Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

SC는 Whitehead Summer Research Fellowship에 감사드립니다. MJS는 샌프란시스코 대학의 스타트업 펀드와 교수 개발 기금에 감사를 표합니다. MCH는 국립 보건원 (NIH MIRA 5R35GM133684-02)과 국립 과학 재단 (NSF CAREER 2048265)의 기금을 인정합니다.

1. 전자 흡수 분광법 : 완충 경쟁을 통한 직접 적정
<ol><li>시료 준비<ol>
<li>초순수 (>18 MΩ 저항)를 사용하여 pH 7.4에서 50 mM 2-[비스(2-히드록시에틸)아미노]-2-(히드록시메틸)프로판-1,3-디올 (비스트리스)의 완충 용액을 제조하였다. 후속 여과와 함께 적어도 2시간 동안 고친화성 수지와 함께 인큐베이션함으로써 미량 금속 이온을 제거한다.</li>
		<li>공지된 양의 펩티드를 무금속 완충제 ?...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

이 글은 펩티드에 대한 Cu(II) 결합의 친화도 및 열역학을 정량화하기 위한 강력한 방법을 제공한다. Cu(II)를 갖는 착물은d9 전자 구성으로 인해 금속 부위에서 d-d 흡수 밴드를 모니터링하는 데 이상적으로 적합하다. 비록 소멸 계수가 작고, 따라서 신뢰할 수 있는 신호를 산출하기 위해 복합체의 더 큰 농도가 필요하지만, 펩티드로의 Cu(II)의 적정은 결합 화학량론과 근사 결합 친화도에 대한...

생물학은 생명체가 주변 환경에 적응하고 생존하는 데 필요한 금속 이온의 다양한 화학을 활용하도록 진화했습니다. 단백질의 약 25%-50%가 구조와 기능을 위해 금속 이온을 사용한다1. 금속 이온의 특정 역할 및 산화환원 상태는 이를 배위하는 생물학적 리간드의 조성 및 기하학적 구조와 직접적으로 관련된다. 또한, Cu(II)와 같은 산화환원 활성 금속 이온은 반응성 산소 종(ROS)2,3,4를 형성하기 위해 펜톤과 같은 화학을 통해 산화제와 상호작용하지 않도록 엄격하게 조절되어야 한다. 생화학을 주도하는 결합 모드와 친화도를 이해하면 금속 이온의 생물학적 역할을 밝히는 데 도움이됩니다.
많은 기술이 금속과 펩티드의 결합 상호작용을 연구하기 위해 사용된다. 이들은 대부분 분광학적 기술이지만 아밀로이드 베타 (Aβ)5의 단편과의 Cu (II) 상호 작용을 통해 볼 수 있듯이 분자 역학을 사용하는 컴퓨터 시뮬레이션도 포함합니다. 많은 대학에서 접근 할 수있는 널리 사용되는 분광 기술은 핵 자기 공명 (NMR)입니다. Cu (II)의 상자성 성질을 사용함으로써, Gaggelli et al.은 근처의 핵6의 이완을 통해 금속 이온이 잎자루에 결합하는 곳을 보여줄 수있었습니다. 전자 상자성 공명(EPR)은 또한 상자성 금속 이온 결합(7)의 위치 및 모드를 프로브하는데 이용될 수 있다. 원형 이색성(CD)과 같은 다른 분광학적 기술은 트리펩타이드 시스템(8)과 같은 시스템에서 Cu(II)에 대한 배위를 기술할 수 있고, 질량 분광법은 화학량론적 및 금속 이온의 잔기가 단편화 패턴(9,10)을 통해 배위되는 것을 보여줄 수 있다.
NMR과 같은 이러한 기술 중 일부는 라벨이 없지만 많은 농도의 펩타이드가 필요하므로 연구에 어려움을 초래합니다. 형광 분광법(fluorescence spectroscopy)이라고 불리는 또 다른 일반적인 기술은 티로신 또는 트립토판의 위치를 Cu(II)11,12로부터의 담금질과 관련시키기 위해 이용되었다. 유사하게, 이 기술은 Cu(II) 결합(13)의 결과로서 구조적 변화를 보여줄 수 있다. 그러나 이러한 금속-펩티드 결합 연구의 과제는 모든 시스템이 가지고 있지 않은 티로신과 같은 염색체 아미노산을 프로브하고, 금속 이온이 고전적인 모델 하에서 결합하며, 이 기술이 생리적 조건 하에서 도움이 되지 않을 수 있다는 것이다. 실제로, 이러한 염색체 아미노산을 함유하지 않거나 고전적 모델 하에서 결합하지 않는 몇몇 펩티드가 출현하고 있으며, 이러한 기술(14,15)의 사용을 배제하고 있다. 이 기사에서는 생리학적으로 관련된 조건에서 이러한 시나리오에서 결합 특성을 평가하기 위한 접근 방식을 자세히 설명합니다.
생물학적 리간드는 히스티딘 상의 이미다졸 고리와 같은 금속 이온 결합에 영향을 미칠 수 있는 상이한 양성자화 상태를 채택할 수 있다. pH가 일관되게 유지되지 않으면 결과가 복잡하거나 충돌할 수 있습니다. 이러한 이유로 버퍼는 금속 - 단백질 / 펩티드 상호 작용 연구에 필수적인 구성 요소입니다. 그러나, 많은 완충제들이 금속 이온들(16,17)과 호의적으로 상호작용하는 것으로 나타났다. 관심있는 생물학적 분자와 경쟁하는 것에 더하여, 완충제는 펩티드 또는 단백질의 배위 원자와 구별하기 어려울 수 있는 유사한 배위 원자를 가질 수 있다. 이 연구에서는 Cu (II) - 펩티드 상호 작용을 연구하기위한 두 가지 보완 기술로서 전자 흡수 분광법 및 등온 적정 열량계 (ITC)에 중점을두고 있으며 버퍼 선택과 관련하여 특별한 고려 사항이 있습니다.
전자 흡수 분광법은 금속 결합 상호 작용을 연구하기위한 빠르고 널리 접근 가능한 기술입니다. 자외선(UV) 또는 가시광선 파장에서 광을 조사하면 리간드 분류, 금속 기하학적 및 명백한 결합 친화도18,19에 대한 귀중한 정보를 제공하는 금속 중심 d-d 밴드의 흡수를 유도할 수 있습니다. 이러한 복합체의 경우, 금속 이온을 단백질 또는 펩티드 용액으로 직접 적정하면 결합 화학량론과 명백한 결합 친화도를 정량화할 수 있습니다. d5 또는d10 전자 구성과 같은 일부 경우에, 복합체는 광을 흡수하지 않는다(즉, 분광학적으로 침묵한다). 이러한 분광학적으로 침묵하는 전이 금속 착물에서, 이러한 제한은 금속 이온에 배위될 때, 검출가능한 전하 전달 밴드를 산출하는 경쟁 리간드를 사용함으로써 회피될 수 있다. 두 경우 모두 이 접근법은 화학량론과 명백한 결합 친화도만을 정량화하는 것으로 제한되며, 근사치 없이는 결합 엔탈피에 대한 통찰력이 제공되지 않습니다.
전자 흡수 분광법으로부터 얻은 정보를 보완하는 ITC는 결합 엔탈피(20)의 직접적이고 엄격한 정량화를 위한 매력적인 기술이다. ITC는 결합 이벤트 동안 방출되거나 소비되는 열을 직접 측정하고, 적정이 일정한 압력에서 일어나기 때문에, 측정된 열은 모든 평형(ΔHITC)의 엔탈피이다. 또한, 결합 사건 (n) 및 겉보기 결합 친화도 (KITC)의 화학량론이 정량화된다. 이들 파라미터로부터, 자유 에너지(ΔG ITC) 및 엔트로피(ΔSITC)가 결정되어, 결합 이벤트의 열역학적 스냅샷을 제공한다. 광 흡수에 의존하지 않기 때문에, ITC는 분광학적으로 침묵하는 종, 예를 들어,d5 또는d10 금속 이온 착물에 이상적인 기술이다. 그러나, 열량계가 열을 측정하기 때문에, 임의의 타의 추종을 불허하는 완충 시스템 및 설명되지 않은 평형은 금속 이온 결합 열역학을 정확하게 결정하기 위해 분석에 악영향을 미칠 수 있고, 이들 인자(20)를 다루기 위해 세심한 주의를 기울여야 한다. 적절한 엄격함으로 수행되는 경우, ITC는 금속-단백질/펩티드 복합체의 열역학을 결정하기 위한 강력한 기술입니다.
여기서, 염색체적으로 침묵하는 구리-결합 펩티드, C-펩티드는 두 기술의 상보적인 사용을 입증하기 위해 사용된다. C-펩티드는 인슐린 성숙 동안 형성된 31개의 잔기 절단 생성물 (EAEDLQVGQVELGPGAGSLQPLALEGSLQ)이고; 그것은 염색체 잔기가 부족하지만 Cu (II)를 생리 학적 관련 친화력14,15와 결합하는 것으로 나타났습니다. Cu(II) 결합 부위는 글루타메이트와 아스파르테이트의 측쇄 뿐만 아니라 펩티드14,15의 N 말단으로 구성된다. 이러한 조정 원자는 일반적으로 사용되는 많은 완충 시스템의 원자와 매우 유사합니다. 여기서, C-펩티드에 대한 Cu(II) 결합 열역학을 정량화하기 위한 전자 흡수 분광법 및 ITC에서의 d-d 및 전하 전달 밴드의 탠덤 사용이 도시되어 있다. C-펩티드에 대한 Cu(II) 결합을 연구하는 접근법은 다른 금속 이온 및 단백질/펩티드 시스템에 적용될 수 있다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

구리(II)는 생물학적 시스템에서 필수적인 금속으로, 그것이 상호작용하는 생체분자에 독특한 화학적 성질을 부여한다. 다양한 펩타이드에 직접 결합하고 매개구조에서 전자전달 특성, 촉매 기능 부여에 이르기까지 필요하고 병리학적인 역할을 모두 수행하는 것으로 보고되었다. 시험관 내에서 이러한 Cu(II)-펩티드 복합체의 결합 친화도 및 열역학을 정량화하는 것은 결합의 열역학적 추진력, 펩티드에 대한 상이한 금속 이온 사이의 또는 Cu(II)에 대한 상이한 펩티드 사이의 잠재적 경쟁, 및 생체내에서 Cu(II)-펩티드 복합체의 보급에 대한 통찰력을 제공한다. 그러나, 결합 열역학을 정량화하는 것은 적정 실험 내의 모든 경쟁 평형을 고려하는 것을 포함하여 무수한 요인들로 인해 어려울 수 있으며, 특히 펩티드, d-블록 금속 이온 및 이들의 상호작용을 나타내는 이산 분광학적 핸들이 부족한 경우에 더욱 그러하다.
여기에서, Cu(II)-펩티드 열역학의 정확한 정량화를 위한 강력한 실험 세트가 제공된다. 이 기사는 Cu (II)에 필요한 분광학적 핸들을 제공하고 라벨이없는 등온 적정 열량계의 사용을 제공하기 위해 염색체 리간드의 유무에 전자 흡수 분광법을 사용하는 데 중점을 둡니다. 두 실험 기술 모두에서, 모든 경쟁 평형을 설명하기 위해 프로세스가 설명된다. 이 기사의 초점은 Cu (II)에 있지만, 설명 된 일련의 실험은 Cu (II) - 펩티드 상호 작용을 넘어 적용 할 수 있으며 생리 학적 관련 조건 하에서 다른 금속 - 펩티드 시스템의 정확한 정량화를위한 프레임 워크를 제공 할 수 있습니다.

목표는 전자 흡수 분광법 및 ITC의 상보적 기술을 사용하여 C-펩티드에 결합하는 Cu(II)의 열역학을 정량화하고 확증하는 것이었다. 전자 흡수 분광법의 견고한 특성으로 인해, Cu(II)를 300 μM C-펩티드로 직접 적정을 수행하였다(도 1). 150 μM의 Cu(II)의 첨가는 Cu(II)의 d-d 밴드에 기인하여 600 nm에서 밴드의 즉각적인 증가를 야기하고, 300 μM Cu(II)가 첨가될 때까지 계속 증가하였다. ?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

이 기사는 펩티드 및 단백질에 결합하는 Cu (II)의 열역학을 조사하고 정량화하기 위해 전자 흡수 분광법 및 등온 적정 열량계의 사용에 중점을 둡니다.

발색단의 존재 및 부재 하에 Cu(II)와 펩티드 잔기 사이의 결합 상호작용을 정량화하기

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

이 방법을 통해 연구원은 펩타이드 및 1열 전이 금속 이온과 같이 연구하기 어려운 시스템을 조사할 수 있으며, 둘 다 일반적으로 더 많은 표준 응용 분야를 사용하는 것이 어렵습니다. 여기서 가장 큰 장점은 직교 기술을 사용하여 서로를 잘 보완하고 시스템에 대한 더 많은 통찰력을 제공하고 현상을 놓치지 않도록 도와줍니다. 이 비디오에 자세히 설명 된 방법은 다른 시스템을 연구하는 데 매우 적합합니다.Cu (II) 및 펩타이드로 보여 주지만 다양한 금속 펩타이드 및 금속 단백질 상호 작용에 사용할 수 있습니다. 가장 어려운 부분은 금속 이온과 펩타이드에 대한 좋은 버퍼 선택을 찾는 것입니다. 나는 이전에 다른 사람들이 어떤 버퍼를 사용했는지 알아보기 위해 문헌을 참조할 것입니다.절차를 시연하는 것은 내 연구실의 대학원생 인 최소희입니다. 시작하려면 전자 흡수 분광 광도계를 켜고 사용하기 전에 약 15-20 분 동안 예열하십시오. 그런 다음 분광 광도계 소프트웨어를 실행하고 200-900 나노 미터의 스캔 범위, 초당 200 나노 미터의 스캔 범위 및 이중 빔 기준선 수정과 같은 매개 변수를 구성합니다.다음으로, 빔 경로에 큐벳이나 샘플이 없는 기준선을 수집합니다. 이중 빔 분광 광도계에서 일치하는 두 개의 큐벳을 사용하여 큐벳에 115마이크로리터의 초순수가 들어오고 다른 큐벳에 115마이크로리터의 펩타이드 샘플을 로드하면서 큐벳에 기포가 없는지 확인합니다. 그런 다음 초순수가 있는 큐벳을 기준 빔에 놓고 펩타이드가 있는 큐벳을 샘플 빔에 놓습니다.그런 다음 금속이없는 펩타이드의 흡수 스펙트럼을 수집합니다. 화학량론적 양의 Cu(II) 용액을 펩타이드 샘플이 있는 큐벳에 추가하고 나중에 분석할 수 있도록 부피를 기록합니다. 기포 생성을 피하면서 용액을 혼합하기 위해 위아래로 부드럽게 파이프하십시오.5분 동안 평형을 이룬 후 큐벳을 샘플 셀 홀더에 다시 넣고 흡수 스펙트럼을 기록합니다. 그런 다음 다양한 당량에 대해 펩타이드 용액에 Cu (II) 부분 표본을 첨가하고 큐벳에 첨가 된 Cu (II)의 총 부피를 기록합니다. 앞에서 설명한 대로 소프트웨어를 초기화한 후 두 개의 일치하는 큐벳에 115마이크로리터의 초순수가 포함된 큐벳 1개와 115마이크로리터의 구리-펜 복합 용액이 있는 다른 큐벳을 로드합니다.기준 빔에 물이 있는 큐벳을 놓고 샘플 빔에 구리-펜 복합 용액이 있는 큐벳을 놓습니다. 그런 다음 금속 리간드 복합체의 흡수 스펙트럼을 수집합니다. 그런 다음 구리-펜 복합 용액에 화학량론적 양의 펩타이드를 넣고 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 위아래로 부드럽게 파이프하여 완전히 혼합합니다.다음으로, 평형에 도달하기 위해 용액을 5 분 동안 배양한다. 큐벳을 샘플 셀 홀더에 다시 넣고 흡수 스펙트럼을 기록합니다. 나중에, 다양한 당량물에 대한 구리-펜 복합체 용액에 펩티드 분취량의 첨가를 반복하고, 희석된 농도가 결정될 수 있도록 첨가된 펩티드의 부피를 기록한다.먼저 ITC를 켜고 ITC 소프트웨어를 실행하여 계측기를 실행합니다. 첫 번째 초기화 후 뷰렛을 다시 이동하고 화면의 지시를 따릅니다. 그런 다음 뷰렛과 덮개를 참조 셀에서 제거합니다.그런 다음 기준 셀에서 물을 제거하고 450마이크로리터의 탈기된 초순수로 3회 헹굽니다. 주사기에 기포가 유입되지 않도록 주의하면서 로딩 주사기의 450마이크로리터 표시까지 초순수를 천천히 끌어올립니다. 그런 다음 로딩 주사기를 바닥에서 약 1mm가 될 때까지 기준 셀에 삽입하고 로딩 주사기에 150마이크로리터가 남을 때까지 용액의 일부를 천천히 주입합니다.그런 다음 로딩 시린지 플런저를 약 25마이크로리터씩 빠르게 위아래로 여러 번 움직여 셀 표면의 기포를 제거합니다. 그런 다음 플런저가 로딩 주사기의 100마이크로리터 표시에 도달할 때까지 천천히 주입하여 총 350마이크로리터의 초순수를 기준 셀에 분주하고 기준 셀 덮개를 교체합니다. 샘플 셀에서 잔류 용액을 제거한 후 로딩 주사기를 사용하여 450마이크로리터의 10밀리몰 EDTA를 로드하고 EDTA가 미량 금속과 결합하므로 미량 금속 이온이 제거되도록 10분 동안 담가 둡니다.EDTA 용액을 제거한 후 로딩 주사기를 다량의 초순수로 완전히 헹굽니다. 초순수로 샘플 셀을 헹구어 제조업체의 지침에 따라 ITC를 청소하십시오. 샘플 셀에서 잔류 물을 제거한 다음 450마이크로리터의 버퍼로 최소 3회 헹구어 샘플 셀을 컨디셔닝합니다.다음으로, 샘플 셀을 컨디셔닝하는 잔류 완충액을 제거하고 로딩 주사기를 사용하여 샘플 셀 내로 펩티드 용액을 로딩한다. 그런 다음 먼저 플런저를 제거하여 200 마이크로 리터의 완충 용액으로 적정 주사기를 헹굽니다. 마이크로 피펫을 사용하여 유리 적정 주사기 상단의 구멍을 통해 완충 용액을 주사기를 통해 아래 바늘 밖으로 피펫팅합니다.나중에 플런저를 적정 주사기에 완전히 삽입하십시오. 그런 다음 적정 주사기 바늘의 끝을 금속 용액에 담그고 플런저를 천천히 위로 당겨 금속 용액이 주사기를 채우고 적정 주사기의 유리 부분 상단에 빈 부피가 생깁니다. 공극 부피를 제거하려면 적정 주사기를 바닥과 평행하게 돌립니다.그런 다음 플런저를 제거하고 유리 부분을 바닥쪽으로 약간 기울입니다. 용액이 적정 주사기의 유리 부분으로 이동하여 대부분의 공극 부피를 채우도록 적정 주사기를 부드럽게 흔듭니다. 그러나 2-3 마이크로 리터의 공극 부피가 남아 있는지 확인하십시오.주사기를 바닥과 평행하게 유지하면서 플런저를 다시 삽입하십시오. 그런 다음 적정 주사기를 똑바로 잡고 바늘 끝을 금속 용액에 다시 담그십시오. 다음으로, 바늘에서 공기가 나오지 않을 때까지 플런저를 아래로 밀고 바늘 끝을 용액에 유지하면서 플런저를 50마이크로리터 표시 바로 위로 천천히 당겨 적정 주사기를 로드합니다.적정 주사기의 유리 부분을 뷰렛에 조심스럽게 삽입하고 손가락이 조여질 때까지 조입니다. 그 후, 가벼운 섬세한 와이퍼를 사용하여 플런저의 압축으로 인해 적정 주사기에서 나오는 용액을 바늘 끝을 건드리지 않고 흡수합니다. 그런 다음 적정 주사기로 뷰렛을 샘플 셀에 삽입하고 단단히 고정합니다.ITC 소프트웨어의 파라미터를 설정하려면 계측기 제어를 선택하십시오. 교반 속도와 온도를 설정합니다. 그런 다음 실험 세부 정보에서 주사기와 세포 농도를 밀리몰 단위로 입력합니다.다음으로, 실험 방법 섹션에서 증분 적정을 선택합니다. 설정을 클릭하고 2.5 마이크로 리터의 20 회 주입을 지정하고 결합 이벤트를 관찰하기 위해 더 많은 분해능이 필요한 경우 주입 횟수를 늘리고 주입 당 부피를 줄입니다. 그런 다음 신호가 평형을 이루고 기준선으로 돌아갈 수 있을 만큼 충분히 길도록 각 주입 사이의 시간 간격(일반적으로 300초)을 입력합니다.그런 다음 실행 단추를 클릭하여 실험을 시작하고 데이터가 저장되는 위치를 지정합니다. Cu (II)의 적정은 150 마이크로 몰의 Cu (II)의 첨가가 Cu (II)의 d-d 밴드에 기인 한 600 나노 미터의 밴드에서 즉각적인 증가를 일으켰으며 300 밀리몰 Cu (II)가 첨가 될 때까지 계속 증가한다는 것을 입증했다. 300 마이크로 몰 이상의 Cu (II)를 추가로 첨가해도 포화 상태를 나타내는 d-d 금지의 흡수가 증가하지 않았으며 Cu (II)는 log K 값이 6 이상인 1 : 1 복합체에서 C- 펩타이드에 결합합니다.C-펩타이드는 약 10 마이크로 몰 구리-펜 복합체로 적정되었고 265 나노 미터에서 전하 전달 밴드로부터의 흡수는 감소하여 C- 펩타이드가 7.4에서 7.8의 log K 값을 갖는 페난 트롤린 리간드로부터 Cu (II)를 킬레이트 할 수 있음을 나타냅니다. ITC 서모그램은 15밀리몰 MOPS 완충액에서 1.4밀리몰 Cu(II)를 154마이크로몰 C-펩타이드로 적정한 것을 보여줍니다. 결합 친화도는 몰당 8 킬로 줄로서 엔탈피의 변화와 함께 8의 log K 값을 갖는 것으로 밝혀졌다.Gibbs는 자유 에너지를 몰당 마이너스 46킬로줄로, 엔트로피의 변화는 켈빈당 몰당 120줄입니다. C-펩타이드가 없는 상태에서 15밀리몰 MOPS 완충액으로 1.4밀리몰 Cu(II)를 조절하여 적정한 결과 서모그램에서 결합이 나타나지 않습니다. 나는 모든 것이 깨끗한 지 확인한다고 말할 것입니다.이전 실험에서 남은 금속 이온이나 펩타이드가 있으면 화학량론에 큰 영향을 미치고 결합 실험에서 알려지지 않은 경쟁을 제공할 수 있습니다. 원형 이색성은 키랄성을 보기 때문에 금속 펩타이드 또는 금속 단백질 상호 작용을 연구하는 또 다른 방법입니다. 질량 분석법은 또한 질량의 변화를 관찰하여 이러한 복합체를 조사할 수 있습니다.이 기술 세트는 펩타이드 또는 단백질과 상호 작용하는 금속 이온을 연구하는 많은 실험실에서 사용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

연구

생화학

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

장기 이식에서 HLA Alloantibodies의 검출에 대 한 펩 티 드 배열 맞춤

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

세제에 민감한 막 단백질 사이 상호 작용의 탐지

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

고속 원심 분리의 부재에서 U937 세포의 세포 분별 법

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...