Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

SC takker Whitehead Summer Research Fellowship. MJS takker oppstartsfondene og fakultetets utviklingsfond ved University of San Francisco. MCH anerkjenner finansiering fra National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) og National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

1. Elektronisk absorpsjonsspektroskopi: direkte titrering med bufferkonkurranse
<ol><li>Prøve forberedelse<ol>
<li>Forbered en bufret løsning av 50 mM 2-[bis(2-hydroksyetyl)amino]-2-(hydroksymetyl)propan-1,3-diol (bisTris) ved pH 7.4 ved bruk av ultrarent vann (>18 MΩ motstand). Fjern spormetallioner ved å inkubere med en høyaffinitetsharpiks i minst 2 timer med påfølgende filtrering.</li>
		<li>Løs opp eller fortynn en kjent mengde av peptidet i den metallfrie bufferen. MERK: Ved overvåkin...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

Denne artikkelen gir en robust metode for å kvantifisere affiniteten og termodynamikken til Cu(II)-bindingen til peptider. Komplekser med Cu (II) er ideelt egnet til å overvåke d-d absorpsjonsbåndet på metallstedet på grunn av sin d9 elektronkonfigurasjon. Selv om ekstinksjonskoeffisienten er liten, og dermed krever større konsentrasjoner av komplekset for å gi et pålitelig signal, kan titreringer av Cu(II) til peptid raskt gi innsikt i bindende støkiometri og omtrentlig bindingsaffinitet. Det kan im...

Biologi har utviklet seg til å utnytte den mangfoldige kjemien til metallioner som trengs for at livet skal tilpasse seg og overleve i omgivelsene. Anslagsvis 25% -50% av proteiner bruker metallioner for struktur og funksjon1. Den spesielle rollen og redokstilstanden til metallionen er direkte relatert til sammensetningen og geometrien til de biologiske ligandene som koordinerer den. I tillegg må redoksaktive metallioner som Cu (II) reguleres tett slik at de ikke interagerer med oksidasjonsmidler via Fenton-lignende kjemi for å danne reaktive oksygenarter (ROS) 2,3,4. Å forstå bindingsmodusene og affiniteten som driver biokjemien, bør bidra til å belyse metallionets biologiske rolle.
Mange teknikker brukes til å studere bindingsinteraksjonene mellom metaller og peptider. Disse er for det meste spektroskopiske teknikker, men inkluderer også datasimuleringer ved hjelp av molekylær dynamikk, sett gjennom Cu (II) interaksjoner med et fragment av amyloid beta (Aβ) 5. En mye brukt spektroskopisk teknikk som er tilgjengelig for mange universiteter er kjernemagnetisk resonans (NMR). Ved å bruke den paramagnetiske naturen til Cu (II), kunne Gaggelli og medarbeidere vise hvor metallionet binder seg på et petide gjennom avslapning av nærliggende kjerner6. Elektronparamagnetisk resonans (EPR) kan også benyttes til å undersøke plasseringen og modusen til den paramagnetiskemetallionbindingen 7. Andre spektroskopiske teknikker som sirkulær dikroisme (CD) kan beskrive koordinasjonen om Cu(II) i systemer som tripeptidsystemer8, og massespektrometri kan vise støkiometri og hvilke rester metallionet koordineres gjennom fragmenteringsmønstre 9,10.
Noen av disse teknikkene, som NMR, er etikettfrie, men krever store konsentrasjoner av peptid, noe som gir utfordringer for studier. En annen vanlig teknikk kalt fluorescensspektroskopi har blitt brukt til å relatere posisjonen til en tyrosin eller tryptofan med slukking fra en Cu (II) 11,12. På samme måte kan denne teknikken vise strukturelle endringer som følge av Cu (II) binding13. Utfordringer med disse metallpeptidbindingsstudiene er imidlertid at de undersøker kromoforaminosyrer som tyrosin som ikke alle systemer har, at metallionet binder seg under en klassisk modell, og at teknikken kanskje ikke bidrar under fysiologiske forhold. Faktisk dukker det opp flere peptider som ikke inneholder slike kromoforaminosyrer eller binder seg under klassiske modeller, og utelukker bruken av disse teknikkene14,15. Denne artikkelen beskriver tilnærminger for å vurdere bindingsegenskaper i disse scenariene under fysiologisk relevante forhold.
Biologiske ligander kan vedta forskjellige protoneringstilstander som kan påvirke metallionbinding som imidazolringen på histidin. Hvis pH ikke opprettholdes konsekvent, kan resultatene være innviklede eller motstridende. Av denne grunn er buffere en viktig komponent i studiet av metall-protein / peptid-interaksjoner. Imidlertid har mange buffere vist seg å samhandle gunstig med metallioner16,17. I tillegg til å konkurrere med det biologiske molekylet av interesse, kan bufferen ha lignende koordinerende atomer som kan være vanskelig å skille fra de koordinerende atomene i peptidet eller proteinet. I denne studien fokuseres det på elektronisk absorpsjonsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) som to komplementære teknikker for å studere Cu(II)-peptidinteraksjoner, med spesielle hensyn til buffervalg.
Elektronisk absorpsjonsspektroskopi er en rask, allment tilgjengelig teknikk for å studere metallbindende interaksjoner. Bestråling med lys i ultrafiolette (UV) eller synlige bølgelengder kan føre til absorpsjon av metallsentrerte d-d-bånd, som gir verdifull informasjon om ligandklassifisering, metallgeometrier og tilsynelatende bindingsaffiniteter 18,19. For disse kompleksene kan direkte titreringer av metallioner til protein- eller peptidløsninger kvantifisere bindende støkiometrier og tilsynelatende bindingsaffiniteter. I noen tilfeller, for eksempel d5 eller d10 elektronkonfigurasjoner, absorberer komplekset ikke lys (dvs. er spektroskopisk stille). I disse spektroskopisk stille overgangsmetallkompleksene kan disse begrensningene omgås ved å bruke en konkurrerende ligand som ved koordinering til metallionet gir detekterbare ladningsoverføringsbånd. I begge tilfeller er denne tilnærmingen begrenset til å kvantifisere bare støkiometri og tilsynelatende bindingsaffinitet, og ingen innsikt i bindende entalpi er gitt uten tilnærminger.
Komplementerende informasjon hentet fra elektronisk absorpsjonsspektroskopi, er ITC en attraktiv teknikk for direkte og streng kvantifisering av bindingsentalpien20. ITC måler direkte varmen som frigjøres eller forbrukes under en bindingshendelse, og siden titrering skjer ved konstant trykk, er den målte varmen entalpien til alle likevekter (ΔHITC). I tillegg kvantifiseres støkiometrien til bindingshendelsen (n) og den tilsynelatende bindingsaffiniteten (KITC). Fra disse parametrene bestemmes fri energi (ΔGITC) og entropi (ΔSITC), noe som gir et termodynamisk øyeblikksbilde av bindingshendelsen. Siden det ikke er avhengig av lysabsorpsjon, er ITC en ideell teknikk for spektroskopisk stille arter, for eksempel d5 eller d10 metallionkomplekser. Siden kalorimetri måler varme, kan imidlertid eventuelle uovertrufne buffersystemer og ikke-regnskapsførte likevekter påvirke analysen negativt for å nøyaktig bestemme metallionbindende termodynamikk, og det må utvises stor forsiktighet for å løse disse faktorene20. Hvis itc utføres med riktig strenghet, er itc en robust teknikk for å bestemme termodynamikken til metallprotein/peptidkomplekser.
Her brukes et kromoforisk stille kobberbindende peptid, C-peptid, for å demonstrere komplementær bruk av de to teknikkene. C-peptid er et 31 rester spaltningsprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) dannet under insulinmodning; den mangler kromoforrester, men har vist seg å binde Cu(II) med fysiologisk relevant affinitet14,15. Cu(II)-bindingsstedet består av sidekjedene til et glutamat og et aspartat samt N-enden av peptidet14,15. Disse koordinerende atomene ligner på mange vanlige bufrede systemer. Her vises tandembruken av d-d- og ladningsoverføringsbåndene i elektronisk absorpsjonsspektroskopi og ITC for å kvantifisere Cu (II) bindende termodynamikk til C-peptid. Tilnærmingen fra å studere Cu (II) binding til C-peptid kan brukes på andre metallioner og protein / peptid systemer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

Kobber (II) er et essensielt metall i biologiske systemer, som gir unike kjemiske egenskaper til biomolekylene som det samhandler med. Det har blitt rapportert å binde seg direkte til en rekke peptider og spille både nødvendige og patologiske roller som spenner fra medierende struktur til elektronoverføringsegenskaper for å gi katalytisk funksjon. Kvantifisering av bindingsaffiniteten og termodynamikken til disse Cu(II)-peptidkompleksene in vitro gir innsikt i den termodynamiske drivkraften til binding, potensielle konkurranser mellom forskjellige metallioner for peptidet eller mellom forskjellige peptider for Cu(II), og utbredelsen av Cu(II)-peptidkomplekset in vivo. Kvantifisering av bindingstermodynamikken kan imidlertid være utfordrende på grunn av en myriade av faktorer, inkludert å ta hensyn til alle konkurrerende likevekter i et titreringseksperiment, spesielt i tilfeller der det mangler diskrete spektroskopiske håndtak som representerer peptidet, d-blokkmetallionet og deres interaksjoner.
Her er et robust sett med eksperimenter gitt for nøyaktig kvantifisering av Cu (II) -peptid termodynamikk. Denne artikkelen fokuserer på bruk av elektronisk absorpsjonsspektroskopi i nærvær og fravær av kromoforiske ligander for å gi det nødvendige spektroskopiske håndtaket på Cu (II) og bruken av etikettfri isotermisk titreringskalorimetri. I begge eksperimentelle teknikker beskrives en prosess for å redegjøre for alle konkurrerende likevekter. Mens fokuset i denne artikkelen er på Cu (II), kan det beskrevne settet av eksperimenter gjelde utover Cu (II) -peptidinteraksjoner, og gi et rammeverk for nøyaktig kvantifisering av andre metallpeptidsystemer under fysiologisk relevante forhold.

Målet var å kvantifisere og bekrefte termodynamikken til Cu (II) binding til C-peptid ved hjelp av komplementære teknikker for elektronisk absorpsjonsspektroskopi og ITC. På grunn av den robuste karakteren av elektronisk absorpsjonsspektroskopi ble det utført en direkte titrering av Cu(II) til 300 μM C-peptid (figur 1). Tilsetning av 150 μM Cu (II) forårsaket en umiddelbar økning i båndet ved 600 nm, tilskrevet d-d-båndet til Cu (II), og fortsatte å øke til 300 μM Cu (II) ble t...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Denne artikkelen fokuserer på bruk av elektronisk absorpsjonsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri for å undersøke og kvantifisere termodynamikken til Cu(II)-binding til peptider og proteiner.

Kvantifisering av bindingsinteraksjonene mellom Cu (II) og peptidester i nærvær og fravær av kromoforer

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Denne metoden vil tillate forskeren å undersøke vanskelig å studere systemer, som peptider og første rad overgangsmetallioner, som begge generelt er utfordrende ved bruk av mer standardapplikasjoner. Den største fordelen her er å bruke ortogonale teknikker fordi de utfyller hverandre godt, og det kan gi mer innsikt i systemet og hjelpe oss å ikke gå glipp av noe fenomen. Metoden som er beskrevet i denne videoen er veldig godt egnet for å studere andre systemer.Selv om vi viser det med Cu (II) og et peptid, kan det brukes til mange forskjellige metallpeptid- og metallproteininteraksjoner. Jeg tror den vanskeligste delen vil være å finne en god buffer valg for metall ion og peptid. Jeg vil konsultere litteratur for å se hvilke buffere som har blitt brukt av andre før.demonstrere prosedyren vil være Sohee Choi, en kandidatstudent i mitt forskningslaboratorium. For å begynne, slå på det elektroniske absorpsjonsspektrofotometeret og la det varme opp i omtrent 15 til 20 minutter før bruk. Start deretter spektrofotometerprogramvaren og konfigurer parametrene, for eksempel skanneområde på 200 til 900 nanometer, skanneområdet på 200 nanometer per sekund og dobbeltstrålebaseline.Deretter samler du en grunnlinje uten kyvetter eller prøver i strålebanene. Ved å bruke to matchede kyvetter i dobbeltstrålespektrofotometeret, laster du en kyvette med 115 mikroliter ultrarent vann og den andre kyvetten med 115 mikroliter av peptidprøven samtidig som du sikrer at det ikke er luftbobler i kyvettene, da disse vil forstyrre signalet. Etterpå plasserer du kyvetten med ultrarent vann i referansestrålen og kyvetten med peptid i prøvestrålen.Samle deretter absorpsjonsspekteret til det metallfrie peptidet. Tilsett en substøkiometrisk mengde av Cu(II)-løsningen i kyvetten med peptidprøven og registrer volumet for analyse senere. Rør det forsiktig opp og ned for å blande løsningen samtidig som du unngår generering av luftbobler.Etter å ha balansert i fem minutter, sett kyvetten tilbake i prøvecelleholderen og registrer absorpsjonsspekteret. Gjenta deretter tilsetningen av Cu(II)aliquots i peptidløsningen for forskjellige ekvivalenter og registrer det totale volumet av Cu(II)tilsatt kyvetten. Etter å ha initialisert programvaren som beskrevet tidligere i to matchede kyvetter laster en kyvette med 115 mikroliter ultrarent vann og annen kyvette med 115 mikroliter av kobber-phen kompleks løsning.Plasser kyvetten med vann i referansestrålen og kyvetten med kobber-fenkompleksløsning i prøvestrålen. Deretter samler du absorpsjonsspekteret av metallligandkomplekset. Etterpå legger du til en støkiometrisk mengde peptid til kobber-phen kompleks løsning og forsiktig rør det opp og ned for å blande grundig mens du er forsiktig så du ikke introduserer noen luftbobler.Deretter inkuberer du løsningen i fem minutter for å nå likevekt. Sett kyvetten tilbake i prøvecelleholderen og registrer absorpsjonsspekteret. Senere gjenta tilsetningen av peptid aliquots i kobber-fenkompleksløsningen for forskjellige ekvivalenter, og registrer volumet av tilsatt peptid slik at den fortynnede konsentrasjonen kan bestemmes.Slå først på ITC og start ITC-programvaren for å kjøre instrumentet. Etter den første initialiseringen, finn buretten på nytt og følg instruksjonene på skjermen. Fjern deretter buretten og dekselet fra referansecellen.Fjern deretter vann fra referansecellen og skyll tre ganger med 450 mikroliter avgasset ultrarent vann. Trekk sakte opp ultrarent vann til 450 mikroliter-merket på en sprøyte, og pass på at du ikke fører luftbobler inn i sprøyten. Sett deretter sprøyten inn i referansecellen til den er omtrent en millimeter fra bunnen og injiser sakte en del av løsningen til 150 mikroliter forblir i lastesprøyten.Etterpå beveger du stempelet raskt opp og ned med ca. 25 mikroliter flere ganger for å løsne eventuelle bobler på celleoverflaten. Injiser deretter sakte til stempelet når 100 mikroliter-merket på lastesprøyten, og dispenser dermed totalt 350 mikroliter ultrarent vann inn i referansecellen og bytt ut referansecelledekselet. Etter å ha fjernet eventuell restløsning fra prøvecellen, last 450 mikroliter 10 millimolar EDTA ved hjelp av en lastesprøyte og suge i 10 minutter for å sikre at spormetallioner fjernes fordi EDTA vil binde spormetaller.Etter at EDTA-oppløsningen er fjernet, skyll sprøyten grundig med rikelige mengder ultrarent vann. Rengjør ITC i henhold til produsentens anvisninger ved å skylle prøvecellen med ultrarent vann. Fjern eventuelt gjenværende vann fra prøvecellen og kondisjoner deretter prøvecellen ved å skylle med 450 mikroliter buffer minst tre ganger.Fjern deretter restbufferen som kondisjonerer prøvecellen og last peptidoppløsningen inn i prøvecellen ved hjelp av lastesprøyten. Skyll deretter titreringssprøyten med 200 mikroliter av den bufrede løsningen ved først å fjerne stempelet. Bruk en mikropipette til å pipette bufferløsningen gjennom hullet øverst på glasstitreringssprøyten gjennom sprøyten og ut nålen under.Senere setter du stempelet helt inn i titreringssprøyten. Dypp deretter spissen av titreringssprøytekanylen i metalloppløsningen og trekk stempelet sakte opp, slik at metalloppløsningen fyller sprøyten og resulterer i et tomromsvolum øverst på glassdelen av titreringssprøyten. For å fjerne det tomme volumet, roter titreringssprøyten parallelt med gulvet.Fjern deretter stempelet og vipp glassdelen litt mot gulvet. Rist titreringssprøyten forsiktig slik at oppløsningen beveger seg til glassdelen av titreringssprøyten og fyller det meste av tomromsvolumet. Men sørg for at to til tre mikroliter tomromsvolum forblir.Mens sprøyten holdes parallelt med gulvet, sett stempelet inn igjen. Hold deretter titreringssprøyten loddrett og dypp spissen av nålen tilbake i metalloppløsningen. Skyv deretter stempelet ned til det slutter å komme luft ut av kanylen, og last titreringssprøyten ved å trekke stempelet sakte opp til like over 50 mikroliter-merket mens spissen av kanylen holdes i oppløsningen.Sett glassdelen av titreringssprøyten forsiktig inn i buretten og skru til fingeren er tett. Etterpå, ved hjelp av en lett delikat visker, absorbere løsningen som kommer ut av titreringssprøyten på grunn av kompresjon av stempelet uten å berøre spissen av nålen. Sett deretter buretten med en titreringssprøyte inn i prøvecellen og fest den sikkert.Hvis du vil konfigurere parameterne for ITC-programvaren, velger du Instrumentkontroll. Still inn omrøringshastigheten og temperaturen. Deretter legger du inn sprøyten og cellekonsentrasjonene i millimolare enheter under Eksperimentdetaljer.Deretter velger du Trinnvis titrering i delen Eksperimentmetode. Klikk på Oppsett og spesifiser 20 injeksjoner på 2,5 mikroliter, og hvis det kreves mer oppløsning for å observere bindingshendelsen, øk antall injeksjoner og reduser volumet per injeksjon. Etterpå skriver du inn tidsavstanden mellom hver injeksjon slik at den er lang nok til at signalet kan likestilles og gå tilbake til baseline, vanligvis 300 sekunder.Klikk deretter på Kjør-knappen for å starte eksperimentet og angi hvor dataene skal lagres. Titrering av Cu (II) ble utført i C-peptid som viser at tilsetningen av 150 mikromolar av Cu (II) forårsaket en umiddelbar økning ved båndet ved 600 nanometer tilskrevet d-d-d-båndet av Cu (II) og fortsatte å øke til 300 millimolar Cu (II) ble tilsatt. Ytterligere addisjon over 300 mikromolar Cu(II)økte ikke absorpsjonen av d-d-forbudet som indikerer metning og at Cu(II)binder seg til C-peptid i et 1:1-kompleks med en log K-verdi på mer enn seks.C-Peptid ble titrert til ca. 10 mikromolar kobber-fenkompleks, og absorpsjonen fra ladningsoverføringsbåndet ved 265 nanometer ble redusert, noe som indikerer at C-peptidet var i stand til å chelatere Cu (II) fra fenantropliganden med en log K-verdi på 7,4 til 7,8. ITC-termogrammet viser titrering av 1,4 millimolar Cu(II)til 154 mikromolar C-peptid i 15 millimolar MOPS-buffer. Bindingsaffiniteten ble funnet å ha en log K-verdi på åtte med endring i entalpi som 8 kilojoule per mol.Gibbs fri energi som minus 46 kilojoule per mol, og endring i entropi som 120 joules per mol per kelvin. En kontrollert titrering av 1,4 millimolar Cu(II)til 15 millimolar MOPS buffer i fravær av C-peptid viser ingen binding i termogrammet. Jeg vil si å sørge for at alt er rent.Hvis det er metallioner eller peptider igjen fra tidligere eksperimenter, kan det drastisk påvirke støkiometrien og gi ukjent konkurranse i bindingseksperimentene. Sirkulær dikroisme er en annen metode for å studere metallpeptid- eller metallproteininteraksjoner fordi den ser på kiralitet. Massespektrometri kan også forhøre disse kompleksene ved å se på endringer i masse.Dette settet av teknikker har blitt brukt av mange laboratorier som studerer metallioner som interagerer med peptider eller proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatisert Acoustic Doserings for serie Fortynning av Peptide agonister i Potens Fastsettelse Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Bruke Stillas liposomer for å rekonstituere Lipid-proksimale Protein-protein interaksjoner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Tilpasset peptid matriser for påvisning av HLA Alloantibodies i organtransplantasjon

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning av vaskemiddel-sensitive interaksjoner mellom membran proteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

En direkte Force Probe for å måle mekanisk integrasjon mellom kjernen og Cytoskeleton

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraksjoneres av U937 celler i fravær av høyhastighets sentrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...