d-d-Absorptionsbandes am Metallstandort. Obwohl der Extinktionskoeffizient klein ist und daher größere Konzentrationen des Komplexes erforderlich sind, um ein zuverlässiges Signal zu erhalten, können Titrationen von Cu(II) in Peptid schnell einen Einblick in die Bindungsstöchiome...

Die Biologie hat sich weiterentwickelt, um die vielfältige Chemie von Metallionen zu nutzen, die das Leben benötigt, um sich anzupassen und in seiner Umgebung zu überleben. Schätzungsweise 25%-50% der Proteine verwenden Metallionen für Struktur und Funktion1. Die besondere Rolle und der Redoxzustand des Metallions stehen in direktem Zusammenhang mit der Zusammensetzung und Geometrie der biologischen Liganden, die es koordinieren. Darüber hinaus müssen redoxaktive Metallionen wie Cu(II) streng reguliert werden, damit sie nicht über Fenton-ähnliche Chemie mit Oxidationsmitteln wechselwirken, um reaktive Sauerstoffspezies (ROS) zu bilden2,3,4. Das Verständnis der Bindungsmodi und der Affinität, die seine Biochemie antreiben, sollte dazu beitragen, die biologische Rolle des Metallions aufzuklären.
Viele Techniken werden verwendet, um die Bindungswechselwirkungen von Metallen und Peptiden zu untersuchen. Dies sind meist spektroskopische Techniken, umfassen aber auch Computersimulationen unter Verwendung der Molekulardynamik, wie sie durch Cu (II) -Wechselwirkungen mit einem Fragment von Amyloid-Beta (Aβ) 5 gesehen werden. Eine weit verbreitete spektroskopische Technik, die vielen Universitäten zugänglich ist, ist die Kernspinresonanz (NMR). Durch die Verwendung der paramagnetischen Natur von Cu(II) konnten Gaggelli et al. zeigen, wo das Metallion durch Relaxation der nahen Kerne6 an ein Petide bindet. Die paramagnetische Elektronenresonanz (EPR) kann auch verwendet werden, um den Ort und den Modus der paramagnetischen Metallionenbindung7 zu untersuchen. Andere spektroskopische Techniken wie der zirkuläre Dichroismus (CD) können die Koordination über Cu(II) in Systemen wie Tripeptidsystemen8 beschreiben, und die Massenspektrometrie kann die Stöchiometrie zeigen und auf welche Reste das Metallion durch Fragmentierungsmuster koordiniertwird 9,10.
Einige dieser Techniken, wie NMR, sind markierungsfrei, erfordern jedoch große Peptidkonzentrationen, was die Untersuchung vor Herausforderungen stellt. Eine andere gängige Technik, die als Fluoreszenzspektroskopie bezeichnet wird, wurde verwendet, um die Position eines Tyrosins oder Tryptophans mit dem Abschrecken aus einem Cu(II)11,12 in Beziehung zu setzen. In ähnlicher Weise kann diese Technik strukturelle Veränderungen als Folge der Cu(II)-Bindung13 zeigen. Die Herausforderungen bei diesen Metall-Peptid-Bindungsstudien bestehen jedoch darin, dass sie chromophore Aminosäuren wie Tyrosin untersuchen, die nicht alle Systeme haben, dass das Metallion unter einem klassischen Modell bindet und dass die Technik unter physiologischen Bedingungen möglicherweise nicht förderlich ist. In der Tat entstehen mehrere Peptide, die solche chromophoren Aminosäuren nicht enthalten oder nach klassischen Modellen binden, was die Verwendung dieser Techniken ausschließt14,15. Dieser Artikel beschreibt Ansätze zur Beurteilung von Bindungseigenschaften in diesen Szenarien unter physiologisch relevanten Bedingungen.
Biologische Liganden können verschiedene Protonierungszustände annehmen, die die Metallionenbindung beeinflussen können, wie z.B. den Imidazolring auf Histidin. Wenn der pH-Wert nicht konsequent aufrechterhalten wird, können die Ergebnisse verworren oder widersprüchlich sein. Aus diesem Grund sind Puffer ein wesentlicher Bestandteil bei der Untersuchung von Metall-Protein/Peptid-Wechselwirkungen. Es wurde jedoch gezeigt, dass viele Puffer günstig mit Metallioneninteragieren 16,17. Zusätzlich zum Wettbewerb mit dem interessierenden biologischen Molekül kann der Puffer ähnliche koordinierende Atome aufweisen, die von den koordinierenden Atomen des Peptids oder Proteins schwer zu unterscheiden sind. In dieser Studie liegt der Fokus auf der elektronischen Absorptionsspektroskopie und der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) als zwei komplementäre Techniken zur Untersuchung von Cu(II)-Peptid-Wechselwirkungen, mit besonderen Überlegungen zur Pufferwahl.
Die elektronische Absorptionsspektroskopie ist eine schnelle, allgemein zugängliche Technik zur Untersuchung von Metallbindungswechselwirkungen. Die Bestrahlung mit Licht in den ultravioletten (UV) oder sichtbaren Wellenlängen kann zur Absorption von metallzentrierten d-d-Bändern führen, die wertvolle Informationen über Ligandenklassifizierung, Metallgeometrien und scheinbare Bindungsaffinitätenliefern 18,19. Für diese Komplexe können direkte Titrationen von Metallionen in Protein- oder Peptidlösungen Bindungsstöchiometrien und scheinbare Bindungsaffinitäten quantifizieren. In einigen Fällen, wie z.B. d5 oder d10 Elektronenkonfigurationen, absorbiert der Komplex kein Licht (d.h. ist spektroskopisch stumm). In diesen spektroskopisch stillen Übergangsmetallkomplexen können diese Einschränkungen durch die Verwendung eines konkurrierenden Liganden umgangen werden, der bei Koordinierung auf das Metallion nachweisbare Ladungsübertragungsbänder ergibt. In beiden Fällen beschränkt sich dieser Ansatz darauf, nur die Stöchiometrie und die scheinbare Bindungsaffinität zu quantifizieren, und ohne Näherungen wird kein Einblick in die Bindungsenthalpie gegeben.
Ergänzend zu den Informationen aus der elektronischen Absorptionsspektroskopie ist ITC eine attraktive Technik zur direkten und rigorosen Quantifizierung der Bindungsenthalpie20. ITC misst direkt die während eines Bindungsereignisses freigesetzte oder verbrauchte Wärme, und da die Titration bei konstantem Druck stattfindet, ist die gemessene Wärme die Enthalpie aller Gleichgewichte (ΔHITC). Zusätzlich werden die Stöchiometrie des Bindungsereignisses (n) und der scheinbaren Bindungsaffinität (KITC) quantifiziert. Aus diesen Parametern werden die freie Energie (ΔG ITC) und die Entropie (ΔSITC) bestimmt, wodurch eine thermodynamische Momentaufnahme des Bindungsereignisses bereitgestellt wird. Da es nicht auf Lichtabsorption angewiesen ist, ist ITC eine ideale Technik für spektroskopisch stumme Spezies, zum Beispiel d5 oder d10 Metallionenkomplexe. Da die Kalorimetrie jedoch die Wärme misst, können unübertroffene Puffersysteme und nicht berücksichtigte Gleichgewichte die Analyse beeinträchtigen, um die Metallionenbindungsthermodynamik genau zu bestimmen, und es muss große Sorgfalt darauf verwendet werden, diese Faktoren anzugehen20. Wenn es mit der entsprechenden Strenge durchgeführt wird, ist ITC eine robuste Technik zur Bestimmung der Thermodynamik von Metall-Protein/Peptid-Komplexen.
Hier wird ein chromophorisch leises kupferbindendes Peptid, C-Peptid, verwendet, um die komplementäre Verwendung der beiden Techniken zu demonstrieren. C-Peptid ist ein 31-Restspaltprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ), das während der Insulinreifung gebildet wird; Es fehlen chromophore Rückstände, aber es wurde gezeigt, dass es Cu(II) mit physiologisch relevanter Affinität14,15 bindet. Die Cu(II)-Bindungsstelle besteht aus den Seitenketten eines Glutamats und eines Aspartats sowie dem N-Terminus des Peptids14,15. Diese koordinierenden Atome ähneln stark denen vieler häufig verwendeter gepufferter Systeme. Hier wird die Tandemverwendung der d-d- und Ladungstransferbänder in der elektronischen Absorptionsspektroskopie und ITC zur Quantifizierung der Cu(II)-Bindung der Thermodynamik an das C-Peptid gezeigt. Der Ansatz aus der Untersuchung der Cu(II)-Bindung an C-Peptid kann auf andere Metallionen und Protein/Peptid-Systeme angewendet werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

Kupfer(II) ist ein essentielles Metall in biologischen Systemen, das den Biomolekülen, mit denen es interagiert, einzigartige chemische Eigenschaften verleiht. Es wurde berichtet, dass es direkt an eine Vielzahl von Peptiden bindet und sowohl notwendige als auch pathologische Rollen spielt, von der Vermittlung der Struktur über Elektronentransfereigenschaften bis hin zur Vermittlung katalytischer Funktionen. Die Quantifizierung der Bindungsaffinität und Thermodynamik dieser Cu(II)-Peptidkomplexe in vitro liefert Einblicke in die thermodynamische Antriebskraft der Bindung, mögliche Wettbewerbe zwischen verschiedenen Metallionen für das Peptid oder zwischen verschiedenen Peptiden für Cu(II) und die Prävalenz des Cu(II)-Peptidkomplexes in vivo. Die Quantifizierung der Bindungsthermodynamik kann jedoch aufgrund einer Vielzahl von Faktoren eine Herausforderung darstellen, einschließlich der Berücksichtigung aller konkurrierenden Gleichgewichte innerhalb eines Titrationsexperiments, insbesondere in Fällen, in denen es an diskreten spektroskopischen Griffen mangelt, die das Peptid, das d-Block-Metallion und ihre Wechselwirkungen darstellen.
Hier wird ein robuster Satz von Experimenten zur genauen Quantifizierung der Cu(II)-Peptid-Thermodynamik bereitgestellt. Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung der elektronischen Absorptionsspektroskopie in Gegenwart und Abwesenheit von chromophoren Liganden, um den erforderlichen spektroskopischen Griff auf Cu (II) und die Verwendung der markierungsfreien isothermen Titrationskalorimetrie bereitzustellen. In beiden experimentellen Techniken wird ein Prozess beschrieben, der alle konkurrierenden Gleichgewichte berücksichtigt. Während der Schwerpunkt dieses Artikels auf Cu(II) liegt, kann der beschriebene Satz von Experimenten über Cu(II)-Peptid-Wechselwirkungen hinausgehen und einen Rahmen für die genaue Quantifizierung anderer Metall-Peptid-Systeme unter physiologisch relevanten Bedingungen bieten.

Ziel war es, die Thermodynamik der Cu(II)-Bindung an C-Peptid mit den komplementären Techniken der elektronischen Absorptionsspektroskopie und der ITC zu quantifizieren und zu bestätigen. Aufgrund der robusten Natur der elektronischen Absorptionsspektroskopie wurde eine direkte Titration von Cu(II) in 300 μM C-Peptid durchgeführt (Abbildung 1). Die Zugabe von 150 μM Cu(II) verursachte einen sofortigen Anstieg der Bande bei 600 nm, der der d-d-Bande von Cu(II) zugeschrieben wurde, und st...

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Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Verwendung der elektronischen Absorptionsspektroskopie und der isothermen Titrationskalorimetrie, um die Thermodynamik der Cu(II)-Bindung an Peptide und Proteine zu untersuchen und zu quantifizieren.

Quantifizierung der Bindungswechselwirkungen zwischen Cu(II)- und Peptidresten in Gegenwart und Abwesenheit von Chromophoren

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Diese Methode wird es dem Forscher ermöglichen, schwer zu untersuchende Systeme wie Peptide und Übergangsmetallionen der ersten Reihe zu untersuchen, die beide im Allgemeinen mit Standardanwendungen eine Herausforderung darstellen. Der Hauptvorteil hierbei ist die Verwendung orthogonaler Techniken, da sie sich gut ergänzen und uns mehr Einblick in das System geben und uns helfen können, kein Phänomen zu übersehen. Die in diesem Video beschriebene Methode eignet sich sehr gut, um andere Systeme zu untersuchen.Obwohl wir es mit Cu(II) und einem Peptid zeigen, kann es für viele verschiedene Metallpeptid- und Metallproteininteraktionen verwendet werden. Ich denke, der schwierigste Teil wird sein, eine gute Pufferwahl für Ihr Metallion und Peptid zu finden. Ich würde Literatur konsultieren, um zu sehen, welche Puffer zuvor von anderen verwendet wurden.Sohee Choi, eine Doktorandin in meinem Forschungslabor, demonstriert das Verfahren. Schalten Sie zunächst das elektronische Absorptionsspektralphotometer ein und lassen Sie es vor Gebrauch etwa 15 bis 20 Minuten erwärmen. Starten Sie dann die Spektralphotometer-Software und konfigurieren Sie die Parameter, z. B. den Scanbereich von 200 bis 900 Nanometern, den Scanbereich von 200 Nanometern pro Sekunde und die korrigierte Doppelstrahl-Baseline.Als nächstes sammeln Sie eine Basislinie ohne Küvetten oder Proben in den Strahlgängen. Verwenden Sie zwei aufeinander abgestimmte Küvetten im Doppelstrahl-Spektralphotometer, laden Sie eine Küvette mit 115 Mikrolitern Reinstwasser und die andere Küvette mit 115 Mikrolitern der Peptidprobe, wobei Sie sicherstellen, dass sich keine Luftblasen in den Küvetten befinden, da diese das Signal stören. Anschließend legen Sie die Küvette mit Reinstwasser in den Referenzstrahl und die Küvette mit Peptid in den Probenstrahl.Dann sammeln Sie das Absorptionsspektrum des metallfreien Peptids. Geben Sie eine substöchiometrische Menge der Cu(II)-Lösung in die Küvette mit der Peptidprobe und notieren Sie das Volumen für die spätere Analyse. Leiten Sie das vorsichtig auf und ab, um die Lösung zu mischen und gleichzeitig die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.Nach fünfminütiger Äquilibrierung die Küvette wieder in den Probenzellenhalter geben und das Absorptionsspektrum aufzeichnen. Wiederholen Sie dann die Zugabe von Cu(II)aliquots in die Peptidlösung für verschiedene Äquivalente und notieren Sie das Gesamtvolumen von Cu(II)zugabe in die Küvette. Nach der Initialisierung der Software wie zuvor beschrieben in zwei aufeinander abgestimmten Küvetten laden Sie eine Küvette mit 115 Mikrolitern Reinstwasser und eine andere Küvette mit 115 Mikrolitern der Kupfer-Phen-Komplexlösung.Legen Sie die Küvette mit Wasser in den Referenzstrahl und die Küvette mit Kupfer-Phen-Komplexlösung in den Probenstrahl. Dann sammeln Sie das Absorptionsspektrum des Metallligandenkomplexes. Danach fügen Sie der Kupfer-Phen-Komplexlösung eine stöchiometrische Menge Peptid hinzu und leiten Sie diese vorsichtig auf und ab, um gründlich zu mischen, wobei Sie darauf achten, keine Luftblasen einzuführen.Als nächstes inkubieren Sie die Lösung für fünf Minuten, um das Gleichgewicht zu erreichen. Stecken Sie die Küvette wieder in den Probenzellenhalter und notieren Sie das Absorptionsspektrum. Wiederholen Sie später die Zugabe von Peptidaliquoten in die Kupfer-Phen-Komplexlösung für verschiedene Äquivalente und notieren Sie das Volumen des hinzugefügten Peptids, damit die verdünnte Konzentration bestimmt werden kann.Schalten Sie zuerst die ITC ein und starten Sie die ITC-Software, um das Gerät auszuführen. Nach der ersten Initialisierung die Bürette wieder nach Hause nehmen und den Anweisungen auf dem Bildschirm folgen. Entfernen Sie dann die Bürette und die Abdeckung von der Referenzzelle.Als nächstes entfernen Sie Wasser aus der Referenzzelle und spülen Sie dreimal mit 450 Mikrolitern entgastem Reinstwasser. Ziehen Sie langsam Reinstwasser bis zur 450-Mikroliter-Marke einer Ladespritze auf und achten Sie darauf, keine Luftblasen in die Spritze einzuführen. Führen Sie dann die Ladespritze in die Referenzzelle ein, bis sie etwa einen Millimeter vom Boden entfernt ist, und injizieren Sie langsam einen Teil der Lösung, bis 150 Mikroliter in der Ladespritze verbleiben.Anschließend bewegen Sie den Spritzenkolben schnell um ca. 25 Mikroliter auf und ab, um Blasen auf der Zelloberfläche zu entfernen. Anschließend langsam injizieren, bis der Kolben die 100-Mikroliter-Marke auf der Ladespritze erreicht, dabei insgesamt 350 Mikroliter Reinstwasser in die Referenzzelle abgeben und die Referenzzellenabdeckung austauschen. Nach dem Entfernen der Restlösung aus der Probenzelle 450 Mikroliter 10 Millimolar EDTA mit einer Ladespritze laden und 10 Minuten einweichen, um sicherzustellen, dass Spurenmetallionen entfernt werden, da das EDTA Spurenmetalle bindet.Nach dem Entfernen der EDTA-Lösung spülen Sie die Ladespritze gründlich mit reichlich Reinstwasser ab. Reinigen Sie die ITC gemäß den Anweisungen des Herstellers, indem Sie die Probenzelle mit Reinstwasser spülen. Entfernen Sie Restwasser aus der Probenzelle und konditionieren Sie die Probenzelle dann mindestens dreimal mit 450 Mikrolitern Puffer.Als nächstes entfernen Sie den Restpuffer, der die Probenzelle konditioniert, und laden die Peptidlösung mit der Ladespritze in die Probenzelle. Spülen Sie dann die Titrationsspritze mit 200 Mikrolitern der gepufferten Lösung, indem Sie zuerst den Kolben entfernen. Pipettieren Sie die Pufferlösung mit einer Mikropipette durch das Loch oben in der Glastitrationsspritze durch die Spritze und aus der Nadel darunter.Führen Sie später den Kolben vollständig in die Titrationsspritze ein. Tauchen Sie dann die Spitze der Titrationsspritzennadel in die Metalllösung und ziehen Sie den Kolben langsam nach oben, wodurch die Metalllösung die Spritze füllt und ein Hohlraumvolumen an der Oberseite des Glasteils der Titrationsspritze entsteht. Um das Hohlraumvolumen zu entfernen, drehen Sie die Titrationsspritze parallel zum Boden.Entfernen Sie dann den Kolben und neigen Sie den Glasteil leicht zum Boden. Schütteln Sie die Titrationsspritze vorsichtig, so dass sich die Lösung zum Glasteil der Titrationsspritze bewegt und den größten Teil des Hohlraumvolumens ausfüllt. Stellen Sie aber sicher, dass zwei bis drei Mikroliter Hohlraumvolumen übrig bleiben.Während Sie die Spritze parallel zum Boden halten, setzen Sie den Kolben wieder ein. Halten Sie dann die Titrationsspritze aufrecht und tauchen Sie die Nadelspitze wieder in die Metalllösung. Als nächstes drücken Sie den Kolben nach unten, bis keine Luft mehr aus der Nadel kommt, und laden Sie die Titrationsspritze, indem Sie den Kolben langsam bis knapp über die 50-Mikroliter-Marke ziehen, während Sie die Nadelspitze in der Lösung halten.Führen Sie den Glasteil der Titrationsspritze vorsichtig in die Bürette ein und schrauben Sie ihn fest, bis der Finger fest ist. Anschließend absorbieren Sie mit einem leichten empfindlichen Scheibenwischer die Lösung, die aufgrund der Kompression des Kolbens aus der Titrationsspritze kommt, ohne die Nadelspitze zu berühren. Als nächstes führen Sie die Bürette mit einer Titrationsspritze in die Probenzelle ein und befestigen Sie sie sicher.Um die Parameter der ITC-Software einzustellen, wählen Sie die Gerätesteuerung. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit und die Temperatur ein. Geben Sie dann unter Experimentdetails die Spritzen- und Zellkonzentrationen in Millimolareinheiten ein.Wählen Sie anschließend im Abschnitt Experimentmethode die Option Inkrementelle Titration aus. Klicken Sie auf Setup und geben Sie 20 Injektionen von 2,5 Mikrolitern an und wenn mehr Auflösung erforderlich ist, um das Bindungsereignis zu beobachten, erhöhen Sie die Anzahl der Injektionen und verringern Sie das Volumen pro Injektion. Geben Sie anschließend den Zeitabstand zwischen jeder Injektion ein, so dass er lang genug ist, damit sich das Signal ausgleicht und zum Ausgangswert zurückkehrt, normalerweise 300 Sekunden.Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ausführen, um das Experiment zu starten und anzugeben, wo die Daten gespeichert werden. Die Titration von Cu(II) wurde in C-Peptid durchgeführt, was zeigt, dass die Zugabe von 150 Mikromolar Cu(II) einen sofortigen Anstieg der Bande bei 600 Nanometern verursachte, die der d-d-Bande von Cu(II) zugeschrieben wird, und weiter zunahm, bis 300 Millimolar Cu(II) hinzugefügt wurden. Eine weitere Zugabe über 300 Mikromol Cu(II) erhöhte nicht die Absorption des d-d-Bans, was auf eine Sättigung hinweist und dass Cu(II) an C-Peptid in einem 1:1-Komplex mit einem logarithmischen K-Wert von mehr als sechs bindet.C-Peptid wurde in etwa 10 Mikromolaren Kupfer-Phen-Komplex titriert und die Absorption aus dem Ladungstransferband bei 265 Nanometern nahm ab, was darauf hindeutet, dass das C-Peptid in der Lage war, Cu(II) aus dem Phenanthrolinliganden mit einem log K-Wert von 7,4 bis 7,8 zu chelatieren. Das ITC-Thermogramm zeigt die Titration von 1,4 Millimolar Cu(II) in 154 mikromolare C-Peptide in 15 Millimolar MOPS-Puffer. Es wurde festgestellt, dass die Bindungsaffinität einen logarithmischen K-Wert von acht mit einer Änderung der Enthalpie von 8 Kilojoule pro Mol aufweist.Gibbs freie Energie als minus 46 Kilojoule pro Mol und Änderung der Entropie als 120 Joule pro Mol pro Kelvin. Eine kontrollierte Titration von 1,4 Millimolar Cu(II) in 15 Millimolar MOPS-Puffer in Abwesenheit von C-Peptid zeigt keine Bindung im Thermogramm. Ich würde sagen, dass alles sauber ist.Wenn Metallionen oder Peptide aus früheren Experimenten übrig bleiben, kann dies die Stöchiometrie drastisch beeinflussen und zu einer unbekannten Konkurrenz in den Bindungsexperimenten führen. Der Zirkulardichroismus ist eine weitere Methode zur Untersuchung von Metallpeptid- oder Metallproteinwechselwirkungen, da er die Chiralität betrachtet. Die Massenspektrometrie kann diese Komplexe auch abfragen, indem sie Massenänderungen betrachtet.Diese Technik wurde von vielen Labors verwendet, die Metallionen untersuchen, die mit Peptiden oder Proteinen interagieren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatische Acoustic Verzicht für die serielle Verdünnung von Peptid-Agonisten im Potency Bestimmung Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Forschung

Biochemie

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestimmung der hochaffine Antikörper-Antigen-Bindung Kinetics mit vier Biosensorplattformen

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Personalisierte Peptidarrays für die Erkennung von HLA Alloantibodies in Organtransplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Eine direkte Kraft-Sonde zur Messung der mechanischen Integration zwischen dem Kern und dem Zytoskelett

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Zelle Fraktionierung von U937 Zellen in der Abwesenheit von High-Speed-Zentrifugation

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...