Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

SC tackar Whitehead Summer Research Fellowship. MJS tackar Startup Funds och Faculty Development Fund vid University of San Francisco. MCH erkänner finansiering från National Institutes of Health (NIH MIRA 5R35GM133684-02) och National Science Foundation (NSF CAREER 2048265).

1. Elektronisk absorptionsspektroskopi: direkt titrering med buffertkonkurrens
<ol><li>Beredning av prov<ol>
<li>Bered en buffrad lösning av 50 mM 2-[bis(2-hydroxietyl)amino]-2-(hydroximetyl)propan-1,3-diol (bisTris) vid pH 7,4 med användning av ultrarent vatten (>18 MΩ resistans). Avlägsna spårmetalljoner genom att inkubera med ett harts med hög affinitet i minst 2 timmar med efterföljande filtrering.</li>
		<li>Lös upp eller späd en känd mängd av peptiden i den metallfria bufferten. OBS...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

Denna artikel ger en robust metod för att kvantifiera affiniteten och termodynamiken hos Cu(II)-bindning till peptider. Komplex med Cu(II) är idealiska för att övervaka d-d-absorptionsbandet på metallplatsen på grund av dess d 9-elektronkonfiguration. Även om extinktionskoefficienten är liten, vilket kräver större koncentrationer av komplexet för att ge en tillförlitlig signal, kan titreringar av Cu (II) till peptid snabbt ge insikt i bindningsstökiometrin och ungefärlig bindningsaffinitet. Det k...

Biologin har utvecklats för att utnyttja den olika kemin hos metalljoner som behövs för att livet ska kunna anpassa sig och överleva i sin omgivande miljö. Uppskattningsvis 25%-50% av proteinerna använder metalljoner för struktur och funktion1. Metalljonens speciella roll och redoxtillstånd är direkt relaterat till sammansättningen och geometrin hos de biologiska liganderna som samordnar den. Dessutom måste redoxaktiva metalljoner såsom Cu (II) regleras tätt så att de inte interagerar med oxidationsmedel via Fenton-liknande kemi för att bilda reaktiva syrearter (ROS)2,3,4. Att förstå bindningslägena och affiniteten som driver dess biokemi bör hjälpa till att belysa metalljonens biologiska roll.
Många tekniker används för att studera bindningsinteraktionerna mellan metaller och peptider. Dessa är mestadels spektroskopiska tekniker men inkluderar även datorsimuleringar med molekylär dynamik, sett genom Cu(II)-interaktioner med ett fragment av amyloid beta (Aβ)5. En allmänt använd spektroskopisk teknik som är tillgänglig för många universitet är kärnmagnetisk resonans (NMR). Genom att använda den paramagnetiska naturen hos Cu(II) kunde Gaggelli m.fl. visa var metalljonen binder på en petid genom avslappning av närliggande kärnor6. Elektronparamagnetisk resonans (EPR) kan också användas för att undersöka platsen och läget för den paramagnetiska metalljonbindningen7. Andra spektroskopiska tekniker som cirkulär dikroism (CD) kan beskriva koordinationen kring Cu(II) i system som tripeptidsystem8, och masspektrometri kan visa stökiometri och till vilka rester metalljonen koordineras genom fragmenteringsmönster 9,10.
Några av dessa tekniker, såsom NMR, är etikettfria men kräver stora koncentrationer av peptid, vilket innebär utmaningar för studier. En annan vanlig teknik som kallas fluorescensspektroskopi har använts för att relatera positionen för en tyrosin eller tryptofan med släckning från en Cu (II) 11,12. På samma sätt kan denna teknik visa strukturella förändringar som ett resultat av Cu (II) bindning13. Utmaningar med dessa metall-peptidbindningsstudier är dock att de undersöker kromoforiska aminosyror som tyrosin som inte alla system har, att metalljonen binder under en klassisk modell och att tekniken kanske inte är gynnsam under fysiologiska förhållanden. Faktum är att flera peptider dyker upp som inte innehåller sådana kromoforiska aminosyror eller binder under klassiska modeller, vilket utesluter användningen av dessa tekniker14,15. Den här artikeln beskriver metoder för att utvärdera bindningsegenskaper i dessa scenarier under fysiologiskt relevanta förhållanden.
Biologiska ligander kan anta olika protoneringstillstånd som kan påverka metalljonbindningen, såsom imidazolringen på histidin. Om pH inte upprätthålls konsekvent kan resultaten vara invecklade eller motstridiga. Av denna anledning är buffertar en viktig komponent i studien av metall-protein / peptidinteraktioner. Många buffertar har dock visat sig positivt interagera med metalljoner16,17. Förutom att konkurrera med den biologiska molekylen av intresse kan bufferten ha liknande samordnande atomer som kan vara svåra att skilja från peptidens eller proteinets koordinerande atomer. I denna studie ligger fokus på elektronisk absorptionsspektroskopi och isotermisk titreringskalorimetri (ITC) som två komplementära tekniker för att studera Cu(II)-peptidinteraktioner, med särskilda överväganden avseende buffertval.
Elektronisk absorptionsspektroskopi är en snabb, allmänt tillgänglig teknik för att studera metallbindande interaktioner. Bestrålning med ljus i ultraviolett (UV) eller synliga våglängder kan leda till absorption av metallcentrerade d-d-band, vilket ger värdefull information om ligandklassificering, metallgeometrier och uppenbara bindningsaffiniteter18,19. För dessa komplex kan direkta titreringar av metalljoner till protein- eller peptidlösningar kvantifiera bindande stoichiometrier och uppenbara bindningsaffiniteter. I vissa fall, såsom d5 eller d10 elektronkonfigurationer, absorberar komplexet inte ljus (dvs är spektroskopiskt tyst). I dessa spektroskopiskt tysta övergångsmetallkomplex kan dessa begränsningar kringgås genom att använda en konkurrerande ligand som, vid samordning till metalljonen, ger detekterbara laddningsöverföringsband. I båda fallen är detta tillvägagångssätt begränsat till att kvantifiera endast stökiometri och uppenbar bindningsaffinitet, och ingen insikt i bindande entalpi ges utan approximationer.
ITC kompletterar information som erhållits från elektronisk absorptionsspektroskopi och är en attraktiv teknik för direkt och rigorös kvantifiering av bindningsentalpi20. ITC mäter direkt den värme som frigörs eller förbrukas under en bindningshändelse och eftersom titreringen sker vid konstant tryck är den uppmätta värmen entalpi för alla jämvikter (ΔHITC). Dessutom kvantifieras stökiometrin för bindningshändelsen (n) och den skenbara bindningsaffiniteten (KITC). Från dessa parametrar bestäms den fria energin (ΔGITC) och entropin (ΔSITC), vilket ger en termodynamisk ögonblicksbild av bindningshändelsen. Eftersom det inte är beroende av ljusabsorption är ITC en idealisk teknik för spektroskopiskt tysta arter, till exempel d5 eller d10 metalljonkomplex. Eftersom kalorimetri mäter värme kan emellertid alla oöverträffade buffertsystem och oräknade jämvikter påverka analysen negativt för att exakt bestämma metalljonbindande termodynamik, och stor försiktighet måste vidtas för att ta itu med dessa faktorer20. Om ITC utförs med lämplig noggrannhet är det en robust teknik för att bestämma termodynamiken hos metallprotein / peptidkomplex.
Här används en kromoforiskt tyst kopparbindande peptid, C-peptid, för att demonstrera den komplementära användningen av de två teknikerna. C-peptid är en 31 restklyvningsprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) bildad under insulinmognad; Den saknar kromoforiska rester men har visat sig binda Cu(II) med fysiologiskt relevant affinitet14,15. Cu(II)-bindningsstället består av sidokedjorna av ett glutamat och ett aspartat samt N-änden av peptiden14,15. Dessa koordinerande atomer liknar dem hos många vanliga buffrade system. Här visas tandemanvändningen av d-d- och laddningsöverföringsbanden i elektronisk absorptionsspektroskopi och ITC för att kvantifiera Cu (II) bindande termodynamik till C-peptid. Tillvägagångssättet från att studera Cu(II)-bindning till C-peptid kan tillämpas på andra metalljoner och protein/peptidsystem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

Koppar (II) är en väsentlig metall i biologiska system, vilket ger unika kemiska egenskaper till de biomolekyler som den interagerar med. Det har rapporterats att direkt binda till en mängd olika peptider och spela både nödvändiga och patologiska roller som sträcker sig från förmedlande struktur till elektronöverföringsegenskaper till att ge katalytisk funktion. Kvantifiering av bindningsaffiniteten och termodynamiken hos dessa Cu(II)-peptidkomplex in vitro ger insikt i den termodynamiska drivkraften för bindning, potentiella tävlingar mellan olika metalljoner för peptiden eller mellan olika peptider för Cu(II), och förekomsten av Cu(II)-peptidkomplexet in vivo. Kvantifiering av bindningstermodynamiken kan dock vara utmanande på grund av en myriad av faktorer, inklusive redovisning av alla konkurrerande jämvikter inom ett titreringsexperiment, särskilt i fall där det saknas diskreta spektroskopiska handtag som representerar peptiden, d-blockmetalljonen och deras interaktioner.
Här tillhandahålls en robust uppsättning experiment för exakt kvantifiering av Cu (II) -peptidtermodynamik. Denna artikel fokuserar på användningen av elektronisk absorptionsspektroskopi i närvaro och frånvaro av kromoforiska ligander för att ge det nödvändiga spektroskopiska handtaget på Cu (II) och användningen av etikettfri isotermisk titreringskalorimetri. I båda experimentella teknikerna beskrivs en process för att redogöra för alla konkurrerande jämvikter. Medan fokus för denna artikel ligger på Cu (II), kan den beskrivna uppsättningen experiment tillämpas bortom Cu (II) -peptidinteraktioner och ge ett ramverk för exakt kvantifiering av andra metallpeptidsystem under fysiologiskt relevanta förhållanden.

Målet var att kvantifiera och bekräfta termodynamiken för Cu(II)-bindning till C-peptid med hjälp av de komplementära teknikerna för elektronisk absorptionsspektroskopi och ITC. På grund av den elektroniska absorptionsspektroskopins robusta karaktär utfördes en direkt titrering av Cu(II) till 300 μM C-peptid (figur 1). Tillsats av 150 μM Cu (II) orsakade en omedelbar ökning av bandet vid 600 nm, tillskrivet d-d-bandet av Cu (II), och fortsatte att öka tills 300 μM Cu (II) tills...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Denna artikel fokuserar på användningen av elektronisk absorptionsspektroskopi och isotermisk titreringskalorimetri för att undersöka och kvantifiera termodynamiken för Cu (II) bindning till peptider och proteiner.

Kvantifiering av bindningsinteraktionerna mellan Cu (II) och peptidrester i närvaro och frånvaro av kromoforer

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Denna metod gör det möjligt för forskaren att undersöka svårstuderade system, som peptider och första radens övergångsmetalljoner, som båda i allmänhet är utmanande med mer standardapplikationer. Den största fördelen här är att använda ortogonala tekniker eftersom de kompletterar varandra bra, och det kan ge mer inblick i systemet och hjälpa oss att inte missa något fenomen. Metoden som beskrivs i den här videon är mycket väl lämpad för att studera andra system.Även om vi visar det med Cu (II) och en peptid, kan den användas för många olika metallpeptid- och metallproteininteraktioner. Jag tror att det svåraste blir att hitta ett bra buffertval för din metalljon och peptid. Jag skulle konsultera litteraturen för att se vilka buffertar som har använts av andra tidigare.demonstrerar proceduren kommer att vara Sohee Choi, doktorand i mitt forskningslabb. För att börja, slå på den elektroniska absorptionsspektrofotometern och låt den värmas upp i cirka 15 till 20 minuter före användning. Starta sedan spektrofotometerprogramvaran och konfigurera parametrarna, såsom skanningsintervall på 200 till 900 nanometer, skanningsområdet på 200 nanometer per sekund och dubbel strålbaslinje korrigerad.Samla sedan en baslinje utan kyvetter eller prover i strålvägarna. Använd två matchade kyvetter i dubbelstrålens spektrofotometer, ladda en kyvett med 115 mikroliter ultrarent vatten och den andra kyvetten med 115 mikroliter peptidprovet samtidigt som du säkerställer att det inte finns några luftbubblor i kyvetterna eftersom dessa kommer att störa signalen. Placera sedan kyvetten med ultrarent vatten i referensstrålen och kyvetten med peptid i provstrålen.Samla sedan absorptionsspektrumet för den metallfria peptiden. Tillsätt en substoichiometrisk mängd av Cu(II)-lösningen i kyvetten med peptidprovet och registrera volymen för analys senare. Rör försiktigt upp och ner för att blanda lösningen samtidigt som du undviker generering av luftbubblor.Efter jämvikt i fem minuter sätta tillbaka kyvetten i provcellhållaren och registrera absorptionsspektrumet. Upprepa sedan tillsatsen av Cu(II)alikvoter i peptidlösningen för olika ekvivalenter och registrera den totala volymen Cu(II)tillsatt till kyvetten. Efter att ha initierat programvaran som beskrivits tidigare i två matchade cuvetter ladda en kyvett med 115 mikroliter ultrarent vatten och annan kyvett med 115 mikroliter koppar-phen komplex lösning.Placera kyvetten med vatten i referensstrålen och kyvetten med koppar-fenkomplexlösning i provstrålen. Samla sedan absorptionsspektrumet för metallligandkomplexet. Tillsätt sedan en stökiometrisk mängd peptid till koppar-fen-komplexlösningen och rör försiktigt upp och ner för att blanda noggrant medan du är försiktig så att du inte introducerar några luftbubblor.Därefter inkubera lösningen i fem minuter för att nå jämvikt. Sätt tillbaka kyvetten i provcellhållaren och registrera absorptionsspektrumet. Senare upprepar tillsatsen av peptidalikvoter i koppar-fenkomplexlösningen för olika ekvivalenter och registrerar volymen peptid tillsatt så att den utspädda koncentrationen kan bestämmas.Slå först på ITC och starta ITC-programvaran för att köra instrumentet. Efter den första initialiseringen, hemför buretten och följ instruktionerna på skärmen. Ta sedan bort buretten och locket från referenscellen.Ta sedan bort allt vatten från referenscellen och skölj tre gånger med 450 mikroliter avgasat ultrarent vatten. Dra långsamt upp ultrarent vatten till 450 mikrolitersmärket för en laddningsspruta och var noga med att inte införa luftbubblor i sprutan. För sedan in laddningssprutan i referenscellen tills den är ungefär en millimeter från botten och injicera långsamt en del av lösningen tills 150 mikroliter finns kvar i lastsprutan.Flytta sedan laddningssprutkolven snabbt upp och ner med cirka 25 mikroliter flera gånger för att lossa eventuella bubblor på cellytan. Injicera sedan långsamt tills kolven når 100 mikrolitersmärket på lastsprutan och dosera därmed totalt 350 mikroliter ultrarent vatten i referenscellen och byt ut referenscellkåpan. Efter att ha tagit bort eventuell kvarvarande lösning från provcellen, ladda 450 mikroliter 10 millimolar EDTA med en laddningsspruta och blötlägg i 10 minuter för att säkerställa att spårmetalljoner avlägsnas eftersom EDTA kommer att binda spårmetaller.Efter att ha tagit bort EDTA-lösningen skölj noggrant lastsprutan med rikliga mängder ultrarent vatten. Rengör ITC i enlighet med tillverkarens anvisningar genom att skölja provcellen med ultrarent vatten. Ta bort eventuellt kvarvarande vatten från provcellen och konditionera sedan provcellen genom att skölja med 450 mikroliter buffert minst tre gånger.Ta sedan bort den återstående bufferten som konditionerar provcellen och ladda peptidlösningen i provcellen med hjälp av laddningssprutan. Skölj sedan titreringssprutan med 200 mikroliter av den buffrade lösningen genom att först ta bort kolven. Använd en mikropipett och pipettera buffertlösningen genom hålet högst upp på glastitreringssprutan genom sprutan och ut genom nålen nedanför.Senare sätter du in kolven helt i titreringssprutan. Doppa sedan spetsen på titreringssprutan i metalllösningen och dra långsamt upp kolven så att metalllösningen fyller sprutan och resulterar i en tomrumsvolym högst upp på glasdelen av titreringssprutan. För att ta bort tomrumsvolymen vrid titreringssprutan parallellt med golvet.Ta sedan bort kolven och luta glasdelen något mot golvet. Skaka försiktigt titreringssprutan så att lösningen rör sig till glasdelen av titreringssprutan och fyller det mesta av tomrumsvolymen. Men se till att två till tre mikroliter tomrumsvolym kvarstår.Medan du håller sprutan parallell med golvet sätt tillbaka kolven. Håll sedan titreringssprutan upprätt och doppa nålspetsen tillbaka i metalllösningen. Tryck sedan ner kolven tills luft upphör att komma ut ur nålen och ladda titreringssprutan genom att långsamt dra upp kolven till strax över 50 mikroliter medan du håller nålspetsen i lösningen.För försiktigt in glasdelen av titreringssprutan i buretten och skruva tills fingret är tätt. Efteråt, med hjälp av en lätt känslig torkare, absorbera lösningen som kommer ut ur titreringssprutan på grund av kompression av kolven utan att vidröra nålspetsen. Sätt sedan in buretten med en titreringsspruta i provcellen och fäst den ordentligt.Om du vill ställa in parametrarna för ITC-programvaran väljer du Instrumentkontroll. Ställ in omrörningshastigheten och temperaturen. Ange sedan sprutan och cellkoncentrationerna i millimolära enheter under Experimentdetaljer.I avsnittet Experimentmetod väljer du sedan Inkrementell titrering. Klicka på Setup och ange 20 injektioner på 2,5 mikroliter och om mer upplösning krävs för att observera bindningshändelsen öka antalet injektioner och minska volymen per injektion. Därefter matar du in tidsavståndet mellan varje injektion så att det är tillräckligt långt för att signalen ska kunna jämställas och återgå till baslinjen, vanligtvis 300 sekunder.Klicka sedan på knappen Kör för att starta experimentet och ange var data ska sparas. Titrering av Cu(II)utfördes till C-peptid som visade att tillsatsen av 150 mikromolar Cu(II)orsakade en omedelbar ökning vid bandet vid 600 nanometer tillskrivet d-d-bandet av Cu(II)och fortsatte att öka tills 300 millimolar Cu(II)tillsattes. Ytterligare tillsats över 300 mikromolar Cu(II)ökade inte absorptionen av d-d-förbudet som indikerar mättnad och att Cu(II)binder till C-peptid i ett 1:1-komplex med ett log K-värde på mer än sex.C-peptid titrerades i cirka 10 mikromolära koppar-fenkomplex och absorptionen från laddningsöverföringsbandet vid 265 nanometer minskade vilket indikerar att C-peptiden kunde kelera Cu (II) från fenantrolinliganden med ett log K-värde på 7,4 till 7,8. ITC-termogrammet visar titreringen av 1,4 millimolar Cu(II)till 154 mikromolär C-peptid i 15 millimolar MOPS-buffert. Bindningsaffiniteten visade sig ha ett log K-värde på åtta med förändring i entalpi som 8 kilojoule per mol.Gibbs fri energi som minus 46 kilojoule per mol, och förändring i entropi som 120 joule per mol per kelvin. En kontrollerad titrering av 1,4 millimolar Cu(II)till 15 millimolar MOPS-buffert i frånvaro av C-peptid visar ingen bindning i termogrammet. Jag skulle säga att se till att allt är rent.Om det finns metalljoner eller peptider kvar från tidigare experiment kan det drastiskt påverka stökiometrin och ge okänd konkurrens i bindningsexperimenten. Cirkulär dikroism är en annan metod för att studera metallpeptid- eller metallproteininteraktioner eftersom den tittar på kiralitet. Masspektrometri kan också förhöra dessa komplex genom att titta på förändringar i massa.Denna uppsättning tekniker har använts av många laboratorier som studerar metalljoner som interagerar med peptider eller proteiner.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Automatiserad Acoustic Utlämning för serieutspädning av peptidagonister i Styrka Fastställande Analyser

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Använda Scaffold Liposomer att återskapa Lipid-proximala protein-proteininteraktioner<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Fastställande av hög affinitet antikropp-antigenbindning Kinetics med fyra Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Personlig peptid matriser för detektion av HLA alloantikroppar vid organtransplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detektion av LRRK2 aktivitet med SDS-PAGE med en fosfat-bindande tagg

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisande av tvättmedel-känsliga samspelet mellan membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

En direkt tvång sond för mätning av mekaniska Integration mellan kärnan och cytoskelettet

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Cell fraktionering av U937 celler i avsaknad av höghastighetståg centrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...