Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

SC благодарит Летнюю исследовательскую стипендию Уайтхеда. MJS благодарит Фонды стартапов и Фонд развития факультета в Университете Сан-Франциско. MCH признает финансирование со стороны Национальных институтов здравоохранения (NIH MIRA 5R35GM133684-02) и Национального научного фонда (NSF CAREER 2048265).

1. Электронная абсорбционная спектроскопия: прямое титрование с буферной конкуренцией
<ol><li>Пробоподготовка<ol>
<li>Готовят буферный раствор 50 мМ 2-[бис(2-гидроксиэтил)амино]-2-(гидроксиметил)пропан-1,3-диол (бисТрис) при рН 7,4 с использованием сверхчистой воды (сопротивление >18 МОм). У...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

В этой статье представлен надежный метод количественной оценки сродства и термодинамики связывания Cu(II) с пептидами. Комплексы с Cu(II) идеально подходят для мониторинга полосы поглощения d-d на металлическом участке из-за его электронной конфигурации d9 . Хотя коэффициент вымирания ...

Биология эволюционировала, чтобы использовать разнообразную химию ионов металлов, необходимых для жизни, чтобы адаптироваться и выжить в окружающей среде. По оценкам, 25-50% белков используют ионы металлов для структуры и функции1. Особая роль и окислительно-восстановительное состояние иона металла напрямую связаны с составом и геометрией биологических лигандов, которые его координируют. Кроме того, окислительно-восстановительные активные ионы металлов, такие как Cu(II), должны жестко регулироваться, чтобы они не взаимодействовали с окислителями через Фентон-подобную химию с образованием активных форм кислорода (АФК)2,3,4. Понимание режимов связывания и сродства, которые управляют его биохимией, должно помочь прояснить биологическую роль иона металла.
Многие методы используются для изучения связывающих взаимодействий металлов и пептидов. Это в основном спектроскопические методы, но также включают компьютерное моделирование с использованием молекулярной динамики, как видно через взаимодействия Cu(II) с фрагментом бета-амилоида (Aβ)5. Широко используемым спектроскопическим методом, доступным для многих университетов, является ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Используя парамагнитную природу Cu(II), Gaggelli et al. смогли показать, где ион металла связывается на петиде через расслабление близлежащих ядер6. Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) также может быть использован для исследования местоположения и режима ионного связывания парамагнитного металла7. Другие спектроскопические методы, такие как круговой дихроизм (CD), могут описывать координацию относительно Cu(II) в таких системах, как трипептидные системы8, а масс-спектрометрия может показать стехиометрию и то, с какими остатками координируется ион металла через схемы фрагментации 9,10.
Некоторые из этих методов, такие как ЯМР, не имеют меток, но требуют больших концентраций пептидов, что создает проблемы для изучения. Другой распространенный метод, называемый флуоресцентной спектроскопией, был использован для связи положения тирозина или триптофана с закалкой из Cu(II)11,12. Аналогичным образом, этот метод может показать структурные изменения в результате связывания Cu(II)13. Однако проблемы с этими исследованиями связывания металлов с пептидами заключаются в том, что они исследуют хромофорные аминокислоты, такие как тирозин, которые есть не во всех системах, что ион металла связывается в классической модели и что метод может быть неблагоприятным в физиологических условиях. Действительно, появляется несколько пептидов, которые не содержат таких хромофорных аминокислот или связываются по классическим моделям, что исключает использование этих методов 14,15. В этой статье подробно описываются подходы к оценке связывающих свойств в этих сценариях в физиологически значимых условиях.
Биологические лиганды могут принимать различные состояния протонирования, которые могут влиять на связывание ионов металлов, таких как имидазольное кольцо на гистидине. Если pH не поддерживается последовательно, результаты могут быть запутанными или противоречивыми. По этой причине буферы являются важным компонентом в изучении взаимодействия металл-белок/пептид. Однако было показано, что многие буферы благоприятно взаимодействуют с ионами металлов16,17. В дополнение к конкуренции с интересующей биологической молекулой, буфер может иметь аналогичные координирующие атомы, которые может быть трудно отличить от координирующих атомов пептида или белка. В этом исследовании основное внимание уделяется электронной абсорбционной спектроскопии и изотермической титрующей калориметрии (ITC) в качестве двух взаимодополняющих методов изучения Cu(II)-пептидных взаимодействий с особыми соображениями, касающимися выбора буфера.
Электронная абсорбционная спектроскопия является быстрым, широко доступным методом изучения металлосвязывающих взаимодействий. Облучение светом в ультрафиолетовых (УФ) или видимых длинах волн может привести к поглощению металлоцентричных d-d полос, которые предоставляют ценную информацию о классификации лигандов, геометрии металлов и кажущемся сродстве связывания18,19. Для этих комплексов прямое титрование ионов металлов в белковые или пептидные растворы может количественно определять стехиометрию связывания и кажущееся сродство связывания. В некоторых случаях, таких как d5 или d10 электронных конфигураций, комплекс не поглощает свет (т. е. спектроскопически бесшумен). В этих спектроскопически бесшумных комплексах переходных металлов эти ограничения можно обойти, используя конкурирующий лиганд, который при координации с ионом металла дает обнаруживаемые полосы переноса заряда. В любом случае этот подход ограничен количественной оценкой только стехиометрии и кажущегося сродства связывания, и никакое понимание энтальпии связывания не дается без приближений.
Дополняя информацию, полученную с помощью электронной абсорбционной спектроскопии, ITC является привлекательным методом для прямой и строгой количественной оценки энтальпиисвязывания 20. ITC непосредственно измеряет тепло, выделяемое или потребляемое во время события связывания, и, поскольку титрование происходит при постоянном давлении, измеренное тепло является энтальпией всех равновесий (ΔHITC). Кроме того, количественно определяется стехиометрия события связывания (n) и кажущееся сродство связывания (KITC). Из этих параметров определяют свободную энергию (ΔGITC) и энтропию (ΔSITC), обеспечивая термодинамический снимок события связывания. Поскольку ITC не полагается на поглощение света, он является идеальным методом для спектроскопически бесшумных видов, например, d5 или d10 комплексов ионов металлов. Однако, поскольку калориметрия измеряет теплоту, любые непревзойденные буферные системы и неучтенные равновесия могут отрицательно повлиять на анализ для точного определения термодинамики связывания ионов металлов, и необходимо проявлять большую осторожность для устранения этих факторов20. При выполнении с соответствующей строгостью ITC является надежным методом определения термодинамики металл-белково-пептидных комплексов.
Здесь хромофорически тихий медь-связывающий пептид, С-пептид, используется для демонстрации взаимодополняющего использования двух методов. С-пептид представляет собой продукт расщепления 31 остатка (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLGSL), образующийся при созревании инсулина; он не имеет хромофорных остатков, но было показано, что он связывает Cu(II) с физиологически значимым сродством14,15. Сайт связывания Cu(II) состоит из боковых цепей глутамата и аспартата, а также N-конца пептида14,15. Эти координирующие атомы очень похожи на атомы многих обычно используемых буферных систем. Здесь показано тандемное использование d-d и полос переноса заряда в электронной абсорбционной спектроскопии и ITC в количественной оценке термодинамики связывания Cu(II) с С-пептидом. Подход, основанный на изучении связывания Cu(II) с С-пептидом, может быть применен к другим ионам металлов и белково-пептидным системам.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

Медь (II) является важным металлом в биологических системах, придавая уникальные химические свойства биомолекулам, с которыми она взаимодействует. Сообщалось, что он напрямую связывается с различными пептидами и играет как необходимую, так и патологическую роль, начиная от опосредующей структуры до свойств переноса электронов и передачи каталитической функции. Количественная оценка сродства связывания и термодинамики этих Cu(II)-пептидных комплексов in vitro дает представление о термодинамической движущей силе связывания, потенциальных конкуренциях между различными ионами металлов для пептида или между различными пептидами для Cu(II) и распространенности Cu(II)-пептидного комплекса in vivo. Тем не менее, количественная оценка термодинамики связывания может быть сложной задачей из-за множества факторов, включая учет всех конкурирующих равновесий в эксперименте по титрованию, особенно в тех случаях, когда отсутствуют дискретные спектроскопические ручки, представляющие пептид, ион металла d-блока и их взаимодействия.
Здесь представлен надежный набор экспериментов для точной количественной оценки Cu(II)-пептидной термодинамики. Данная статья посвящена использованию электронной абсорбционной спектроскопии при наличии и отсутствии хромофорных лигандов для обеспечения необходимой спектроскопической обработки Cu(II) и использованию изотермической титрационной калориметрии без маркировки. В обоих экспериментальных методах описывается процесс, учитывающий все конкурирующие равновесия. Хотя основное внимание в этой статье уделяется Cu(II), описанный набор экспериментов может применяться за пределами Cu(II)-пептидных взаимодействий и обеспечивать основу для точной количественной оценки других металл-пептидных систем в физиологически значимых условиях.

Цель состояла в том, чтобы количественно оценить и подтвердить термодинамику связывания Cu(II) с С-пептидом с использованием дополнительных методов электронной абсорбционной спектроскопии и ITC. Из-за надежного характера электронной абсорбционной спектроскопии было выполнено прямое ти?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Эта статья посвящена использованию электронной абсорбционной спектроскопии и изотермической титрующей калориметрии для исследования и количественной оценки термодинамики связывания Cu(II) с пептидами и белками.

Количественная оценка связывающих взаимодействий между Cu(II) и пептидными остатками в присутствии и отсутствии хромофоров

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Этот метод позволит исследователю исследовать трудноизучаемые системы, такие как пептиды и ионы переходных металлов первого ряда, оба из которых, как правило, сложны при использовании более стандартных приложений. Основным преимуществом здесь является использование ортогональных методов, потому что они хорошо дополняют друг друга, и это может дать больше понимания системы и помочь нам не пропустить ни одного явления. Метод, подробно описанный в этом видео, очень хорошо подходит для изучения других систем.Хотя мы показываем его с Cu(II) и пептидом, его можно использовать для многих различных взаимодействий пептидов металлов и белков металлов. Я думаю, что самой сложной частью будет найти хороший выбор буфера для вашего иона металла и пептида. Я бы обратился к литературе, чтобы увидеть, какие буферы использовались другими раньше.Продемонстрировать процедуру будет Сохи Чой, аспирант моей исследовательской лаборатории. Для начала включите электронный абсорбционный спектрофотометр и дайте ему прогреться примерно за 15-20 минут до использования. Затем запустите программное обеспечение спектрофотометра и настройте параметры, такие как диапазон сканирования от 200 до 900 нанометров, диапазон сканирования 200 нанометров в секунду и скорректированная базовая линия двойного луча.Затем соберите базовую линию без кювет или образцов на путях луча. Используя две совпадающие кюветы в двухлучевом спектрофотометре, загрузите одну кювету со 115 микролитрами сверхчистой воды, а другую кювету со 115 микролитрами пептидного образца, гарантируя, что в кюветах нет пузырьков воздуха, поскольку они будут мешать сигналу. После этого поместите кювету со сверхчистой водой в опорный пучок и кювету с пептидом в пучок образца.Затем собирают спектр поглощения безметаллового пептида. Добавьте субстехиометрическое количество раствора Cu(II) в кювету с образцом пептида и запишите объем для анализа позже. Аккуратно проложите его вверх и вниз, чтобы перемешать раствор, избегая образования пузырьков воздуха.После уравновешивания в течение пяти минут поместите кювету обратно в держатель ячейки образца и запишите спектр поглощения. Затем повторяют добавление Cu(II)аликвот в пептидный раствор для различных эквивалентов и записывают общий объем Cu(II), добавленный в кювету. После инициализации программного обеспечения, как описано ранее, в двух согласованных кюветах загрузите одну кювету со 115 микролитрами сверхчистой воды, а другую кювету с 115 микролитрами медно-фенного комплексного раствора.Поместите кювету с водой в опорный пучок и кювету с раствором медно-фенного комплекса в пробоотборный пучок. Затем собирают спектр поглощения комплекса лигандов металлов. После этого добавьте стехиометрическое количество пептида в раствор медно-фенного комплекса и осторожно проложите его вверх и вниз, чтобы тщательно перемешать, стараясь не вводить пузырьки воздуха.Далее инкубируют раствор в течение пяти минут, чтобы достичь равновесия. Поместите кювету обратно в держатель ячейки образца и запишите спектр поглощения. Позже повторяют добавление пептидных аликвот в раствор медно-фенного комплекса для различных эквивалентов, и записывают объем добавленного пептида, чтобы можно было определить разбавленную концентрацию.Сначала включите ITC и запустите программное обеспечение ITC для запуска прибора. После первой инициализации верните бюретку и следуйте инструкциям на экране. Затем снимите бюретку и крышку с эталонной ячейки.Затем удалите любую воду из эталонной ячейки и трижды промойте 450 микролитрами дегазированной ультрачистой воды. Медленно подтягивайте сверхчистую воду до отметки 450 микролитров загрузочного шприца, стараясь не вводить пузырьки воздуха в шприц. Затем вставьте загрузочный шприц в опорную ячейку до тех пор, пока он не окажется примерно в одном миллиметре от дна, и медленно впрыскивайте часть раствора до тех пор, пока в загрузочном шприце не останется 150 микролитров.После этого быстро перемещайте плунжер загрузочного шприца вверх и вниз примерно на 25 микролитров несколько раз, чтобы выбить любые пузырьки на поверхности ячейки. Затем медленно впрыскивайте до тех пор, пока плунжер не достигнет отметки в 100 микролитров на загрузочном шприце, тем самым дозируя в общей сложности 350 микролитров сверхчистой воды в эталонную ячейку и заменяя крышку эталонной ячейки. После удаления любого остаточного раствора из ячейки образца загрузите 450 микролитров 10 миллимоляров ЭДТА с помощью нагрузочного шприца и замочите в течение 10 минут, чтобы обеспечить удаление следовых ионов металлов, поскольку ЭДТА будет связывать следовые металлы.После удаления раствора ЭДТА тщательно промойте загрузочный шприц обильным количеством сверхчистой воды. Очистите ITC в соответствии с указаниями производителя, промыв ячейку образца ультрачистой водой. Удалите любую остаточную воду из ячейки образца, а затем кондиционируйте ячейку образца, промыв 450 микролитров буфера по меньшей мере три раза.Затем удалите остаточный буфер, который обусловливает клетку образца, и загрузите пептидный раствор в ячейку образца с помощью загрузочного шприца. Затем промыть шприц титрования 200 микролитрами буферного раствора, сначала удалив плунжер. Используя микропипетку, пипетку буферного раствора через отверстие в верхней части стеклянного титрационного шприца через шприц и наружу иглу внизу.Позже полностью вставьте поршень в шприц титрования. Затем окуните наконечник иглы шприца титрования в металлический раствор и медленно потяните плунжер вверх, в результате чего металлический раствор заполнит шприц и в результате образуется пустой объем в верхней части стеклянной части титрующего шприца. Чтобы удалить пустоту объема, поверните шприц титрования параллельно полу.Затем снимите поршень и слегка наклоните стеклянную часть к полу. Аккуратно встряхните шприц титрования так, чтобы раствор переместился в стеклянную часть титрационного шприца и заполнил большую часть объема пустоты. Но убедитесь, что осталось два-три микролитра пустого объема.Держа шприц параллельно полу, снова вставьте плунжер. Затем держите шприц титрования в вертикальном положении и окуните кончик иглы обратно в металлический раствор. Затем толкните плунжер вниз до тех пор, пока воздух не перестанет выходить из иглы, и загрузите шприц титрования, медленно подтягивая плунжер чуть выше отметки в 50 микролитров, сохраняя кончик иглы в растворе.Осторожно вставьте стеклянную часть шприца титрования в бюретку и вкрутите до плотного зажима пальца. После этого с помощью легкого тонкого стеклоочистителя поглощайте раствор, который выходит из шприца титрования из-за сжатия плунжера, не касаясь кончика иглы. Затем вставьте бюретку со шприцем титрования в ячейку образца и надежно закрепите ее.Чтобы настроить параметры программного обеспечения ITC, выберите Управление приборами. Установите скорость перемешивания и температуру. Затем в разделе «Подробности эксперимента» введите шприц и концентрации клеток в миллимолярных единицах.Затем в разделе Метод эксперимента выберите Добавочное титрование. Нажмите «Настройка» и укажите 20 инъекций по 2,5 микролитра, а если требуется большее разрешение для наблюдения за событием связывания, увеличьте количество инъекций и уменьшите объем на инъекцию. После этого введите временной интервал между каждой инъекцией, чтобы он был достаточно длинным, чтобы сигнал уравновешивался и возвращался к базовому уровню, обычно 300 секунд.Затем нажмите кнопку Выполнить, чтобы начать эксперимент и указать, где хранятся данные. Титрование Cu(II) было выполнено в C-пептид, демонстрируя, что добавление 150 микромоляров Cu(II) вызвало немедленное увеличение в диапазоне на 600 нанометров, приписываемых d-d диапазону Cu(II), и продолжало увеличиваться до тех пор, пока не было добавлено 300 миллимоляров Cu(II). Дальнейшее добавление выше 300 микромоляров Cu(II) не увеличивало поглощение d-d бана, указывающего на насыщение и на то, что Cu(II)связывается с C-пептидом в комплексе 1:1 со значением log K более шести.С-пептид титровали примерно в 10 микромолярный медно-фенный комплекс, и поглощение из полосы переноса заряда на 265 нанометров уменьшалось, что указывает на то, что С-пептид был способен хелатировать Cu(II) из лиганда фенантролина со значением log K от 7,4 до 7,8. Термограмма ITC показывает титрование 1,4 миллимоляра Cu(II) в 154 микромолярный C-пептид в 15-миллимолярном буфере MOPS. Было обнаружено, что сродство связывания имеет значение log K, равное восьми с изменением энтальпии как 8 килоджоулей на моль.Свободная энергия Гиббса составляет минус 46 килоджоулей на моль, а энтропия изменяется как 120 джоулей на моль на кельвин. Контролируемое титрование 1,4 миллимоляра Cu(II) в 15-миллимолярный буфер MOPS в отсутствие C-пептида не показывает связывания в термограмме. Я бы сказал, чтобы убедиться, что все чисто.Если есть ионы металлов или пептиды, оставшиеся от предыдущих экспериментов, это может резко повлиять на стехиометрию и обеспечить неизвестную конкуренцию в экспериментах по связыванию. Круговой дихроизм является еще одним методом изучения взаимодействия пептидов металлов или белков металлов, поскольку он рассматривает хиральность. Масс-спектрометрия также может исследовать эти комплексы, глядя на изменения массы.Этот набор методов использовался многими лабораториями, которые изучают ионы металлов, взаимодействующие с пептидами или белками.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Автоматизированная Акустическая дозирования для серийного разведения пептидные агонисты в Potency Определение Assays

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Определение высокого сродства антитело-антиген-связывающий Kinetics с использованием четырех биосенсор платформы

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Персонализированные пептид массивы для обнаружения Alloantibodies HLA в трансплантации

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Прямое действие зонд для измерения механических интеграции между ядром и Цитоскелет

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Фракционирование клеток U937 клеток в отсутствие высокоскоростной центрифуги

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...