Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

SC מודה למלגת מחקר הקיץ של וייטהד. MJS מודה לקרנות הסטארט-אפ ולקרן לפיתוח הפקולטה באוניברסיטת סן פרנסיסקו. MCH מכיר במימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH MIRA 5R35GM133684-02) ומהקרן הלאומית למדע (NSF CAREER 2048265).

1. ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית: טיטרציה ישירה עם תחרות חיץ
<ol><li>הכנה לדוגמה<ol>
<li>הכינו תמיסה מואצת של 50 mM 2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-2-(הידרוקסימתיל)פרופאן-1,3-דיול (bisTris) ב-pH 7.4 באמצעות מים אולטרה-אפורים (עמידות >18 MΩ). הסר את יוני המתכת של עקבות על ידי דגירה עם שרף בעל זיקה גבוהה למשך 2 שעות לפחות...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

מאמר זה מספק שיטה חזקה לכימות הזיקה והתרמודינמיקה של Cu(II) הקשורה לפפטידים. קומפלקסים עם Cu(II) מתאימים באופן אידיאלי לניטור רצועת הקליטה d-d באתר המתכת בשל תצורת האלקטרונים d9 שלה. אף על פי שמקדם ההכחדה הוא קטן, ולכן דורש ריכוזים גדולים יותר של הקומפלקס כדי להניב אות אמין, טיטרציות של Cu(II) ל...

הביולוגיה התפתחה כדי לנצל את הכימיה המגוונת של יוני המתכת הדרושים לחיים כדי להסתגל ולשרוד בסביבתם. על פי הערכות, 25%-50% מהחלבונים משתמשים ביוני מתכת למבנה ולתפקוד1. התפקיד המסוים ומצב החמצון מחדש של יון המתכת קשורים ישירות להרכב ולגיאומטריה של הליגנדות הביולוגיות המתאמות אותו. בנוסף, יוני מתכת פעילים בפני חמצון-חיזור כגון Cu(II) חייבים להיות מווסתים היטב, שמא הם מתקשרים עם חומרים מחמצנים באמצעות כימיה דמוית פנטון כדי ליצור מיני חמצן תגובתי (ROS)2,3,4. הבנת מצבי הקשירה והאהדה המניעים את הביוכימיה שלה אמורה לסייע בהבהרת התפקיד הביולוגי של יון המתכת.
טכניקות רבות משמשות לחקר אינטראקציות הקשירה של מתכות ופפטידים. אלה הן בעיקר טכניקות ספקטרוסקופיות, אך הן כוללות גם סימולציות מחשב באמצעות דינמיקה מולקולרית, כפי שניתן לראות באמצעות אינטראקציות Cu(II) עם קטע של עמילואיד בטא (Aβ)5. טכניקה ספקטרוסקופית נפוצה הנגישה לאוניברסיטאות רבות היא תהודה מגנטית גרעינית (NMR). על ידי שימוש באופי הפאראמגנטי של Cu(II), Gaggelli et al. הצליחו להראות היכן יון המתכת נקשר על פטיד באמצעות הרפיה של גרעינים סמוכים6. ניתן להשתמש בתהודה פאראמגנטית של אלקטרונים (EPR) גם כדי לחקור את המיקום והמצב של יון המתכת הפארמגנטיתהמחייבת 7. טכניקות ספקטרוסקופיות אחרות כגון דיכרואיזם מעגלי (CD) יכולות לתאר את הקואורדינציה לגבי Cu(II) במערכות כגון מערכות טריפפטידיות8, וספקטרומטריית מסות יכולה להראות סטויכיומטריה ולאילו שאריות יון המתכת מתואם באמצעות תבניות פיצול 9,10.
חלק מהטכניקות הללו, כגון NMR, הן נטולות תוויות אך דורשות ריכוזים גדולים של פפטידים, מה שמציב אתגרים למחקר. טכניקה נפוצה נוספת הנקראת ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית שימשה כדי לקשר את מיקומו של טירוזין או טריפטופן עם מרווה מ-Cu(II)11,12. באופן דומה, טכניקה זו יכולה להראות שינויים מבניים כתוצאה מכריכת Cu(II)13. עם זאת, האתגרים עם מחקרי קשירת מתכות-פפטידים אלה הם שהם בודקים חומצות אמינו כרומופוריות כגון טירוזין אשר לא כל המערכות יש, כי יון המתכת נקשר תחת מודל קלאסי, וכי ייתכן שהטכניקה אינה תורמת בתנאים פיזיולוגיים. ואכן, נוצרים מספר פפטידים שאינם מכילים חומצות אמינו כרומופוריות כאלה או נקשרים תחת מודלים קלאסיים, מה שמונע את השימוש בטכניקות אלה14,15. מאמר זה מפרט גישות להערכת תכונות מחייבות בתרחישים אלה בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
ליגנדות ביולוגיות עשויות לאמץ מצבי פרוטונציה שונים שיכולים להשפיע על קשירת יוני מתכת כגון טבעת אימידזול על היסטידין. אם ה- pH אינו נשמר באופן עקבי, התוצאות יכולות להיות מפותלות או סותרות. מסיבה זו, מאגרים הם מרכיב חיוני בחקר האינטראקציות בין מתכת לחלבון/פפטיד. עם זאת, הוכח כי מאגרים רבים מקיימים אינטראקציה חיובית עם יוני מתכת16,17. בנוסף לתחרות עם המולקולה הביולוגית המעניינת, למאגר עשויים להיות אטומי תיאום דומים שקשה להבחין ביניהם לבין האטומים המתאמים של הפפטיד או החלבון. במחקר זה, ההתמקדות היא בספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית וקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית (ITC) כשתי טכניקות משלימות לחקר אינטראקציות Cu(II)-פפטיד, עם שיקולים מיוחדים הנוגעים לבחירת חיץ.
ספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית היא טכניקה מהירה ונגישה לחקר אינטראקציות קושרות מתכות. הקרנה עם אור באורכי הגל האולטרה-סגולים (UV) או באורכי הגל הנראים לעין יכולה להוביל לקליטה של רצועות d-d ממוקדות מתכת, המספקות מידע רב ערך על סיווג ליגנד, גיאומטריות מתכתיות וזיקות קשירה לכאורה18,19. עבור קומפלקסים אלה, טיטרציות ישירות של יוני מתכת לתמיסות חלבון או פפטידים יכולות לכמת סטויכיומטריות קושרות וזיקות קישור לכאורה. במקרים מסוימים, כגון תצורות d5 או d10 אלקטרונים, הקומפלקס אינו בולע אור (כלומר, הוא שקט מבחינה ספקטרוסקופית). בקומפלקסים אלה של מתכת מעבר שקטה מבחינה ספקטרוסקופית, ניתן לעקוף מגבלות אלה על ידי שימוש בליגנד מתחרה, אשר בעת תיאום יון המתכת, מניב רצועות העברת מטען הניתנות לזיהוי. בכל מקרה, גישה זו מוגבלת לכימות רק סטויכיומטריה וזיקה מקשרת לכאורה, ואין תובנה לגבי אנתלפיה מחייבת ללא קירובים.
משלים מידע המתקבל מספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית, ITC היא טכניקה אטרקטיבית לכימות ישיר וקפדני של האנתלפיה המחייבת20. ITC מודד ישירות את החום המשתחרר או הנצרך במהלך אירוע מחייב, ומכיוון שהטיטרציה מתרחשת בלחץ קבוע, החום הנמדד הוא האנתלפיה של כל שיווי המשקל (ΔHITC). בנוסף, הסטויכיומטריה של אירוע הכריכיומטריה של אירוע הכריכה (n) וזיקת הכריכיון לכאורה (KITC) מכמתות. מפרמטרים אלה נקבעות האנרגיה החופשית (ΔGITC) והאנטרופיה (ΔSITC), המספקות תמונת מצב תרמודינמית של אירוע הקשירה. מכיוון שהוא אינו מסתמך על בליעת אור, ITC היא טכניקה אידיאלית עבור מינים שקטים באופן ספקטרוסקופי, למשל, d5 או d10 קומפלקסים של יונים מתכתיים. עם זאת, מכיוון שקלורימטריה מודדת חום, כל מערכות חיץ ללא תחרות ושיווי משקל ללא הסברה עלולים להשפיע לרעה על הניתוח כדי לקבוע במדויק את התרמודינמיקה הקושרת את יוני המתכת, ויש לנקוט בזהירות רבה כדי לטפל בגורמים אלה20. אם היא מבוצעת בקפדנות המתאימה, ITC היא טכניקה חזקה לקביעת התרמודינמיקה של קומפלקסים של חלבוני מתכת/פפטידים.
כאן, פפטיד קושר נחושת שקט כרומופורית, C-פפטיד, משמש להדגמת השימוש המשלים בשתי הטכניקות. C-פפטיד הוא מוצר ביקוע של 31 שאריות (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQSLQPLALEGSLQ) שנוצר במהלך הבשלת האינסולין; הוא חסר שאריות כרומופוריות, אך הוכח שהוא קושר את Cu(II) עם זיקה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית14,15. אתר הקישור Cu(II) מורכב משרשראות הצד של גלוטמט ואספרטאט וכן מ-N-terminus של הפפטיד14,15. אטומי תיאום אלה דומים מאוד לאלה של מערכות מאגרים נפוצות רבות. כאן מוצג השימוש הטנדם בפסי העברת ה-d-d והמטענים בספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית וב-ITC בכימות התרמודינמיקה הקושרת את ה-Cu(II) ל-C-פפטיד. ניתן ליישם את הגישה ממחקר Cu(II) הקושר ל-C-פפטיד על יוני מתכת אחרים ועל מערכות חלבון/פפטידים אחרות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

נחושת(II) היא מתכת חיונית במערכות ביולוגיות, המעניקה תכונות כימיות ייחודיות לביומולקולות שאיתן היא מתקשרת. דווח כי הוא נקשר ישירות למגוון פפטידים וממלא תפקידים הכרחיים ופתולוגיים כאחד, החל ממבנה מתווך, דרך תכונות העברת אלקטרונים וכלה בהקניית תפקוד קטליטי. כימות זיקת הקישור והתרמודינמיקה של קומפלקסים אלה של Cu(II)-פפטידים במבחנה מספק תובנה לגבי הכוח המניע התרמודינמי של הקשירה, תחרויות פוטנציאליות בין יוני מתכת שונים עבור הפפטיד או בין פפטידים שונים עבור Cu(II), והשכיחות של קומפלקס Cu(II)- פפטידי in vivo. עם זאת, כימות התרמודינמיקה הקושרת יכול להיות מאתגר בשל מספר עצום של גורמים, כולל התחשבות בכל שיווי המשקל המתחרה בניסוי טיטרציה, במיוחד במקרים שבהם יש מחסור בידיות ספקטרוסקופיות בדידות המייצגות את הפפטיד, את יון המתכת בלוק d ואת האינטראקציות שלהם.
כאן, קבוצה חזקה של ניסויים מסופקת לכימות מדויק של תרמודינמיקה Cu(II)-פפטידית. מאמר זה מתמקד בשימוש בספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית בנוכחות והיעדר ליגנדות כרומופוריות כדי לספק את הידית הספקטרוסקופית הדרושה ב- Cu(II) ובשימוש בקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית ללא תווית. בשתי הטכניקות הניסוייות מתואר תהליך כדי להסביר את כל שיווי המשקל המתחרה. בעוד שהמיקוד של מאמר זה הוא ב-Cu(II), קבוצת הניסויים המתוארת יכולה לחול מעבר לאינטראקציות Cu(II)-פפטידיות, ולספק מסגרת לכימות מדויק של מערכות מתכת-פפטידים אחרות בתנאים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

המטרה הייתה לכמת ולאשש את התרמודינמיקה של Cu(II) הנקשרת ל-C-פפטיד באמצעות הטכניקות המשלימות של ספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית ו-ITC. בשל האופי החזק של ספקטרוסקופיית קליטה אלקטרונית, בוצע טיטרציה ישירה של Cu(II) ל-300 μM C-peptide (איור 1). תוספת של 150 μM של Cu(II) גרמה לעלייה מיידית בפס ב-600 ננו?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

מאמר זה מתמקד בשימוש בספקטרוסקופיית ספיגה אלקטרונית ובקלורימטריה של טיטרציה איזותרמית כדי לחקור ולכמת את התרמודינמיקה של Cu(II) הקשורה לפפטידים וחלבונים.

כימות אינטראקציות הקשירה בין שאריות Cu(II) ופפטידיות בנוכחות ובהיעדר כרומופורים

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

שיטה זו תאפשר לחוקר לחקור מערכות קשות למחקר, כמו פפטידים ויוני מתכת מעבר בשורה הראשונה, שניהם בדרך כלל מאתגרים באמצעות יישומים סטנדרטיים יותר. היתרון העיקרי כאן הוא באמצעות טכניקות אורתוגונליות כי הם משלימים זה את זה היטב, וזה יכול לתת תובנה נוספת לתוך המערכת ולעזור לנו לא לפספס שום תופעה. השיטה המפורטת בסרטון זה מתאימה מאוד ללימוד מערכות אחרות.למרות שאנו מראים אותו עם Cu(II) ופפטיד, הוא יכול לשמש לאינטראקציות רבות ושונות של פפטידי מתכת וחלבון מתכת. אני חושב שהחלק הקשה ביותר יהיה למצוא בחירת חיץ טובה עבור יון המתכת והפפטיד שלך. הייתי מעיין בספרות כדי לראות אילו מאגרים שימשו אחרים בעבר.מי שתדגים את ההליך תהיה סוהי צ'וי, סטודנטית לתואר שני במעבדת המחקר שלי. כדי להתחיל, הפעל את ספקטרופוטומטר הקליטה האלקטרוני ותן לו להתחמם במשך כ-15 עד 20 דקות לפני השימוש. לאחר מכן הפעל את תוכנת הספקטרופוטומטר והגדר את הפרמטרים, כגון טווח סריקה של 200 עד 900 ננומטר, טווח הסריקה של 200 ננומטר לשנייה, וקו הבסיס של קרן כפולה מתוקן.לאחר מכן, אסוף קו בסיס ללא cuvettes או דגימות בנתיבי הקרן. באמצעות שני cuvettes תואמים בספקטרופוטומטר הקרן הכפולה, טען קובט אחד עם 115 מיקרוליטרים של מים אולטרה-טהורים ואת הקובט השני עם 115 מיקרוליטר של דגימת הפפטיד תוך הקפדה על כך שאין בועות אוויר ב- cuvettes מכיוון שאלו יפריעו לאות. לאחר מכן, הניחו את הקובט עם מים אולטרה-טהורים בקרן הייחוס ואת הקובט עם הפפטיד בקרן הדגימה.לאחר מכן לאסוף את ספקטרום הספיגה של פפטיד ללא מתכת. הוסף כמות תת-שכבתית של תמיסת Cu(II) לתוך הקובטה עם דגימת הפפטיד ורשום את הנפח לניתוח מאוחר יותר. צנרת בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר.לאחר שיווי משקל במשך חמש דקות החזירו את הקובט למחזיק תא הדגימה ורשמו את ספקטרום הקליטה. לאחר מכן חזור על התוספת של Cu(II)aliquots לתמיסת הפפטידים עבור מקבילות שונות ורשום את הנפח הכולל של Cu(II) שנוסף לקובט. לאחר אתחול התוכנה כפי שתואר קודם לכן בשתי cuvettes תואמות לטעון cuvette אחד עם 115 microliters של מים טהורים במיוחד ו cuvette אחרים עם 115 microliters של תמיסת נחושת-פן מורכב.מניחים את הקובט עם מים בקרן הייחוס ואת הקובטה עם תמיסה מורכבת מנחושת-פן בקרן הדגימה. לאחר מכן לאסוף את ספקטרום הקליטה של קומפלקס ליגנד מתכת. לאחר מכן, הוסיפו כמות סטויכיומטרית של פפטיד לתמיסה המורכבת מנחושת-פן והעבירו אותה בעדינות למעלה ולמטה כדי לערבב היטב, תוך הקפדה שלא להכניס בועות אוויר.לאחר מכן, דגירה של הפתרון במשך חמש דקות כדי להגיע לשיווי משקל. החזירו את הקובט למחזיק תא הדגימה ותעדו את ספקטרום הקליטה. מאוחר יותר, חזור על הוספת אליקוטים פפטידיים לתמיסה המורכבת של נחושת-פן עבור מקבילות שונות, ורשום את נפח הפפטיד שנוסף כך שניתן יהיה לקבוע את הריכוז המדולל.תחילה הפעל את ה- ITC והפעל את תוכנת ה- ITC כדי להפעיל את המכשיר. לאחר האתחול הראשון, rehome את burette ופעל לפי ההוראות על המסך. לאחר מכן הסר את הבורט ואת הכיסוי מתא ההפניה.לאחר מכן, הסר כל מים מתא הייחוס ושטוף שלוש פעמים עם 450 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. לאט לאט לשאוב מים טהורים במיוחד עד סימן 450 microliters של מזרק העמסה נזהר לא להכניס בועות אוויר לתוך המזרק. לאחר מכן הכנס את מזרק הטעינה לתא הייחוס עד שהוא נמצא בערך מילימטר אחד מלמטה והזריק לאט חלק מהתמיסה עד שיישארו 150 מיקרוליטרים במזרק הטעינה.לאחר מכן, הזיזו את בוכנת מזרק הטעינה במהירות למעלה ולמטה בכ-25 מיקרוליטרים מספר פעמים כדי לנתק את כל הבועות על פני התא. לאחר מכן מזריקים באיטיות עד שהבוכנה מגיעה לסימן 100 המיקרוליטרים על מזרק ההעמסה, ובכך מחלקים בסך הכל 350 מיקרוליטרים של מים טהורים במיוחד לתוך תא הייחוס ומחליפים את כיסוי תא הייחוס. לאחר הסרת כל תמיסה שיורית מתא הדגימה, טען 450 מיקרוליטרים של EDTA 10 מילימולרי באמצעות מזרק טעינה והשרו במשך 10 דקות כדי להבטיח שיוני מתכת עקבות יוסרו מכיוון שה- EDTA יקשור מתכות קורט.לאחר הסרת תמיסת EDTA יש לשטוף היטב את מזרק ההעמסה בכמויות גדולות של מים טהורים במיוחד. נקו את ה-ITC בהתאם להוראות היצרן על ידי שטיפת תא הדגימה במים טהורים במיוחד. הסר את שאריות המים מתא הדגימה ולאחר מכן התנאי את תא הדגימה על ידי שטיפה עם 450 מיקרוליטר של חיץ לפחות שלוש פעמים.לאחר מכן, הסר את המאגר השיורי המתנה את תא הדגימה וטען את תמיסת הפפטיד לתא הדגימה באמצעות מזרק הטעינה. לאחר מכן לשטוף את מזרק טיטרציה עם 200 microliters של תמיסה buffered על ידי הסרת הבוכנה הראשונה. באמצעות מיקרו פיפטה, פיפטה את תמיסת החיץ דרך החור בחלק העליון של מזרק טיטרציה זכוכית דרך המזרק החוצה את המחט למטה.מאוחר יותר, הכנס באופן מלא את הבוכנה לתוך מזרק טיטרציה. לאחר מכן טבלו את קצה מחט מזרק הטיטרציה בתמיסת המתכת ומשכו באיטיות את הבוכנה כלפי מעלה וגרמו לתמיסת המתכת למלא את המזרק וכתוצאה מכך נוצר נפח ריק בחלק העליון של חלק הזכוכית של מזרק הטיטרציה. כדי להסיר את עוצמת הקול הריק סובבו את מזרק הטיטרציה במקביל לרצפה.לאחר מכן הסר את הבוכנה והטה מעט את חלק הזכוכית לכיוון הרצפה. נערו בעדינות את מזרק הטיטרציה כך שהתמיסה תעבור לחלק הכוס של מזרק הטיטרציה ותמלא את רוב נפח החלל. אבל להבטיח כי שניים עד שלושה microliters של נפח ריק להישאר.תוך שמירה על המזרק במקביל לרצפה מכניסים מחדש את הבוכנה. לאחר מכן החזק את מזרק הטיטרציה זקוף וטבול את קצה המחט בחזרה בתמיסת המתכת. לאחר מכן, דחפו את הבוכנה כלפי מטה עד שהאוויר חדל לצאת מהמחט והעמיסו את מזרק הטיטרציה על ידי משיכה איטית של הבוכנה עד קצת מעל סימן 50 המיקרוליטרים תוך שמירה על קצה המחט בתמיסה.מכניסים בזהירות את חלק הזכוכית של מזרק הטיטרציה לתוך הבורט ומבריגים עד שהאצבע מתהדקת. לאחר מכן, באמצעות מגב עדין קל לספוג את התמיסה שיוצאת ממזרק הטיטרציה עקב דחיסה של הבוכנה מבלי לגעת בקצה המחט. לאחר מכן, הכנס את הבורט עם מזרק טיטרציה לתוך תא הדגימה ומהדק אותו היטב.כדי להגדיר את הפרמטרים של תוכנת ITC, בחר את בקרת מכשירים. קובעים את קצב הערבוב ואת הטמפרטורה. לאחר מכן, תחת פרטי ניסוי, הזן את המזרק ואת ריכוזי התאים ביחידות מילימולריות.לאחר מכן, בסעיף שיטת ניסוי בחר טיטרציה מצטברת. לחץ על התקנה וציין 20 זריקות של 2.5 מיקרוליטר ואם נדרשת רזולוציה נוספת כדי לצפות באירוע הכריכה הגדל את מספר ההזרקות והקטנת הנפח בכל הזרקה. לאחר מכן, הזן את מרווח הזמן בין כל זריקה כך שיהיה ארוך מספיק כדי שהאות יתאזן ויחזור לקו הבסיס, בדרך כלל 300 שניות.לאחר מכן לחץ על הפעלה לחצן כדי להתחיל את הניסוי ולציין היכן הנתונים נשמרים. טיטרציה של Cu(II) בוצעה לתוך C-פפטיד המדגימה כי תוספת של 150 מיקרומולר של Cu(II) גרמה לעלייה מיידית בפס ב-600 ננומטר המיוחסים לפס d-d של Cu(II) והמשיכה לגדול עד שנוספו 300 מילימולר Cu(II). תוספת נוספת מעל 300 micromolar Cu(II) לא הגדילה את ספיגת איסור ה- d-d המציין רוויה וכי Cu(II) נקשר ל- C-פפטיד בקומפלקס 1:1 עם ערך לוג K של יותר משישה.C-פפטיד צויר לכ-10 מיקרומולר נחושת-פן קומפלקס והספיגה מפס העברת המטען ב-265 ננומטר פחתה, מה שמצביע על כך שה-C-פפטיד היה מסוגל לבצע chelate Cu(II) מהליגנד של פננתרולין עם ערך לוג K של 7.4 עד 7.8. התרמוגרמה של ITC מראה את הטיטרציה של 1.4 מילימולאר Cu(II) לתוך 154 מיקרומולר C-פפטיד במאגר MOPS של 15 מילימולר. נמצא כי זיקת הקשירה היא בעלת ערך לוג K של שמונה עם שינוי באנתלפיה כ-8 קילו-ג'ול לכל שומה.גיבס אנרגיה חופשית כמינוס 46 קילו-ג'אול לכל שומה, ושינוי באנטרופיה כ-120 ג'אול לכל שומה לכל קלווין. טיטרציה מבוקרת של 1.4 מילימולאר Cu(II) לתוך חיץ MOPS של 15 מילימולר בהיעדר C-פפטיד לא מראה שום קשירה בתרמוגרמה. הייתי אומר לוודא שהכל נקי.אם נשארו יוני מתכת או פפטידים מניסויים קודמים, זה יכול להשפיע באופן דרסטי על הסטויכיומטריה ולספק תחרות לא ידועה בניסויי הקשירה. דיכרואיזם מעגלי הוא שיטה נוספת לחקור אינטראקציות בין פפטידים מתכתיים או חלבונים מתכתיים מכיוון שהוא מסתכל על כיראליות. ספקטרומטריית מסות יכולה גם לחקור את הקומפלקסים האלה על ידי התבוננות בשינויים במסה.קבוצה זו של טכניקות שימשה מעבדות רבות החוקרות יוני מתכת המקיימים אינטראקציה עם פפטידים או חלבונים.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

אקוסטית אוטומטית מחלק עבור דילול סדרה של אגוניסטים פפטיד ב מבחני קביעת און

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

קביעת קינטיקה מחייב אנטיגן נוגדן גבוהה זיקה באמצעות ארבע פלטפורמות biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

בדיקה ישירה כוח למדידת מכני אינטגרציה בין הגרעין של שלד התא

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

תא Fractionation של תאים U937, בהעדר צנטריפוגה במהירות גבוהה

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...