Name: quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores
Uploaded: 2022-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

SC, Whitehead Yaz Araştırma Bursu'na teşekkür eder. MJS, San Francisco Üniversitesi'ndeki Başlangıç Fonlarına ve Fakülte Geliştirme Fonu'na teşekkür eder. MCH, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH MIRA 5R35GM133684-02) ve Ulusal Bilim Vakfı'ndan (NSF KARİYER 2048265) gelen fonları kabul etmektedir.

1. Elektronik absorpsiyon spektroskopisi: tampon rekabeti ile doğrudan titrasyon
<ol><li>Numune hazırlama<ol>
<li>Ultra saf su (>18 MΩ direnç) kullanarak pH 7.4'te 50 mM 2-[bis (2-hidroksietil) amino]-2-(hidroksimetil) propan-1,3-diol (bisTris) tamponlu bir çözelti hazırlayın. Eser metal iyonlarını, yüksek afiniteli bir reçine ile müteakip filtrasyon ile en az 2 saat boyunca inkübe ederek çıkarın.</li>
		<li>Peptitin bilinen bir miktarını metalsiz tampona çözün veya seyreltin. ...

<ol>
	<li>Waldron, K. J., Robinson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+bacterial+cells+ensure+that+metalloproteins+get+the+correct+metal.">How do bacterial cells ensure that metalloproteins get the correct metal.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (1), 25-35 (2009).</li><li>Puig, S., Thiele, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+copper+uptake+and+distribution.">Molecular mechanisms of copper uptake and distribution.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 6 (2), 171-180 (2002).</li><li>Huffman, D. L., O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function,+structure,+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins.">Function, structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 70 (1), 677-701 (2001).</li><li>Kaplan, J. H., Lutsenko, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+transport+in+mammalian+cells:+Special+care+for+a+metal+with+special+needs.">Copper transport in mammalian cells: Special care for a metal with special needs.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (38), 25461-25465 (2009).</li><li>Makowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+binding+of+Cu(II)+ions+to+a+fragment+of+the+A&#946;+(1-42)+polypeptide+using+fluorescence+spectroscopy,+isothermal+titration+calorimetry+and+molecular+dynamics+simulations.">Probing the binding of Cu(II) ions to a fragment of the A&#946; (1-42) polypeptide using fluorescence spectroscopy, isothermal titration calorimetry and molecular dynamics simulations.</a> Biophysical Chemistry. 216, 44-50 (2016).</li><li>Gaggelli, E., D'Amelio, N., Valensin, D., Valensin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1H+NMR+studies+of+copper+binding+by+histidine-containing+peptides.">1H NMR studies of copper binding by histidine-containing peptides.</a> Magnetic Resonance in Chemistry. 41 (10), 877-883 (2003).</li><li>Garc&#237;a, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectroscopic+and+electronic+structure+studies+of+copper(II)+binding+to+His111+in+the+human+prion+protein+fragment+106&#8722;115:+evaluating+the+role+of+protons+and+methionine+residues.">Spectroscopic and electronic structure studies of copper(II) binding to His111 in the human prion protein fragment 106&#8722;115: evaluating the role of protons and methionine residues.</a> Inorganic Chemistry. 50 (5), 1956-1972 (2011).</li><li>Jakab, N. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+histidine+containing+peptides+for+better+understanding+of+their+coordination+mode+toward+copper(II)+by+CD+spectroscopy.">Design of histidine containing peptides for better understanding of their coordination mode toward copper(II) by CD spectroscopy.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 101 (10), 1376-1385 (2007).</li><li>Keltner, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+and+activity+of+zinc-activated+proinsulin+C-peptide+and+C-peptide+mutants.">Mass spectrometric characterization and activity of zinc-activated proinsulin C-peptide and C-peptide mutants.</a> Analyst. 135 (2), 278-288 (2010).</li><li>Whittal, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Copper+binding+to+octarepeat+peptides+of+the+prion+protein+monitored+by+mass+spectrometry.">a Copper binding to octarepeat peptides of the prion protein monitored by mass spectrometry.</a> Protein science: a publication of the Protein Society. 9 (2), 332-343 (2000).</li><li>&#379;amoj&#263;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pentapeptide+with+tyrosine+moiety+as+fluorescent+chemosensor+for+selective+nanomolar-level+detection+of+copper(II)+ions.">A pentapeptide with tyrosine moiety as fluorescent chemosensor for selective nanomolar-level detection of copper(II) ions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1-16 (2020).</li><li>Beuning, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+interpeptidic+Cu+II+exchange+rate+constants+of+Cu+II+-amyloid-&#946;+complexes+to+small+peptide+motifs+by+tryptophan+fluorescence+quenching.">Measurement of interpeptidic Cu II exchange rate constants of Cu II -amyloid-&#946; complexes to small peptide motifs by tryptophan fluorescence quenching.</a> Inorganic Chemistry. 60 (11), 7650-7659 (2021).</li><li>Makowska, J., &#379;amoj&#263;, K., Wyrzykowski, D., Wiczk, W., Chmurzy&#324;ski, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper(II)+complexation+by+fragment+of+central+part+of+FBP28+protein+from+Mus+musculus.">Copper(II) complexation by fragment of central part of FBP28 protein from Mus musculus.</a> Biophysical Chemistry. 241, 55-60 (2018).</li><li>Stevenson, M. J., Farran, I. C., Uyeda, K. S., San Juan, J. A., Heffern, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+metal+effects+on+C-peptide+structure+and+internalization.">Analysis of metal effects on C-peptide structure and internalization.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2447-2453 (2019).</li><li>Stevenson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidation+of+a+copper+binding+site+in+proinsulin+C-peptide+and+its+implications+for+metal-modulated+activity.">Elucidation of a copper binding site in proinsulin C-peptide and its implications for metal-modulated activity.</a> Inorganic Chemistry. 59 (13), 9339-9349 (2020).</li><li>Magyar, J. S., Godwin, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectropotentiometric+analysis+of+metal+binding+to+structural+zinc-binding+sites:+Accounting+quantitatively+for+pH+and+metal+ion+buffering+effects.">Spectropotentiometric analysis of metal binding to structural zinc-binding sites: Accounting quantitatively for pH and metal ion buffering effects.</a> Analytical Biochemistry. 320, 39-54 (2003).</li><li>Ferreira, C. M. H., Pinto, I. S. S., Soares, E. V., Soares, H. M. V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(Un)suitability+of+the+use+of+pH+buffers+in+biological,+biochemical+and+environmental+studies+and+their+interaction+with+metal+ions+-+a+review.">(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions - a review.</a> RSC Advances. 5 (39), 30989-31003 (2015).</li><li>Sigel, H., Martin, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+properties+of+the+amide+bond.+stability+and+structure+of+metal+ion+complexes+of+peptides+and+related+ligands.">Coordinating properties of the amide bond. stability and structure of metal ion complexes of peptides and related ligands.</a> Chemical Reviews. 82 (4), 385-426 (1982).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteins+containing+cytochrome,+iron-sulfur,+or+copper+redox+centers.">Metalloproteins containing cytochrome, iron-sulfur, or copper redox centers.</a> Chemical Reviews. 114 (8), 4366 (2014).</li><li>Grossoehme, N. E., Spuches, A. M., Wilcox, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+isothermal+titration+calorimetry+in+bioinorganic+chemistry.">Application of isothermal titration calorimetry in bioinorganic chemistry.</a> Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1183-1191 (2010).</li><li>Miessler, G. L., Fischer, P. J., Tarr, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inorganic Chemistry. , (2014).</li><li>Walger, E., Marlin, N., Molton, F., Mortha, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+direct+red+81+dye/copper(II)-phenanthroline+system.">Study of the direct red 81 dye/copper(II)-phenanthroline system.</a> Molecules. 23 (2), 1-23 (2018).</li><li>Kocy&#322;a, A., Pomorski, A., Kr&#281;&#380;el, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molar+absorption+coefficients+and+stability+constants+of+Zincon+metal+complexes+for+determination+of+metal+ions+and+bioinorganic+applications.">Molar absorption coefficients and stability constants of Zincon metal complexes for determination of metal ions and bioinorganic applications.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 176, 53-65 (2017).</li><li>Zhao, H., Piszczek, G., Schuck, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEDPHAT+-+A+platform+for+global+ITC+analysis+and+global+multi-method+analysis+of+molecular+interactions.">SEDPHAT - A platform for global ITC analysis and global multi-method analysis of molecular interactions.</a> Methods. 76, 137-148 (2015).</li><li>NIST. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Critically Selected Stability Constants of Metal Complexes, Version 8.0. , (2004).</li><li>Riener, C. K., Kada, G., Gruber, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+measurement+of+protein+sulfhydryls+with+Ellman's+reagent+and+with+4,4&#8242;-dithiodipyridine.">Quick measurement of protein sulfhydryls with Ellman's reagent and with 4,4&#8242;-dithiodipyridine.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 373 (4-5), 266-276 (2002).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li></ol>

Bu makale, peptitlere bağlanan Cu(II)'nin afinitesini ve termodinamiğini ölçmek için sağlam bir yöntem sunmaktadır. Cu(II) içeren kompleksler, d9 elektron konfigürasyonu nedeniyle metal sahasındaki d-d absorpsiyon bandını izlemek için idealdir. Her ne kadar yok olma katsayısı küçük olsa da, bu nedenle güvenilir bir sinyal vermek için kompleksin daha büyük konsantrasyonlarını gerektirse de, Cu(II)'nin peptide titrasyonları, bağlanma stokiyometrisi ve yaklaşık bağlanma afinitesi hak...

Biyoloji, yaşamın çevresindeki çevreye uyum sağlaması ve hayatta kalması için gereken metal iyonlarının çeşitli kimyasını kullanmak için gelişmiştir. Proteinlerin tahmini% 25 -% 50'si yapı ve işlev için metal iyonları kullanır1. Metal iyonunun özel rolü ve redoks durumu, onu koordine eden biyolojik ligandların bileşimi ve geometrisi ile doğrudan ilgilidir. Ek olarak, Cu(II) gibi redoks-aktif metal iyonları, reaktif oksijen türleri (ROS) 2,3,4 oluşturmak için Fenton benzeri kimya yoluyla oksitleyici ajanlarla etkileşime girmemeleri için sıkı bir şekilde düzenlenmelidir. Biyokimyasını yönlendiren bağlanma modlarını ve afinitesini anlamak, metal iyonunun biyolojik rolünü aydınlatmaya yardımcı olmalıdır.
Metallerin ve peptitlerin bağlanma etkileşimlerini incelemek için birçok teknik kullanılır. Bunlar çoğunlukla spektroskopik tekniklerdir, ancak aynı zamanda bir amiloid beta (Aβ) 5 parçası ile Cu (II) etkileşimlerinde görüldüğü gibi moleküler dinamiği kullanan bilgisayar simülasyonlarını da içerir. Birçok üniversite tarafından erişilebilen yaygın olarak kullanılan spektroskopik bir teknik, nükleer manyetik rezonanstır (NMR). Cu (II)'nin paramanyetik doğasını kullanarak, Gaggelli ve ark. metal iyonunun yakındaki çekirdekleringevşemesi yoluyla bir petide nereye bağlandığını gösterebildiler 6. Elektron paramanyetik rezonansı (EPR), paramanyetik metal iyonu bağlama7'nin yerini ve modunu araştırmak için de kullanılabilir. Dairesel dikroizm (CD) gibi diğer spektroskopik teknikler, tripeptit sistemleri8 gibi sistemlerde Cu(II) ile ilgili koordinasyonu tanımlayabilir ve kütle spektrometrisi stokiyometriyi ve metal iyonunun parçalanma kalıpları 9,10 ile hangi kalıntıların koordine edildiğini gösterebilir.
NMR gibi bu tekniklerden bazıları etiketsizdir, ancak büyük konsantrasyonlarda peptid gerektirir ve bu da çalışma için zorluklar yaratır. Floresan spektroskopisi adı verilen bir başka yaygın teknik, bir tirozin veya triptofanın pozisyonunu bir Cu(II)11,12'den söndürme ile ilişkilendirmek için kullanılmıştır. Benzer şekilde, bu teknik Cu(II) bağlama13'ün bir sonucu olarak yapısal değişiklikler gösterebilir. Bununla birlikte, bu metal-peptit bağlama çalışmalarındaki zorluklar, tüm sistemlerin sahip olmadığı tirozin gibi kromoforik amino asitleri araştırmaları, metal iyonunun klasik bir model altında bağlanması ve tekniğin fizyolojik koşullar altında elverişli olmayabilmesidir. Gerçekten de, bu tür kromoforik amino asitleri içermeyen veya klasik modellere bağlanmayan, bu tekniklerin kullanılmasını engelleyen birkaç peptit ortaya çıkmaktadır14,15. Bu makalede, fizyolojik olarak ilgili koşullar altında bu senaryolardaki bağlanma özelliklerini değerlendirmek için yaklaşımlar ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Biyolojik ligandlar, histidin üzerindeki imidazol halkası gibi metal iyon bağlanmasını etkileyebilecek farklı protonasyon durumlarını benimseyebilir. pH tutarlı bir şekilde korunmazsa, sonuçlar kıvrımlı veya çelişkili olabilir. Bu nedenle, tamponlar metal-protein / peptit etkileşimlerinin incelenmesinde önemli bir bileşendir. Bununla birlikte, birçok tamponun metal iyonları16,17 ile olumlu etkileşime girdiği gösterilmiştir. İlgilenilen biyolojik molekülle rekabet etmenin yanı sıra, tampon, peptid veya proteinin koordine edici atomlarından ayırt edilmesi zor olabilecek benzer koordine edici atomlara sahip olabilir. Bu çalışmada, tampon seçimi ile ilgili özel hususlar göz önünde bulundurularak, Cu(II)-peptid etkileşimlerini incelemek için iki tamamlayıcı teknik olarak elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) üzerinde durulmuştur.
Elektronik absorpsiyon spektroskopisi, metal bağlama etkileşimlerini incelemek için hızlı, yaygın olarak erişilebilir bir tekniktir. Ultraviyole (UV) veya görünür dalga boylarında ışıkla ışınlama, ligand sınıflandırması, metal geometrileri ve görünür bağlanma afiniteleri hakkında değerli bilgiler sağlayan metal merkezli d-d bantlarının emilimine yol açabilir18,19. Bu kompleksler için, metal iyonlarının protein veya peptit çözeltilerine doğrudan titrasyonları, bağlanma stokiyometrilerini ve görünür bağlanma afinitelerini ölçebilir. D5 veya d10 elektron konfigürasyonları gibi bazı durumlarda, kompleks ışığı emmez (yani, spektroskopik olarak sessizdir). Bu spektroskopik olarak sessiz geçiş metal komplekslerinde, bu sınırlamalar, metal iyonuna koordine edildikten sonra, tespit edilebilir yük transfer bantları veren rakip bir ligand kullanılarak aşılabilir. Her iki durumda da, bu yaklaşım sadece stokiyometriyi ve görünür bağlanma afinitesini ölçmekle sınırlıdır ve bağlayıcı entalpiye ilişkin hiçbir içgörü yaklaşımlar olmadan sağlanmamıştır.
Elektronik absorpsiyon spektroskopisinden elde edilen bilgileri tamamlayan ITC, bağlayıcı entalpi20'nin doğrudan ve titiz bir şekilde ölçülmesi için çekici bir tekniktir. ITC, bir bağlama olayı sırasında salınan veya tüketilen ısıyı doğrudan ölçer ve titrasyon sabit basınçta gerçekleştiği için ölçülen ısı, tüm dengelerin entalpisidir (ΔHITC). Ek olarak, bağlanma olayının (n) stokiyometrisi ve görünür bağlanma afinitesi (KITC) ölçülür. Bu parametrelerden, serbest enerji (ΔG ITC) ve entropi (ΔSITC) belirlenir ve bağlanma olayının termodinamik bir anlık görüntüsü sağlanır. Işık emilimine dayanmadığı için ITC, spektroskopik olarak sessiz türler, örneğin d5 veya d10 metal iyon kompleksleri için ideal bir tekniktir. Bununla birlikte, kalorimetri ısıyı ölçtüğünden, herhangi bir eşsiz tampon sistemi ve hesaplanmamış denge, metal iyonu bağlayıcı termodinamiği doğru bir şekilde belirlemek için analizi olumsuz yönde etkileyebilir ve bu faktörleri ele almak için büyük özen gösterilmelidir20. Uygun titizlikle gerçekleştirilirse, ITC metal-protein / peptit komplekslerinin termodinamiğini belirlemek için sağlam bir tekniktir.
Burada, iki tekniğin tamamlayıcı kullanımını göstermek için kromoforik olarak sessiz bir bakır bağlayıcı peptid olan C-peptid kullanılır. C-peptid, insülin olgunlaşması sırasında oluşan 31 kalıntı bölünme ürünüdür (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ); kromoforik kalıntılardan yoksundur, ancak Cu(II)'yi fizyolojik olarak ilişkili afinite14,15 ile bağladığı gösterilmiştir. Cu (II) bağlanma bölgesi, bir glutamat ve bir aspartatın yan zincirlerinden ve ayrıca peptid 14,15'in N-terminusundan oluşur. Bu koordine edici atomlar, yaygın olarak kullanılan birçok tamponlu sisteminkine çok benzer. Burada, elektronik absorpsiyon spektroskopisinde d-d ve yük transfer bantlarının ve ITC'nin C-peptide bağlanan Cu (II) termodinamiğini ölçmede tandem kullanımı gösterilmiştir. Cu(II) bağlanmasının C-peptide bağlanmasını incelemekten yaklaşım, diğer metal iyonlarına ve protein / peptid sistemlerine uygulanabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,10-phenanthroline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>131377-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bis-Tris buffer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP301-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle-top 0.45 micron membrane</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>296-4545</td>
			<td>Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>12458</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic absorption spectrophotometer</td>
			<td>Varian</td>
			<td>Cary 5000</td>
			<td>Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high affinity resin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothermal titration calorimeter (ITC)</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>Nano ITC Low Volume</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC analysis software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>NanoAnalyze</td>
			<td>SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137&#8211;148) may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITC software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>ITCRun</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light-duty delicate wiper</td>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>loading syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>matched cuvettes</td>
			<td>Starna Cells, Inc</td>
			<td>16.100-Q-10/Z20</td>
			<td>Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS buffer</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer software</td>
			<td>Cary</td>
			<td>WinUV Scan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Excel</td>
			<td>Any suitable spreadsheet program will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>titration syringe</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>5346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td>Any water is okay as long as &#62;18 M&#937; resistance</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying the binding interactions between cu(ii) and peptide residues in the presence and absence of chromophores

Bakır (II), biyolojik sistemlerde temel bir metaldir ve etkileşime girdiği biyomoleküllere benzersiz kimyasal özellikler kazandırır. Çeşitli peptitlere doğrudan bağlandığı ve aracılık yapısından elektron transfer özelliklerine ve katalitik fonksiyon vermeye kadar hem gerekli hem de patolojik rolleri oynadığı bildirilmiştir. Bu Cu(II)-peptid komplekslerinin in vitro bağlanma afinitesini ve termodinamiğini ölçmek, bağlanmanın termodinamik itici gücü, peptid için farklı metal iyonları veya Cu(II) için farklı peptitler arasındaki potansiyel rekabetler ve in vivo olarak Cu(II)-peptid kompleksinin prevalansı hakkında fikir verir. Bununla birlikte, bağlayıcı termodinamiğin nicelleştirilmesi, özellikle peptidi, d-blok metal iyonunu ve bunların etkileşimlerini temsil eden ayrı spektroskopik tutamakların bulunmadığı durumlarda, bir titrasyon deneyi içindeki tüm rakip dengelerin hesaplanması da dahil olmak üzere sayısız faktör nedeniyle zor olabilir.
Burada, Cu (II) -peptid termodinamiğinin doğru bir şekilde ölçülmesi için sağlam bir deney seti sağlanmıştır. Bu makalede, Cu(II) üzerinde gerekli spektroskopik tutamağı sağlamak için kromoforik ligandların varlığında ve yokluğunda elektronik absorpsiyon spektroskopisinin kullanımı ve etiketsiz izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımı üzerinde durulmaktadır. Her iki deneysel teknikte de, tüm rakip dengeleri hesaba katacak bir süreç tanımlanmıştır. Bu makalenin odak noktası Cu(II) üzerinde olsa da, açıklanan deney seti Cu(II)-peptid etkileşimlerinin ötesine geçebilir ve fizyolojik olarak ilgili koşullar altında diğer metal-peptid sistemlerinin doğru bir şekilde ölçülmesi için bir çerçeve sağlayabilir.

Amaç, elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve ITC'nin tamamlayıcı tekniklerini kullanarak C-peptide bağlanan Cu (II) termodinamiğini ölçmek ve doğrulamaktı. Elektronik absorpsiyon spektroskopisinin sağlam doğası nedeniyle, Cu(II)'nin 300 μM C-peptide doğrudan titrasyonu gerçekleştirilmiştir (Şekil 1). 150 μM Cu(II) ilavesi, Cu(II)'nin d-d bandına atfedilen 600 nm'de bantta ani bir artışa neden oldu ve 300 μM Cu(II) eklenene kadar artmaya devam etti. 300 μM Cu(II)'nin...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores at JoVE.com

Quantifying the Binding Interactions Between CuII and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Bu makale, peptitlere ve proteinlere bağlanan Cu(II)'nin termodinamiğini araştırmak ve ölçmek için elektronik absorpsiyon spektroskopisi ve izotermal titrasyon kalorimetrisinin kullanımına odaklanmaktadır.

Kromoforların Varlığında ve Yokluğunda Cu(II) ve Peptit Kalıntıları Arasındaki Bağlanma Etkileşimlerinin Ölçülmesi

Copper(II) is an essential metal in biological systems, conferring unique chemical properties to the biomolecules with which it interacts. It has been ...

Bu yöntem, araştırmacının, her ikisi de daha standart uygulamalar kullanarak genellikle zor olan peptitler ve birinci sıra geçiş metal iyonları gibi sistemleri incelemek için zor prob yapmasına izin verecektir. Buradaki temel avantaj, ortogonal teknikler kullanmaktır, çünkü birbirlerini iyi tamamlarlar ve bu da sistem hakkında daha fazla fikir verebilir ve herhangi bir fenomeni kaçırmamamıza yardımcı olabilir. Bu videoda ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, diğer sistemleri incelemek için çok uygundur.Cu(II) ve bir peptit ile göstermemize rağmen, birçok farklı metal peptit ve metal protein etkileşimi için kullanılabilir. Bence en zor kısım, metal iyonunuz ve peptidiniz için iyi bir tampon seçeneği bulmak olacaktır. Daha önce başkaları tarafından hangi tamponların kullanıldığını görmek için literatüre başvururdum.Prosedürü gösteren, araştırma laboratuvarımda yüksek lisans öğrencisi olan Sohee Choi olacak. Başlamak için, elektronik absorpsiyon spektrofotometresini açın ve kullanımdan önce yaklaşık 15 ila 20 dakika ısınmasına izin verin. Ardından spektrofotometre yazılımını başlatın ve 200 ila 900 nanometre tarama aralığı, saniyede 200 nanometre tarama aralığı ve düzeltilmiş çift ışın tabanı gibi parametreleri yapılandırın.Ardından, ışın yollarında küvet veya numune içermeyen bir taban çizgisi toplayın. Çift ışınlı spektrofotometrede iki eşleşen küvet kullanarak, bir küvete 115 mikrolitre ultra saf su ve diğer küvete 115 mikrolitre peptit numunesi ile doldurun ve küvetlerde hava kabarcığı olmadığından emin olun, çünkü bunlar sinyale müdahale edecektir. Daha sonra, küveti referans ışınına ultra saf su ile ve numune ışınına peptidli küvet yerleştirin.Daha sonra metal içermeyen peptidin absorpsiyon spektrumunu toplayın. Peptit numunesi ile küvete Cu(II)solüsyonunun substokiyometrik miktarını ekleyin ve daha sonra analiz için hacmi kaydedin. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlerken çözeltiyi karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı borulayın.Beş dakika boyunca dengeledikten sonra küveti numune hücre tutucusuna geri koyun ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin. Ardından, çeşitli eşdeğerleri için peptit çözeltisine Cu (II) alikotlarının eklenmesini tekrarlayın ve küvete eklenen toplam Cu (II) hacmini kaydedin. Yazılımı daha önce iki eşleşen küvette açıklandığı gibi başlattıktan sonra, bir küvete 115 mikrolitre ultra saf su ve 115 mikrolitre bakır-fen kompleks çözeltisi içeren diğer küvet yükleyin.Küvetin referans kirişine su ile ve bakır-fen kompleks çözeltisi içeren küvetin numune kirişine yerleştirilmesini sağlayın. Daha sonra metal ligand kompleksinin absorpsiyon spektrumunu toplayın. Daha sonra, bakır-fen kompleks çözeltisine stokiyometrik miktarda peptit ekleyin ve herhangi bir hava kabarcığı sokmamaya dikkat ederken iyice karıştırmak için yavaşça yukarı ve aşağı borulayın.Daha sonra, dengeye ulaşmak için çözeltiyi beş dakika boyunca inkübe edin. Küveti numune hücre tutucusuna geri koyun ve absorpsiyon spektrumunu kaydedin. Daha sonra, çeşitli eşdeğerleri için bakır-fen kompleks çözeltisine peptid alikotlarının eklenmesini tekrarlayın ve seyreltilmiş konsantrasyonun belirlenebilmesi için eklenen peptid hacmini kaydedin.İlk önce ITC'yi açın ve cihazı çalıştırmak için ITC yazılımını başlatın. İlk başlatmadan sonra, büreti yeniden yerleştirin ve ekrandaki talimatları izleyin. Ardından büreti ve kapağı referans hücresinden çıkarın.Daha sonra, referans hücresinden herhangi bir suyu çıkarın ve 450 mikrolitre gazdan arındırılmış ultra saf su ile üç kez durulayın. Şırıngaya hava kabarcıkları sokmamaya dikkat ederek ultra saf suyu bir yükleme şırıngasının 450 mikrolitre işaretine yavaşça çekin. Ardından, yükleme şırıngasını alttan yaklaşık bir milimetre uzakta olana kadar referans hücresine yerleştirin ve yükleme şırıngasında 150 mikrolitre kalana kadar çözeltinin bir kısmını yavaşça enjekte edin.Daha sonra, hücre yüzeyindeki kabarcıkları yerinden çıkarmak için yükleme şırıngası pistonunu birkaç kez yaklaşık 25 mikrolitre yukarı ve aşağı doğru hareket ettirin. Ardından, piston yükleme şırıngası üzerindeki 100 mikrolitre işaretine ulaşana kadar yavaşça enjekte edin, böylece referans hücresine toplam 350 mikrolitre ultra saf su dağıtın ve referans hücre kapağını değiştirin. Numune hücresinden herhangi bir artık çözeltiyi çıkardıktan sonra, bir yükleme şırıngası kullanarak 450 mikrolitre 10 milimolar EDTA yükleyin ve EDTA eser metalleri bağlayacağı için eser metal iyonlarının çıkarılmasını sağlamak için 10 dakika bekletin.EDTA çözeltisini çıkardıktan sonra, yükleme şırıngasını bol miktarda ultra saf su ile iyice durulayın. Numune hücresini ultra saf suyla durulayarak ITC'yi üreticinin talimatlarına uygun olarak temizleyin. Numune hücresinden kalan suyu çıkarın ve ardından 450 mikrolitre tamponla en az üç kez durulayarak numune hücresini şartlandırın.Ardından, numune hücresini koşullandıran artık tamponu çıkarın ve yükleme şırıngasını kullanarak peptid çözeltisini numune hücresine yükleyin. Daha sonra önce pistonu çıkararak titrasyon şırıngasını 200 mikrolitre tamponlu çözelti ile durulayın. Bir mikro pipet kullanarak, tampon çözeltisini cam titrasyon şırıngasının üstündeki delikten şırıngadan geçirin ve aşağıdaki iğneyi çıkarın.Daha sonra, pistonu titrasyon şırıngasına tamamen yerleştirin. Ardından, titrasyon şırınga iğnesinin ucunu metal çözeltiye batırın ve pistonu yavaşça yukarı çekerek metal çözeltinin şırıngayı doldurmasına neden olarak titrasyon şırıngasının cam kısmının üstünde bir boşluk hacmi oluşmasına neden olun. Boşluk hacmini gidermek için titrasyon şırıngasını zemine paralel olarak döndürün.Ardından pistonu çıkarın ve cam kısmı hafifçe zemine doğru eğin. Titrasyonun şırıngasını nazikçe sallayın, böylece çözelti titrasyon şırıngasının cam kısmına taşınır ve boşluk hacminin çoğunu doldurur. Ancak iki ila üç mikrolitre boşluk hacminin kaldığından emin olun.Şırıngayı zemine paralel tutarken pistonu tekrar takın. Ardından titrasyon şırıngasını dik tutun ve iğnenin ucunu tekrar metal çözeltiye batırın. Ardından, iğneden hava çıkmayı bırakana kadar pistonu aşağı doğru itin ve iğnenin ucunu çözeltide tutarken pistonu yavaşça 50 mikrolitre işaretinin hemen üstüne çekerek titrasyon şırıngasını yükleyin.Titrasyon şırıngasının cam kısmını dikkatlice bürete yerleştirin ve parmağınızı sıkana kadar vidalayın. Daha sonra, hafif hizmet tipi hassas bir silecek kullanarak, iğnenin ucuna dokunmadan pistonun sıkıştırılması nedeniyle titrasyon şırıngasından çıkan çözeltiyi emer. Ardından, büreti bir titrasyon şırıngasıyla numune hücresine yerleştirin ve güvenli bir şekilde sabitleyin.ITC yazılımının parametrelerini ayarlamak için Enstrüman Kontrolü'nü seçin. Karıştırma hızını ve sıcaklığı ayarlayın. Daha sonra Deney Detayları altında, şırınga ve hücre konsantrasyonlarını milimolar birimler halinde girin.Ardından, Deneme Yöntemi bölümünde Artımlı Titrasyon'u seçin. Kurulum'a tıklayın ve 2.5 mikrolitrelik 20 enjeksiyon belirtin ve bağlanma olayını gözlemlemek için daha fazla çözünürlük gerekiyorsa, enjeksiyon sayısını artırın ve enjeksiyon başına hacmi azaltın. Daha sonra, her enjeksiyon arasındaki zaman aralığını girin, böylece sinyalin dengelenmesi ve taban çizgisine geri dönmesi için yeterince uzun, tipik olarak 300 saniye.Ardından, denemeyi başlatmak ve verilerin nereye kaydedileceğini belirtmek için Çalıştır düğmesini tıklayın. Cu(II)'nin titrasyonunun C-Peptit'e dönüştürülmesi gerçekleştirildi ve 150 mikromolar Cu(II) ilavesinin Cu(II)'nin d-d bandına atfedilen 600 nanometrede bantta anında bir artışa neden olduğunu ve 300 milimolar Cu(II) eklenene kadar artmaya devam ettiğini gösterdi. 300 mikromolar Cu(II)'nin üzerindeki ilave eklemeler, doygunluğu gösteren d-d yasağının emilimini arttırmadı ve Cu(II), 1: 1 kompleksinde C-Peptit'e bağlandı ve log K değeri altıdan fazlaydı.C-Peptit, yaklaşık 10 mikromolar bakır-fen kompleksine titre edildi ve 265 nanometrede yük transfer bandından emilim, C-Peptit'in fenantropin ligandından Cu (II) 'yi 7.4 ila 7.8 log K değeri ile şelatlayabildiğini gösteren azaldı. ITC termogramı, 15 milimolar MOPS tamponunda 1,4 milimolar Cu(II)'nin 154 mikromolar C-Peptit'e titrasyonunu gösterir. Bağlanma afinitesinin log K değerinin sekizde olduğu ve entalpi değişiminde mol başına 8 kilojoule olduğu bulunmuştur.Gibbs serbest enerjiyi mol başına eksi 46 kilojoule olarak ve entropide kelvin başına mol başına 120 joule olarak değişir. C-Peptit yokluğunda 15 milimolar MOPS tamponuna 1,4 milimolar Cu(II)'nin kontrollü titrasyonunun termogramda bağlanma göstermez. Her şeyin temiz olduğundan emin olmak söyleyebilirim.Önceki deneylerden kalan metal iyonları veya peptitler varsa, stokiyometriyi büyük ölçüde etkileyebilir ve bağlama deneylerinde bilinmeyen bir rekabet sağlayabilir. Dairesel dikroizm, metal peptid veya metal protein etkileşimlerini incelemek için başka bir yöntemdir, çünkü kiraliteye bakar. Kütle spektrometresi, kütledeki değişikliklere bakarak bu kompleksleri de sorgulayabilir.Bu teknik seti, peptitler veya proteinlerle etkileşime giren metal iyonlarını inceleyen birçok laboratuvar tarafından kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Quantifying the Binding Interactions Between Cu(II) and Peptide Residues in the Presence and Absence of Chromophores

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zaman çözülmesi elektro sprey iyonizasyon Hidrojen-döteryum Değişim Kütle Spektrometre Protein Yapısı ve Dinamikleri incelenmesi için

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Dört Biyosensör Platformları kullanma Yüksek yakınlık Antikor-antijen Cilt Kinetiklerinin Belirlenmesi

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

Peptid diziler HLA Alloantibodies Organ nakli olarak algılanması için kişiselleştirilmiş

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

A Direct Force Probe for Measuring Mechanical Integration Between the Nucleus and the Cytoskeleton

Çekirdek ve sitoiskeleti mekanik bütünleşmesi ölçmek için bir doğrudan kuvvet sonda

The mechanical properties of the nucleus determine its response to mechanical forces generated in cells. Because the nucleus is molecularly continuous ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...