Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
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SC agradece a Whitehead Summer Research Fellowship. O MJS agradece aos Fundos de Startup e ao Fundo de Desenvolvimento do Corpo docente da Universidade de São Francisco. O MCH reconhece financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH MIRA 5R35GM133684-02) e da Fundação Nacional de Ciência (NSF CAREER 2048265).

1. Espectroscopia de absorção eletrônica: titulação direta com competição de buffer
<ol><li>Preparação da amostra<ol>
<li>Prepare uma solução tamponada de 50 mM 2-[bis(2-hidroxitila)amino]-2-(hidroximetila)propano-1,3-diol (bisTris) em pH 7.4 usando água ultrapura (resistência >18 MΩ). Remova íons metálicos de traço incubando com uma resina de alta afinidade por pelo menos 2 h com filtragem subsequente.</li>
		<li>Dissolva ou dilua uma quantidade conhecida do peptídeo no buffer sem me...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. 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H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

Este artigo fornece um método robusto para quantificar a afinidade e termodinâmica de(II) vinculando-se aos peptídeos. Complexos com(II) são idealmente adequados para monitorar a banda de absorção d-d no local do metal devido à sua configuração de elétrons d9 . Embora o coeficiente de extinção seja pequeno, exigindo concentrações maiores do complexo para produzir um sinal confiável, as titulações de(II) em peptídeo podem rapidamente fornecer uma visão da estoquiometria vinculante e afinidade...

A biologia evoluiu para utilizar a diversificada química dos íons metálicos necessários para que a vida se adapte e sobreviva em seu ambiente circundante. Estima-se que 25%-50% das proteínas usam íons metálicos para estrutura e função1. O papel particular e o estado redox do íon metálico estão diretamente relacionados com a composição e geometria dos ligantes biológicos que o coordenam. Além disso, íons metálicos ativos de redox, como(II), devem ser fortemente regulados para que não interajam com agentes oxidantes através da química fenton para formar espécies reativas de oxigênio (ROS)2,3,4. Compreender os modos de ligação e afinidade que impulsionam sua bioquímica deve ajudar a elucidar o papel biológico do íon metálico.
Muitas técnicas são utilizadas para estudar as interações vinculantes de metais e peptídeos. Estas são principalmente técnicas espectroscópicas, mas também incluem simulações de computador usando dinâmica molecular, como visto através de interações(II) com um fragmento de beta amiloide (Aβ)5. Uma técnica espectroscópica amplamente utilizada que é acessível a muitas universidades é a ressonância magnética nuclear (RMN). Usando a natureza paramagnética de(II), Gaggelli et al. foram capazes de mostrar onde o íon metálico se liga a um petide através do relaxamento dos núcleospróximos 6. A ressonância paramagnética eletrônica (EPR) também pode ser utilizada para sondar a localização e o modo da ligação de íon metálico paramagnético7. Outras técnicas espectroscópicas, como o dicromaísmo circular (CD) podem descrever a coordenação sobre(II) em sistemas como sistemas tripeptídeos8, e espectrometria de massa pode mostrar estequiometria e para que resíduos o íon metálico seja coordenado através de padrões de fragmentação 9,10.
Algumas dessas técnicas, como a RMN, são livres de rótulos, mas exigem grandes concentrações de peptídeos, colocando desafios para o estudo. Outra técnica comum chamada espectroscopia de fluorescência tem sido utilizada para relacionar a posição de uma tirasina ou triptofano com a sacieçação de um(II)11,12. Da mesma forma, esta técnica pode apresentar alterações estruturais como resultado da ligação(II) 13. No entanto, os desafios com esses estudos de ligação metal-peptídeo são que eles sondam aminoácidos cromofóricos, como a tyrosina que nem todos os sistemas têm, que o íon metálico se liga sob um modelo clássico, e que a técnica pode não ser propícia em condições fisiológicas. De fato, existem vários peptídeos que não contêm tais aminoácidos cromofóricos ou se ligam sob modelos clássicos, impedindo o uso dessas técnicas14,15. Este artigo detalha abordagens para avaliar propriedades vinculantes nesses cenários em condições fisiologicamente relevantes.
Ligantes biológicos podem adotar diferentes estados de protonação que podem afetar a ligação de íons metálicos, como o anel de imidazol na histidina. Se o pH não for mantido de forma consistente, os resultados podem ser complicados ou conflitantes. Por essa razão, os buffers são um componente essencial no estudo das interações metal-proteína/peptídeo. No entanto, muitos buffers têm sido mostrados para interagir favoravelmente com íons metálicos16,17. Além de competir com a molécula biológica de interesse, o tampão pode ter átomos coordenados semelhantes que podem ser difíceis de distinguir dos átomos coordenadores do peptídeo ou proteína. Neste estudo, o foco está na espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria isotemal de titulação (ITC) como duas técnicas complementares para o estudo das interações(II)-peptídeos, com considerações especiais sobre a escolha do tampão.
A espectroscopia de absorção eletrônica é uma técnica rápida e amplamente acessível para estudar interações de ligação metálica. A irradiação com luz no comprimento de onda ultravioleta (UV) ou visível pode levar à absorção de bandas d-d centradas no metal, que fornecem informações valiosas sobre classificação de ligantes, geometrias metálicas e afinidades de ligação aparente18,19. Para esses complexos, as titulações diretas de íons metálicos em soluções de proteína ou peptídeo podem quantificar estoquitometrias vinculantes e afinidades aparentes de ligação. Em alguns casos, como configurações de5 oud 10 elétrons, o complexo não absorve luz (ou seja, é espectroscopicamente silencioso). Nestes complexos metálicos de transição espectroscópicamente silenciosos, essas limitações podem ser contornadas usando um ligante concorrente que, ao coordenar para o íon metálico, produz faixas detectáveis de transferência de carga. Em ambos os casos, esta abordagem limita-se a quantificar apenas a estequiometria e a afinidade de ligação aparente, e nenhuma percepção sobre a entalpia vinculante é fornecida sem aproximações.
Complementando informações obtidas a partir da espectroscopia de absorção eletrônica, o ITC é uma técnica atraente para quantificação direta e rigorosa da ligaçãoenthalpy 20. O ITC mede diretamente o calor liberado ou consumido durante um evento de ligação e, uma vez que a titulação ocorre em pressão constante, o calor medido é a entalpia de todo o equilíbrio (ΔHITC). Além disso, quantificam-se a estequiometria do evento de ligação (n) e a aparente afinidade de ligação (KITC). A partir desses parâmetros, a energia livre (ΔGITC) e a entropia (ΔSITC) são determinadas, fornecendo um instantâneo termodinâmico do evento de ligação. Como não depende da absorção de luz, o ITC é uma técnica ideal para espécies espectroscopicamente silenciosas, por exemplo, d5 ou d10 peles de íons metálicos. No entanto, uma vez que a calorimetria mede o calor, qualquer sistema tampão incomparável e equilíbrio não contabilizado pode afetar negativamente a análise para determinar com precisão a termodinâmica de ligação de íons metálicos, e muito cuidado deve ser tomado para lidar com esses fatores20. Se realizado com o rigor adequado, o ITC é uma técnica robusta para determinar a termodinâmica dos complexos metal-proteína/peptídeo.
Aqui, um peptídeo de ligação de cobre cromoohoricamente silencioso, C-peptídeo, é usado para demonstrar o uso complementar das duas técnicas. C-peptídeo é um produto de decote de resíduos (EAEDLQVGQGQGGGGGLQPLALEGSLQ) formado durante a maturação da insulina; não possui resíduos cromofóricos, mas tem se mostrado que liga(II) com afinidade fisiologicamente relevante14,15. O sítio de ligação(II) consiste nas cadeias laterais de um glutamato e um aspartato, bem como o N-terminus do peptídeo 14,15. Estes átomos coordenadores se assemelham muito aos de muitos sistemas tamponados comumente usados. Aqui, é mostrado o uso tandem das bandas d-d e transferência de carga em espectroscopia de absorção eletrônica e ITC na quantificação da termodinâmica de ligação(II) para C-peptídeo. A abordagem do estudo(II) vinculativo ao C-peptídeo pode ser aplicada a outros íons metálicos e sistemas de proteína/peptídeo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

O cobre(II) é um metal essencial em sistemas biológicos, conferindo propriedades químicas únicas às biomoléculas com as quais interage. Foi relatado para se ligar diretamente a uma variedade de peptídeos e desempenhar papéis necessários e patológicos que vão desde a estrutura mediadora até propriedades de transferência de elétrons até a função catalítica de transmissão. Quantificar a afinidade vinculante e a termodinâmica desses complexos(II)-peptídeos in vitro fornece insights sobre a força motriz termodinâmica de vinculação, competições potenciais entre diferentes íons metálicos para o peptídeo ou entre peptídeos diferentes para(II), e a prevalência do complexo(II)-peptídeo in vivo. No entanto, quantificar a termodinâmica de ligação pode ser desafiador devido a uma miríade de fatores, incluindo a contabilização de todos os equilíbrios concorrentes dentro de um experimento de titulação, especialmente nos casos em que há falta de alças espectroscópicas discretas representando o peptídeo, o íon metálico d-block e suas interações.
Aqui, um conjunto robusto de experimentos é fornecido para a quantificação precisa da termodinâmica(II)-peptídeo. Este artigo foca no uso da espectroscopia de absorção eletrônica na presença e ausência de ligantes cromofóricos para fornecer a alça espectroscópica necessária em(II) e o uso de calorimetria isotérmica isotermal livre de rótulos. Em ambas as técnicas experimentais, um processo é descrito como responsável por todo o equilíbrio concorrente. Embora o foco deste artigo esteja em(II), o conjunto descrito de experimentos pode ser aplicado além das interações(II)-peptídeos, e fornecer uma estrutura para quantificação precisa de outros sistemas de metal-peptídeos em condições fisiologicamente relevantes.

O objetivo foi quantificar e corroborar a termodinâmica de(II) vinculando-se ao C-peptídeo utilizando as técnicas complementares de espectroscopia de absorção eletrônica e ITC. Devido à natureza robusta da espectroscopia de absorção eletrônica, foi realizada uma titulação direta de(II) em 300 μM C-peptídeo (Figura 1). A adição de 150 μM de(II) causou um aumento imediato na banda em 600 nm, atribuída à banda d-d de(II), e continuou a aumentar até 300 μM(II) foi adicionado...

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Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Este artigo foca no uso de espectroscopia de absorção eletrônica e calorimetria de titulação isotérmica para sondar e quantificar a termodinâmica de(II) vinculando-se a peptídeos e proteínas.

Quantificando as interações de ligação entre os resíduos de(II) e Peptídeos na Presença e Ausência de Cromóforos

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Este método permitirá que o pesquisador teste sistemas difíceis de estudar, como peptídeos e íons metálicos de transição de primeira linha, ambos geralmente desafiadores usando aplicações mais padrão. A principal vantagem aqui é usar técnicas ortogonais porque elas se complementam bem, e isso pode dar mais insights sobre o sistema e nos ajudar a não perder nenhum fenômeno. O método detalhado neste vídeo é muito adequado para estudar outros sistemas.Embora mostremos com(II) e um peptídeo, ele pode ser usado para muitas interações diferentes de peptídeos metálicos e proteínas metálicas. Acho que a parte mais difícil será encontrar uma boa escolha tampão para o seu íon de metal e peptídeo. Eu consultaria a literatura para ver quais tampões foram usados por outros antes.demonstrando o procedimento será Sohee Choi, uma estudante de pós-graduação no meu laboratório de pesquisa. Para começar, ligue o espectrômetro de absorção eletrônica e deixe aquecer por aproximadamente 15 a 20 minutos antes do uso. Em seguida, inicie o software espectrômetro e configure os parâmetros, como alcance de digitalização de 200 a 900 nanômetros, a faixa de varredura de 200 nanômetros por segundo e a linha de base de feixe duplo corrigida.Em seguida, colete uma linha de base sem cuvetas ou amostras nos caminhos do feixe. Usando duas cuvetas combinadas no espectrômetro de feixe duplo, carregue uma cuvette com 115 microliters de água ultrapura e a outra cuvette com 115 microliters da amostra de peptídeo, garantindo que não haja bolhas de ar nas cuvetas, pois estas interferirão com o sinal. Depois, coloque a cuvette com água ultrapura no feixe de referência e a cuvette com peptídeo no feixe de amostra.Em seguida, colete o espectro de absorção do peptídeo sem metal. Adicione uma quantidade substoichiométrica da solução(II) no cuvette com a amostra de peptídeo e registe o volume para análise posteriormente. Tubo suavemente para cima e para baixo para misturar a solução, evitando a geração de bolhas de ar.Depois de equilibrar por cinco minutos, coloque o cuvette de volta no suporte da célula da amostra e registe o espectro de absorção. Em seguida, repita a adição de alíquotas de(II) na solução de peptídeo para vários equivalentes e registe o volume total de(II) adicionado ao cuvette. Depois de inicializar o software como descrito anteriormente em duas cuvetas combinadas carregam uma cuvette com 115 microliters de água ultra pura e outras cuvette com 115 microliters da solução complexa cobre-fen.Coloque a cuvette com água no feixe de referência e a cuvette com solução complexa de cobre-phen no feixe de amostra. Em seguida, colete o espectro de absorção do complexo de ligantes metálicos. Depois, adicione uma quantidade estequiométrica de peptídeo à solução complexa cobre-fen e tubo suavemente que para cima e para baixo para misturar completamente enquanto cuidado para não introduzir quaisquer bolhas de ar.Em seguida, incubar a solução por cinco minutos para alcançar o equilíbrio. Coloque o cuvette de volta no suporte da célula da amostra e registe o espectro de absorção. Mais tarde, repita a adição de alíquotas de peptídeos na solução complexa de cobre-fen para vários equivalentes, e registe o volume de peptídeo adicionado para que a concentração diluída possa ser determinada.Primeiro ligue o ITC e inicie o software ITC para executar o instrumento. Após a primeira inicialização, recoloque o burette e siga as instruções na tela. Em seguida, remova a burette e a tampa da célula de referência.Em seguida, remova qualquer água da célula de referência e enxágue três vezes com 450 microliters de água ultra pura desgaseada. Desenhe lentamente água ultra pura para a marca de 450 microliters de uma seringa de carga tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na seringa. Em seguida, insira a seringa de carregamento na célula de referência até que esteja a aproximadamente um milímetro da parte inferior e injete lentamente parte da solução até que 150 microliters permaneçam na seringa de carga.Depois, mova o êmbolo da seringa de carga rapidamente para cima e para baixo por aproximadamente 25 microliters várias vezes para desalojar quaisquer bolhas na superfície celular. Em seguida, injete lentamente até que o êmbolo atinja a marca de 100 microliters na seringa de carregamento, distribuindo assim um total de 350 microliters de água ultra pura na célula de referência e substitua a tampa da célula de referência. Depois de remover qualquer solução residual da célula amostra, carregue 450 microliters de 10 mililitros EDTA usando uma seringa de carregamento e mergulhe por 10 minutos para garantir que os íons metálicos sejam removidos porque o EDTA ligará metais de traço.Depois de remover a solução EDTA enxágue completamente a seringa de carregamento com quantidades abundantes de água ultra pura. Limpe o ITC de acordo com as instruções do fabricante enxaguando a célula amostral com água ultra pura. Remova qualquer água residual da célula amostral e, em seguida, condicionar a célula amostrada enxaguando com 450 microliters de buffer pelo menos três vezes.Em seguida, remova o tampão residual que está condicionando a célula amostral e carregue a solução de peptídeo na célula amostral usando a seringa de carregamento. Em seguida, enxágue a seringa de titulação com 200 microliters da solução tamponada, removendo primeiro o êmbolo. Usando uma micro pipeta, pipeta a solução tampão através do orifício na parte superior da seringa de titulação de vidro através da seringa e para fora da agulha abaixo.Mais tarde, insira totalmente o êmbolo na seringa de titulação. Em seguida, mergulhe a ponta da agulha de seringa de titulação na solução metálica e puxe lentamente o êmbolo para cima fazendo com que a solução metálica encha a seringa e resultando em um volume vazio na parte superior da parte de vidro da seringa de titulação. Para remover o volume vazio gire a seringa de titulação paralela ao chão.Em seguida, remova o êmbolo e incline ligeiramente a parte de vidro em direção ao chão. Agite suavemente a seringa de titulação para que a solução se mova para a parte de vidro da seringa de titulação e preencha a maior parte do volume vazio. Mas certifique-se de que dois ou três microliters de volume vazio permaneçam.Mantendo a seringa paralela ao chão reinserir o êmbolo. Em seguida, segure a seringa de titulação e mergulhe a ponta da agulha de volta na solução metálica. Em seguida, empurre o êmbolo para baixo até que o ar deixe de sair da agulha e carregue a seringa de titulação puxando lentamente o êmbolo para pouco acima da marca de 50 microliters, mantendo a ponta da agulha na solução.Insira cuidadosamente a parte de vidro da seringa de titulação na burette e enrosque até que o dedo esteja apertado. Depois, utilizando um limpador delicado de serviço leve, absorva a solução que sai da seringa de titulação devido à compressão do êmbolo sem tocar na ponta da agulha. Em seguida, insira a burette com uma seringa de titulação na célula amostral e fixe-a com segurança.Para configurar os parâmetros do software ITC, selecione o Controle de Instrumentos. Defina a taxa de agitação e a temperatura. Em seguida, em Detalhes do Experimento, entre na seringa e nas concentrações celulares em unidades milimães.Em seguida, na seção Método de Experimento selecione Titulação Incremental. Clique em Configuração e especifique 20 injeções de 2,5 microliters e se for necessário mais resolução para observar o evento de ligação aumentar o número de injeções e diminuir o volume por injeção. Depois, insira o espaçamento de tempo entre cada injeção para que seja longo o suficiente para que o sinal se equilibre e retorne à linha de base, normalmente 300 segundos.Em seguida, clique no botão Executar para iniciar o experimento e especifique onde os dados são salvos. A titulação de(II) foi realizada em C-Peptídeo demonstrando que a adição de 150 micromolar de(II) causou um aumento imediato na banda em 600 nanômetros atribuídos à banda d-d de(II) e continuou a aumentar até que 300 milmolar(II)foi adicionado. Além disso, acima de 300 micromolar(II) não aumentou a absorção da proibição d-d indicando saturação e que(II)se liga ao C-Peptídeo em um complexo 1:1 com um valor de log K de mais de seis.C-Peptídeo foi titulado em aproximadamente 10 complexos de cobre-fenimene micromolar e a absorção da faixa de transferência de carga em 265 nanômetros diminuiu indicando que o C-Peptídeo foi capaz de quilatar(II) do ligante de fenanthrolina com um valor de log K de 7,4 a 7,8. O termograma ITC mostra a titulação de 1,4 milimiliar(II) em 154 micromolar C-Peptídeo em 15 milimiliar de mPS tampão. Verificou-se que a afinidade de ligação tinha um valor de log K de oito com alteração na entalpia como 8 kilojoules por toupeira.Gibbs energia livre como menos 46 kilojoules por toupeira, e mudança na entropia como 120 joules por toupeira por kelvin. Uma titulação controlada de 1,4 milimalha(II) em 15 milimilhas de buffer MOPS na ausência de C-Peptídeo não mostra nenhuma vinculação no termograma. Eu diria que ter certeza de que está tudo limpo.Se houver íons metálicos ou peptídeos que sobraram de experimentos anteriores, pode afetar drasticamente a estequiometria e fornecer competição desconhecida nos experimentos de ligação. O dicromaísmo circular é outro método para estudar as interações de peptídeos metálicos ou proteínas metálicas porque olha para a quiralidade. A espectrometria em massa também pode interrogar esses complexos olhando para mudanças na massa.Este conjunto de técnicas tem sido usado por muitos laboratórios que estudam íons metálicos interagindo com peptídeos ou proteínas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automated acústico de distribuição para a diluição de série do Peptide agonistas em potência Determinação Ensaios

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Bioquímica

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Determinação de alta-afinidade de anticorpo-antigénio Cinética de ligação utilizando quatro plataformas Biosensor

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Personalizado do Peptide matrizes para a deteção de aloanticorpos HLA no transplante de órgãos

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Uma sonda de força direta para medir a integração mecânica entre o núcleo e o citoesqueleto

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Fracionamento celular de células U937, na ausência de centrifugação de alta velocidade

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...