Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
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SCはホワイトヘッド・サマー・リサーチ・フェローシップに感謝します。MJSは、サンフランシスコ大学のスタートアップファンドとファカルティ・ディベロップメント・ファンドに感謝します。MCHは、国立衛生研究所(NIH MIRA 5R35GM133684-02)および国立科学財団(NSF CAREER 2048265)からの資金提供を認めています。

1.電子吸収分光法:バッファー競合による直接滴定
<ol><li>サンプル調製<ol>
<li>超純水を用いてpH7.4で50mM 2-[ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-(ヒドロキシメチル)プロパン-1,3-ジオール(ビストリス)の緩衝溶液を調製する(>18MΩ耐性)。その後のろ過で少なくとも2時間、高親和性樹脂とインキュベートすることにより、微量金属イオンを除去します。</li>
		<li>既知量のペプチドを無金属...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

本稿では、ペプチドへのCu(II)結合の親和性と熱力学を定量化するための堅牢な方法を提供します。Cu(II)との錯体は、そのd9 電子配置のために金属部位のd-d吸収帯を監視するのに理想的である。吸光係数は小さいため、信頼性の高いシグナルを得るためには、より高い濃度の複合体が必要ですが、Cu(II)をペプチドに滴定すると、結合化学量論と近似結合親和性に関する洞察が迅速に得?...

生物学は、生命が周囲の環境に適応し、生き残るために必要な金属イオンの多様な化学を利用するように進化してきました。タンパク質の推定25%〜50%が構造および機能1に金属イオンを使用する。金属イオンの特定の役割および酸化還元状態は、それを調整する生物学的リガンドの組成および幾何学的形状に直接関係する。さらに、Cu(II)などの酸化還元活性金属イオンは、フェントン様化学を介して酸化剤と相互作用して活性酸素種(ROS)2,3,4を形成しないように、厳密に調整する必要があります。その生化学を駆動する結合様式と親和性を理解することは、金属イオンの生物学的役割を解明するのに役立つはずです。
金属とペプチドの結合相互作用を研究するために多くの技術が使用されています。これらは主に分光学的手法ですが、アミロイドベータ(Aβ)5の断片とのCu(II)相互作用から見られるように、分子動力学を用いたコンピュータシミュレーションも含まれます。多くの大学がアクセスできる広く使用されている分光技術は、核磁気共鳴(NMR)です。Cu(II)の常磁性の性質を利用して、Gaggelliらは、近くの原子核6の緩和を通じて、金属イオンが小柄な上でどこで結合するかを示すことができた。電子常磁性共鳴(EPR)は、常磁性金属イオン結合7の位置および様式をプローブするために利用することもできる。円二色性(CD)などの他の分光技術は、トリペプチド系8などの系におけるCu(II)に関する配位を記述することができ、質量分析は化学量論および金属イオンが断片化パターン9,10を介してどの残基に配位されるかを示すことができる。
NMRなどのこれらの技術のいくつかは、標識フリーですが、大量のペプチドを必要とし、研究の課題を提起します。蛍光分光法と呼ばれる別の一般的な技術は、チロシンまたはトリプトファンの位置をCu(II)11,12からの消光に関連付けるために利用されている。同様に、この技術は、Cu(II)結合13の結果としての構造変化を示すことができる。しかし、これらの金属ペプチド結合研究の課題は、すべての系が持っているわけではないチロシンなどの発色性アミノ酸をプローブすること、金属イオンが古典的なモデルの下で結合すること、およびこの技術が生理学的条件下では助長されない可能性があることである。実際、そのような発色性アミノ酸を含まないか、または古典モデルの下で結合しないいくつかのペプチドが出現しており、これらの技術の使用を妨げている14、15。この記事では、生理学的に関連する条件下でこれらのシナリオで結合特性を評価するためのアプローチについて詳しく説明します。
生物学的リガンドは、ヒスチジン上のイミダゾール環などの金属イオン結合に影響を与え得る異なるプロトン化状態を採用し得る。pHが一貫して維持されていない場合、結果は複雑または矛盾する可能性があります。このため、バッファーは金属-タンパク質/ペプチド相互作用の研究において不可欠な成分です。しかしながら、多くの緩衝液は、金属イオン16、17と良好に相互作用することが示されている。目的の生体分子と競合することに加えて、緩衝液は、ペプチドまたはタンパク質の配位原子と区別することが困難な類似の配位原子を有し得る。本研究では、Cu(II)-ペプチド相互作用を研究するための2つの補完的手法として、緩衝液の選択に関する特別な考慮事項として、電子吸収分光法と等温滴定熱量測定(ITC)に焦点を当てています。
電子吸収分光法は、金属結合相互作用を研究するための迅速で広くアクセス可能な技術です。紫外線(UV)または可視波長の光を照射すると、金属中心d-dバンドの吸収につながる可能性があり、配位子の分類、金属形状、および見かけ上の結合親和性に関する貴重な情報を提供します18,19。これらの複合体について、金属イオンをタンパク質またはペプチド溶液に直接滴定することで、結合化学量論および明らかな結合親和性を定量化することができる。d5またはd10電子配置などのいくつかの場合において、錯体は光を吸収しない(すなわち、分光学的に静かである)。これらの分光学的に静かな遷移金属錯体では、金属イオンに配位すると検出可能な電荷移動バンドを生成する競合する配位子を使用することによって、これらの制限を回避することができる。いずれの場合も、このアプローチは化学量論と明らかな結合親和性の定量化のみに限定され、近似なしでは結合エンタルピーに関する洞察は提供されません。
電子吸収分光法から得られた情報を補完するITCは、結合エンタルピー20の直接的かつ厳密な定量化のための魅力的な技術である。ITCは、結合事象中に放出または消費される熱を直接測定し、滴定は一定の圧力で行われるため、測定される熱はすべての平衡のエンタルピー(ΔHITC)です。さらに、結合事象(n)および見かけ上の結合親和性(KITC)の化学量論が定量化される。これらのパラメータから、自由エネルギー(ΔG ITC)およびエントロピー(ΔSITC)が決定され、結合事象の熱力学的スナップショットを提供する。ITCは光吸収に依存しないため、分光学的にサイレントな種、例えばd5またはd10金属イオン錯体にとって理想的な技術である。しかし、熱量測定は熱を測定するため、比類のないバッファーシステムや考慮されていない平衡は、金属イオン結合熱力学を正確に決定するための分析に悪影響を及ぼす可能性があり、これらの要因に対処するために細心の注意を払わなければなりません20。適切な厳密さで実施すれば、ITCは金属-タンパク質/ペプチド複合体の熱力学を決定するための堅牢な技術です。
ここでは、発色学的に静かな銅結合ペプチドであるC-ペプチドを使用して、2つの技術の相補的な使用を実証します。C-ペプチドは、インスリン成熟中に形成される31残基の切断産物(EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ)である。発色性残基を欠いているが、Cu(II)と生理学的に関連する親和性で結合することが示されている14,15。Cu(II)結合部位は、グルタミン酸塩とアスパラギン酸塩の側鎖、ならびにペプチド14,15のN末端からなる。これらの配位原子は、一般的に使用される多くの緩衝系の原子とよく似ている。ここでは、C-ペプチドへのCu(II)結合熱力学の定量における電子吸収分光法およびITCにおけるd-dおよび電荷移動バンドのタンデム使用が示されている。C-ペプチドへのCu(II)結合を研究することからのアプローチは、他の金属イオンおよびタンパク質/ペプチド系に適用することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

銅(II)は、生体系に不可欠な金属であり、相互作用する生体分子に独自の化学的特性を与えます。様々なペプチドに直接結合し、構造の媒介から電子移動特性、触媒機能の付与に至るまで、必要かつ病理学的役割を果たすことが報告されている。これらのCu(II)-ペプチド複合体の結合親和性と熱力学を インビトロで 定量化することで、結合の熱力学的駆動力、ペプチドの異なる金属イオン間またはCu(II)の異なるペプチド間の潜在的な競合、およびCu(II)-ペプチド複合体の インビボでの有病率についての洞察が得られます。しかし、結合熱力学を定量化することは、滴定実験内のすべての競合平衡を説明することを含む無数の要因のために、特にペプチド、dブロック金属イオン、およびそれらの相互作用を表す離散的な分光ハンドルが欠落している場合には困難であり得る。
ここでは、Cu(II)-ペプチド熱力学の正確な定量化のための堅牢な一連の実験が提供されています。この記事では、Cu(II)に必要な分光ハンドルを提供するために、発色性リガンドの存在下および非存在下での電子吸収分光法の使用と、ラベルフリーの等温滴定熱量測定の使用に焦点を当てています。両方の実験技術において、すべての競合する平衡を説明するプロセスが記述されている。本稿の焦点はCu(II)にあるが、記載された一連の実験はCu(II)-ペプチド相互作用を超えて適用することができ、生理学的に関連する条件下で他の金属ペプチド系を正確に定量するためのフレームワークを提供することができる。

目標は、電子吸収分光法とITCの相補的技術を使用して、Cu(II)とC-ペプチドに結合する熱力学を定量化し、裏付けることでした。電子吸収分光法の堅牢な性質により、Cu(II)を300μM Cペプチドに直接滴定しました(図1)。150μMのCu(II)を添加すると、Cu(II)のd-dバンドに起因する600nmでのバンドの即時増加が起こり、300μMのCu(II)が添加されるまで増加し続けた。さらに300μMを超えるC...

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Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

この記事では、電子吸収分光法と等温滴定熱量測定を使用して、ペプチドおよびタンパク質に結合するCu(II)の熱力学をプローブおよび定量することに焦点を当てます。

発色団の存在下および非存在下におけるCu(II)とペプチド残基間の結合相互作用の定量化

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

この方法により、研究者は、ペプチドや第一列遷移金属イオンなど、より標準的なアプリケーションを使用して一般的に困難な研究が困難なシステムを調査することができます。ここでの主な利点は、直交技術を使用することです それらは互いにうまく補完し合うので、それはシステムへのより多くの洞察を与え、私たちがどんな現象も見逃さないのを助けることができます。このビデオで詳しく説明されている方法は、他のシステムの研究に非常に適しています。Cu(II)とペプチドで示していますが、さまざまな金属ペプチドと金属タンパク質の相互作用に使用できます。最も難しいのは、金属イオンとペプチドに適したバッファーの選択肢を見つけることだと思います。私は文献を調べて、以前に他の人が使用したバッファーを確認します。手順を実演するのは、私の研究室の大学院生である崔宗煽です。まず、電子吸収分光光度計の電源を入れ、使用前に約15〜20分間温めます。次に、分光光度計ソフトウェアを起動し、200〜900ナノメートルのスキャン範囲、毎秒200ナノメートルのスキャン範囲、ダブルビームベースライン補正などのパラメーターを構成します。次に、ビームパスにキュベットやサンプルがないベースラインを収集します。ダブルビーム分光光度計で2つのマッチングキュベットを使用して、一方のキュベットに115マイクロリットルの超純水を、もう一方のキュベットに115マイクロリットルのペプチドサンプルをロードし、信号に干渉するためキュベット内に気泡がないことを確認します。その後、参照ビームに超純水を入れたキュベットを、サンプルビームにペプチドを入れたキュベットを入れます。次に、無金属ペプチドの吸収スペクトルを収集します。化学量論量のCu(II)溶液をペプチドサンプルと一緒にキュベットに加え、後で分析するために体積を記録します。それをゆっくりと上下にパイプして、気泡の発生を避けながら溶液を混合します。5分間平衡化した後、キュベットをサンプルセルホルダーに戻し、吸収スペクトルを記録します。次に、さまざまな等価物についてペプチド溶液へのCu(II)アリコートの添加を繰り返し、キュベットに添加したCu(II)の総量を記録します。2つのマッチングされたキュベットで前述のようにソフトウェアを初期化した後、1つのキュベットに115マイクロリットルの超純水をロードし、他のキュベットに115マイクロリットルの銅-フェン錯体溶液をロードします。参照ビームに水を入れたキュベットを、サンプルビームに銅-フェン錯体溶液を入れたキュベットを配置します。次に、金属配位子複合体の吸収スペクトルを収集する。その後、銅-フェン錯体溶液に化学量論量のペプチドを加え、気泡が入らないように注意しながら、それを穏やかに上下にパイプして完全に混合します。次に、溶液を5分間インキュベートして平衡に達します。キュベットをサンプルセルホルダーに戻し、吸収スペクトルを記録します。その後、種々の当量について銅-フェン錯体溶液へのペプチドアリコートの添加を繰り返し、希釈濃度を決定できるように添加したペプチドの量を記録します。まずITCの電源を入れ、ITCソフトウェアを起動して機器を実行します。最初の初期化後、ビュレットをリホームし、画面の指示に従います。次に、ビュレットとカバーを参照セルから取り外します。次に、基準セルから水分をすべて取り除き、450マイクロリットルの脱気超純水で3回すすぎます。ローディングシリンジに気泡が入らないように注意しながら、ローディングシリンジの450マイクロリットルのマークまで超純水をゆっくりと引き上げます。次に、ローディングシリンジを下から約1ミリメートルになるまで基準セルに挿入し、150マイクロリットルがローディングシリンジに残るまで溶液の一部をゆっくりと注入します。その後、ローディングシリンジプランジャーを約25マイクロリットルすばやく上下に数回動かして、細胞表面の気泡を取り除きます。次に、プランジャーがローディングシリンジの100マイクロリットルのマークに達するまでゆっくりと注入し、合計350マイクロリットルの超純水を基準セルに分注し、基準セルカバーを交換します。サンプルセルから残留溶液を除去した後、ローディングシリンジを使用して450マイクロリットルの10ミリモルEDTAをロードし、EDTAが微量金属と結合するため、微量金属イオンが確実に除去されるように10分間浸します。EDTA溶液を除去した後、ローディングシリンジを大量の超純水で十分にすすいでください。メーカーの指示に従って、サンプルセルを超純水ですすいでITCを洗浄してください。サンプルセルから残留水をすべて取り除き、450マイクロリットルのバッファーで少なくとも3回リンスしてサンプルセルを調整します。次に、サンプル細胞をコンディショニングしている残留バッファーを除去し、ローディングシリンジを使用してペプチド溶液をサンプルセルにロードします。次に、最初にプランジャーを取り外して、200マイクロリットルの緩衝溶液で滴定シリンジをすすぎます。マイクロピペットを使用して、ガラス滴定シリンジの上部にある穴からバッファー溶液をシリンジに通し、下の針からピペットで取り出します。その後、プランジャーを滴定シリンジに完全に挿入します。次に、滴定シリンジの針の先端を金属溶液に浸し、プランジャーをゆっくりと引き上げて、金属溶液がシリンジを満たし、滴定シリンジのガラス部分の上部にボイドボリュームを作成します。ボイドボリュームを除去するには、滴定シリンジを床と平行に回転させます。次に、プランジャーを取り外し、ガラス部分を床に向かって少し傾けます。滴定シリンジを静かに振って、溶液が滴定シリンジのガラス部分に移動し、空隙体積の大部分を満たすようにします。ただし、2〜3マイクロリットルのボイドボリュームが残っていることを確認してください。シリンジを床と平行に保ちながら、プランジャーを再度挿入します。次に、滴定シリンジを直立させ、針の先端を金属溶液に戻します。次に、空気が針から出なくなるまでプランジャーを押し下げ、針の先端を溶液に入れたまま、プランジャーを50マイクロリットルのマークのすぐ上までゆっくりと引き上げて滴定シリンジをロードします。滴定シリンジのガラス部分をビュレットに慎重に挿入し、指がきつく締まるまでねじ込みます。その後、軽量の繊細なワイパーを使用して、プランジャーの圧縮により滴定シリンジから出てくる溶液を針の先端に触れることなく吸収します。次に、滴定シリンジ付きのビュレットをサンプルセルに挿入し、しっかりと固定します。ITCソフトウェアのパラメータを設定するには、計測器制御を選択します。攪拌速度と温度を設定します。次に、[実験の詳細]で、シリンジと細胞の濃度をミリモル単位で入力します。次に、[実験方法]セクションで[増分滴定]を選択します。[セットアップ]をクリックして、2.5マイクロリットルの20回の注入を指定し、結合イベントを観察するためにより多くの分解能が必要な場合は、注入回数を増やし、注入あたりの容量を減らします。その後、各注入間の時間間隔を入力して、信号が平衡化してベースラインに戻るのに十分な長さ(通常は300秒)になるようにします。次に、[実行] ボタンをクリックして実験を開始し、データの保存場所を指定します。Cu(II)をC-ペプチドに滴定したところ、150マイクロモルのCu(II)を添加すると、Cu(II)のd-dバンドに起因する600ナノメートルのバンドが即座に増加し、300ミリモルのCu(II)が添加されるまで増加し続けることが示されました。さらに300マイクロモルを超えるCu(II)を添加しても、飽和を示すd-d禁止の吸収は増加せず、Cu(II)はlogK値が6を超える1:1複合体でC-ペプチドに結合します。C-ペプチドは約10マイクロモルの銅-フェン錯体に滴定され、265ナノメートルの電荷移動バンドからの吸収が減少し、C-ペプチドがフェナントロリンリガンドからCu(II)をlogK値7.4〜7.8でキレートできたことを示しています。ITCサーモグラムは、15ミリモルMOPSバッファー中の1.4ミリモルCu(II)から154マイクロモルCペプチドへの滴定を示しています。結合親和性は、8モルあたり8キロジュールとしてエンタルピーの変化を有するlog K値を有することがわかった。ギブズの自由エネルギーはモルあたりマイナス46キロジュール、エントロピーの変化は1モルあたり120ジュール/ケルビンです。C-ペプチドの非存在下で1.4ミリモルのCu(II)を15ミリモルのMOPSバッファーに制御滴定すると、サーモグラムに結合は見られません。すべてがきれいであることを確認すると思います。以前の実験で残った金属イオンまたはペプチドがある場合、化学量論に大きな影響を与え、結合実験で未知の競合を引き起こす可能性があります。円二色性は、キラリティーを調べるため、金属ペプチドまたは金属タンパク質の相互作用を研究する別の方法です。質量分析は、質量の変化を調べることによってこれらの複合体を調べることもできます。この一連の技術は、ペプチドまたはタンパク質と相互作用する金属イオンを研究する多くの研究室で使用されています。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

効力決意アッセイにおけるペプチドアゴニストの連続希釈のために調剤自動アコースティック

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em&gt;インビトロ</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

時間分解エレクトロスプレーイオン化水素 - 重水素交換質量分析タンパク質の構造とダイナミクスを学ぶために

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

臓器移植における HLA 同種抗体の検出のためのペプチド配列をお好み

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

SDS ページを用いたリン酸 binding タグ LRRK2 活動によって Rab10 リン酸化検出

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

核と細胞骨格との間の機械的統合を測定するための直接力プローブ

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

高速遠心分離のない状態で U937 細胞のセル分別

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...