Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

एससी व्हाइटहेड समर रिसर्च फैलोशिप का शुक्रिया अदा करता है। एमजेएस सैन फ्रांसिस्को विश्वविद्यालय में स्टार्टअप फंड और संकाय विकास निधि को धन्यवाद देता है। एमसीएच राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच एमआईआरए 5 आर 35 जीएम 133684-02) और राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ कैरियर 2048265) से वित्त पोषण स्वीकार करता है।

1. इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी: बफर प्रतियोगिता के साथ प्रत्यक्ष अनुमापन
<ol><li>सैंपल की तैयारी<ol>
<li>अल्ट्राप्योर पानी (>18 एमΩ प्रतिरोध) का उपयोग करके पीएच 7.4 पर 50 एमएम 2-[बिस (2-हाइड्रोक्सीथिल) अ...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

यह लेख पेप्टाइड्स के लिए सीयू (द्वितीय) बाध्यकारी की आत्मीयता और थर्मोडायनामिक्स को मापने के लिए एक मजबूत विधि प्रदान करता है। सीयू (द्वितीय) के साथ कॉम्प्लेक्स आदर्श रूप से अपने डी9 इलेक्ट्रॉन कॉन्फ...

जीव विज्ञान अपने आसपास के वातावरण में अनुकूलन और जीवित रहने के लिए जीवन के लिए आवश्यक धातु आयनों के विविध रसायन विज्ञान का उपयोग करने के लिए विकसित हुआ है। अनुमानित 25% -50% प्रोटीन संरचना और कार्य के लिए धातु आयनों का उपयोग करते हैं1. धातु आयन की विशेष भूमिका और रेडॉक्स स्थिति सीधे जैविक लिगेंड की संरचना और ज्यामिति से संबंधित है जो इसे समन्वयित करती है। इसके अलावा, रेडॉक्स-सक्रिय धातु आयनों जैसे कि सीयू (द्वितीय) को कसकर विनियमित किया जाना चाहिए ताकि वे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) 2,3,4 बनाने के लिए फेंटन जैसी रसायन विज्ञान के माध्यम से ऑक्सीकरण एजेंटों के साथ बातचीत न करें। बाध्यकारी मोड और आत्मीयता को समझना जो इसके जैव रसायन को चलाते हैं, धातु आयन की जैविक भूमिका को स्पष्ट करने में मदद करनी चाहिए।
धातुओं और पेप्टाइड्स के बाध्यकारी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया जाता है। ये ज्यादातर स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकें हैं, लेकिन आणविक गतिशीलता का उपयोग करके कंप्यूटर सिमुलेशन भी शामिल हैं, जैसा कि अमाइलॉइड बीटा (एβ)5 के एक टुकड़े के साथ सीयू (द्वितीय) इंटरैक्शन के माध्यम से देखा गया है। एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीक जो कई विश्वविद्यालयों के लिए सुलभ है, परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) है। क्यू (द्वितीय) की पैरामैग्नेटिक प्रकृति का उपयोग करके, गैगेली एट अल यह दिखाने में सक्षम थे कि धातु आयन पास के नाभिक6 की छूट के माध्यम से पेटाइड पर कहां बांधता है। इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक अनुनाद (ईपीआर) का उपयोग पैरामैग्नेटिक धातु आयन बाइंडिंग 7 के स्थान और मोड की जांच करने के लिए भी किया जा सकताहै। अन्य स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीकें जैसे परिपत्र द्विवर्णता (सीडी) ट्रिपेप्टाइड सिस्टम8 जैसी प्रणालियों में सीयू (द्वितीय) के बारे में समन्वय का वर्णन कर सकती हैं, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री स्टोइकोमेट्री दिखा सकती है और किस अवशेष के लिए धातु आयन को विखंडन पैटर्न 9,10 के माध्यम से समन्वित किया जाता है।
एनएमआर जैसी इन तकनीकों में से कुछ लेबल मुक्त हैं, लेकिन पेप्टाइड की बड़ी सांद्रता की आवश्यकता होती है, जो अध्ययन के लिए चुनौतियां पेश करती हैं। प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी नामक एक अन्य सामान्य तकनीक का उपयोग सीयू (द्वितीय) 11,12 से शमन के साथ टायरोसिन या ट्रिप्टोफैन की स्थिति से संबंधित करने के लिए किया गया है। इसी तरह, यह तकनीक सीयू (द्वितीय) बाध्यकारी13 के परिणामस्वरूप संरचनात्मक परिवर्तन दिखा सकती है। हालांकि, इन धातु-पेप्टाइड बाध्यकारी अध्ययनों के साथ चुनौतियां यह हैं कि वे क्रोमोफोरिक अमीनो एसिड जैसे टायरोसिन की जांच करते हैं जो सभी प्रणालियों में नहीं होते हैं, कि धातु आयन एक शास्त्रीय मॉडल के तहत बांधता है, और यह तकनीक शारीरिक परिस्थितियों में अनुकूल नहीं हो सकती है। दरअसल, कई पेप्टाइड्स उभर रहे हैं जिनमें ऐसे क्रोमोफोरिक अमीनो एसिड नहीं होते हैं या शास्त्रीय मॉडल के तहत बांधते हैं, इन तकनीकों के उपयोग कोरोकते हैं 14,15. यह लेख शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों के तहत इन परिदृश्यों में बाध्यकारी गुणों का आकलन करने के लिए दृष्टिकोण का विवरण देता है।
जैविक लिगेंड विभिन्न प्रोटोनेशन राज्यों को अपना सकते हैं जो धातु आयन बंधन को प्रभावित कर सकते हैं जैसे कि हिस्टिडीन पर इमिडाज़ोल रिंग। यदि पीएच को लगातार बनाए नहीं रखा जाता है, तो परिणाम जटिल या परस्पर विरोधी हो सकते हैं। इस कारण से, धातु-प्रोटीन / पेप्टाइड इंटरैक्शन के अध्ययन में बफर एक आवश्यक घटक हैं। हालांकि, कई बफर धातु आयनों16,17 के साथ अनुकूल बातचीत करने के लिए दिखाए गए हैं। ब्याज के जैविक अणु के साथ प्रतिस्पर्धा करने के अलावा, बफर में समान समन्वय परमाणु हो सकते हैं जो पेप्टाइड या प्रोटीन के समन्वय परमाणुओं से अंतर करना मुश्किल हो सकता है। इस अध्ययन में, बफर विकल्प से संबंधित विशेष विचारों के साथ, सीयू (द्वितीय) -पेप्टाइड इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए दो पूरक तकनीकों के रूप में इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री (आईटीसी) पर ध्यान केंद्रित किया गया है।
इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी धातु-बाध्यकारी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक तेजी से, व्यापक रूप से सुलभ तकनीक है। पराबैंगनी (यूवी) या दृश्यमान तरंग दैर्ध्य में प्रकाश के साथ विकिरण धातु-केंद्रित डी-डी बैंड के अवशोषण का कारण बन सकता है, जो लिगैंड वर्गीकरण, धातु ज्यामिति और स्पष्ट बाध्यकारी आत्मीयता18,19 पर मूल्यवान जानकारी प्रदान करता है। इन परिसरों के लिए, प्रोटीन या पेप्टाइड समाधानों में धातु आयनों के प्रत्यक्ष अनुमापन बाध्यकारी स्टोइकोमेट्री और स्पष्ट बाध्यकारी आत्मीयता को माप सकते हैं। कुछ मामलों में, जैसे कि डी5 या डी10 इलेक्ट्रॉन कॉन्फ़िगरेशन, कॉम्प्लेक्स प्रकाश को अवशोषित नहीं करता है (यानी, स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से चुप है)। इन स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से मूक संक्रमण धातु परिसरों में, इन सीमाओं को एक प्रतिस्पर्धी लिगैंड का उपयोग करके दरकिनार किया जा सकता है, जो धातु आयन के समन्वय पर, पता लगाने योग्य चार्ज ट्रांसफर बैंड पैदा करता है। किसी भी मामले में, यह दृष्टिकोण केवल स्टोइकोमेट्री और स्पष्ट बाध्यकारी आत्मीयता को मापने तक सीमित है, और बाध्यकारी थैलेपी में कोई अंतर्दृष्टि सन्निकटन के बिना प्रदान नहीं की जाती है।
इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी से प्राप्त जानकारी के पूरक, आईटीसी बाध्यकारी थैलेपी20 के प्रत्यक्ष और कठोर मात्रा का ठहराव के लिए एक आकर्षक तकनीक है। आईटीसी सीधे एक बाध्यकारी घटना के दौरान जारी या खपत की गई गर्मी को मापता है और, चूंकि अनुमापन निरंतर दबाव पर होता है, इसलिए मापा गया गर्मी सभी संतुलन (ΔHआईटीसी) की थैलेपी है। इसके अलावा, बाध्यकारी घटना (एन) और स्पष्ट बाध्यकारी आत्मीयता (केआईटीसी) की स्टोइकोमेट्री की मात्रा निर्धारित की जाती है। इन मापदंडों से, मुक्त ऊर्जा (ΔGआईटीसी) और एन्ट्रापी (ΔS आईटीसी) निर्धारित किएजाते हैं, जो बाध्यकारी घटना का थर्मोडायनामिक स्नैपशॉट प्रदान करते हैं। चूंकि यह प्रकाश अवशोषण पर भरोसा नहीं करता है, आईटीसी स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से मूक प्रजातियों के लिए एक आदर्श तकनीक है, उदाहरण के लिए, डी5 या डी10 धातु आयन परिसरों। हालांकि, चूंकि कैलोरीमेट्री गर्मी को मापता है, इसलिए किसी भी बेजोड़ बफर सिस्टम और बेहिसाब संतुलन धातु आयन बाध्यकारी थर्मोडायनामिक्स को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए विश्लेषण पर प्रतिकूल प्रभाव डाल सकता है, और इन कारकों को संबोधित करने के लिए बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए20. यदि उपयुक्त कठोरता के साथ प्रदर्शन किया जाता है, तो आईटीसी धातु-प्रोटीन / पेप्टाइड परिसरों के थर्मोडायनामिक्स को निर्धारित करने के लिए एक मजबूत तकनीक है।
यहां, एक क्रोमोफोरिक रूप से मूक तांबा-बाध्यकारी पेप्टाइड, सी-पेप्टाइड का उपयोग दो तकनीकों के पूरक उपयोग को प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है। सी-पेप्टाइड इंसुलिन परिपक्वता के दौरान गठित एक 31 अवशेष दरार उत्पाद (ईएईडीएलक्यूवीजीजीएलजीएलईजी) है; इसमें क्रोमोफोरिक अवशेषों का अभाव है, लेकिन शारीरिक रूप से प्रासंगिक आत्मीयता14,15 के साथ सीयू (द्वितीय) को बांधने के लिए दिखाया गया है। सीयू (द्वितीय) बाध्यकारी साइट में एक ग्लूटामेट और एस्पार्टेट के साथ-साथ पेप्टाइड14,15 के एन-टर्मिनस की साइड चेन शामिल हैं। ये समन्वय परमाणु कई आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले बफर किए गए सिस्टम से मिलते जुलते हैं। यहां, सी-पेप्टाइड के लिए क्यू (द्वितीय) बाध्यकारी थर्मोडायनामिक्स को मापने में इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और आईटीसी में डी-डी और चार्ज ट्रांसफर बैंड का अग्रानुक्रम उपयोग दिखाया गया है। सी-पेप्टाइड के लिए सीयू (द्वितीय) बाध्यकारी का अध्ययन करने से दृष्टिकोण अन्य धातु आयनों और प्रोटीन / पेप्टाइड सिस्टम पर लागू किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

कॉपर (II) जैविक प्रणालियों में एक आवश्यक धातु है, जो बायोमोलेक्यूल्स को अद्वितीय रासायनिक गुण प्रदान करता है जिसके साथ यह बातचीत करता है। यह सीधे विभिन्न पेप्टाइड्स से बांधने और मध्यस्थसंरचना से लेकर इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण गुणों से लेकर उत्प्रेरक कार्य प्रदान करने तक आवश्यक और रोग संबंधी भूमिकाएं निभाने की सूचना दी गई है। इन सीयू (द्वितीय) -पेप्टाइड परिसरों के बाध्यकारी आत्मीयता और थर्मोडायनामिक्स को मापने से बाध्यकारी ड्राइविंग बल, पेप्टाइड के लिए विभिन्न धातु आयनों के बीच या सीयू (द्वितीय) के लिए विभिन्न पेप्टाइड्स के बीच संभावित प्रतियोगिताओं और विवो में क्यू (द्वितीय) -पेप्टाइड कॉम्प्लेक्स की व्यापकता में अंतर्दृष्टि प्रदान की जाती है। हालांकि, बाध्यकारी थर्मोडायनामिक्स को परिमाणित करना असंख्य कारकों के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है, जिसमें अनुमापन प्रयोग के भीतर सभी प्रतिस्पर्धी संतुलन के लिए लेखांकन शामिल है, खासकर उन मामलों में जहां पेप्टाइड, डी-ब्लॉक धातु आयन और उनकी बातचीत का प्रतिनिधित्व करने वाले असतत स्पेक्ट्रोस्कोपिक हैंडल की कमी है।
यहां, क्यू (द्वितीय) -पेप्टाइड थर्मोडायनामिक्स के सटीक परिमाणीकरण के लिए प्रयोगों का एक मजबूत सेट प्रदान किया गया है। यह लेख क्रोमोफोरिक लिगेंड की उपस्थिति और अनुपस्थिति में इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी के उपयोग पर केंद्रित है ताकि सीयू (द्वितीय) पर आवश्यक स्पेक्ट्रोस्कोपिक हैंडल प्रदान किया जा सके और लेबल-मुक्त आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री का उपयोग किया जा सके। दोनों प्रयोगात्मक तकनीकों में, सभी प्रतिस्पर्धी संतुलन के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। जबकि इस लेख का ध्यान सीयू (द्वितीय) पर है, प्रयोगों का वर्णित सेट सीयू (द्वितीय) -पेप्टाइड इंटरैक्शन से परे लागू हो सकता है, और शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों के तहत अन्य धातु-पेप्टाइड प्रणालियों के सटीक परिमाणीकरण के लिए एक रूपरेखा प्रदान कर सकता है।

लक्ष्य इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और आईटीसी की पूरक तकनीकों का उपयोग करके सी-पेप्टाइड के लिए बाध्यकारी सीयू (द्वितीय) के थर्मोडायनामिक्स को निर्धारित करना और पुष्टि करना था। इलेक्ट्रॉनि?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

यह लेख इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी और आइसोथर्मल अनुमापन कैलोरीमेट्री के उपयोग पर केंद्रित है ताकि पेप्टाइड्स और प्रोटीन के लिए बाध्यकारी सीयू (द्वितीय) के थर्मोडायनामिक्स की जांच और मात्रा निर्धारित की जा सके।

क्रोमोफोरस की उपस्थिति और अनुपस्थिति में सीयू (द्वितीय) और पेप्टाइड अवशेषों के बीच बाध्यकारी इंटरैक्शन की मात्रा निर्धारित करना

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

स्वचालित ध्वनिक शक्ति निर्धारण assays में पेप्टाइड agonists के धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए वितरण

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

उच्च आत्मीयता एंटीबॉडी प्रतिजन बाध्यकारी काइनेटिक्स का निर्धारण चार Biosensor प्लेटफार्मों का उपयोग

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

अंग प्रत्यारोपण में एचएलए Alloantibodies का पता लगाने के लिए निजीकृत पेप्टाइड सरणियों

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

एसडीएस-पृष्ठ के साथ एक फॉस्फेट-बाइंडिंग टैग का उपयोग करके LRRK2 गतिविधि द्वारा फास्फारिलीकरण डिटेक्शन Rab10

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

झिल्ली प्रोटीन के बीच डिटर्जेंट-संवेदनशील बातचीत का पता लगाने

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

नाभिक और Cytoskeleton के बीच यांत्रिक एकीकरण को मापने के लिए एक सीधा बल जांच

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

अपव्यय Microgravimetry फॉस्फोलिपिड बाइंडिंग प्रोटीन की बाइंडिंग गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए Annexin A2 करने के लिए ठोस-समर्थित लिपिड Bilayers एक क्वार्ट्ज प्रतिध्वनि का उपयोग

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

उच्च गति के केंद्रापसारक के अभाव में U937 कोशिकाओं के सेल अंश

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...