Denne protokollen sammenligner amyloid-beta plakkbelastning i hele deler av interesse og underregioner av interesse for hjerneseksjoner fra APP / PS1 transgene mus. Metoden og resultatene som presenteres i denne spesielle protokollen vil gjøre det mulig for leserne eller forskerne å velge enten mellom hele interesseområdet eller underområdet av interesseanalyse for å bestemme en betabelastning i musehjerneseseksjoner. Last ned programvaren for bildeanalyse for å begynne.
Ved installasjon, start programvaren og klikk på filen, åpne og velg bildet som skal analyseres. Velg det rette verktøyet på programvareverktøylinjen, og tegn en rett linje langs lengden på skalalinjen. Klikk på analysen, og klikk deretter på de angitte skalafanene.
Klikk deretter på analysen, og mål deretter faner for å notere lengden eller avstanden til skalalinjen i piksler. I popup-vinduet angir du avstanden i piksler, den kjente avstanden til skalalinjen, og angir lengdeenheten som et mikrometer. Merk deretter av i den globale boksen for å bruke den nye skalainnstillingen på alle følgende bilder, hvis flere bilder behandles.
Klikk OK for å bruke innstillingene. Hvis du vil angi ønsket mål for området for inndelingen, går du til analysering, angir mål og velger område- og visningsetikettboksene. Kontroller at bildet som analyseres, er valgt under kategorien Omadresser til .
For enkel hippocampus eller cortex visualisering, gå til bildet og juster lysstyrke eller kontrast. Dra den maksimale glidebryteren gradvis til venstre for å øke vevsklarheten til hjerneområdene av interesse eller avkastning kan identifiseres. Bruk markeringsverktøyet for polygon eller frihånd til å skissere hippocampus-regionen.
Når regionen er skissert, klikker du på tilbakestillingsalternativet for lysstyrke- eller kontrastinnstillingene for å gå tilbake til den opprinnelige lysstyrken. For å måle det totale vevsområdet i det valgte området, klikk på redigeringen og fjern utenfor. Når det valgte området er det eneste bildet på skjermen, klikker du på analysen og måler deretter faner for å få det totale vevsområdet analysert i et popup-vindu.
Deretter lagrer du dataene i en Excel-fil. Hvis du vil måle det 6-E10 fargelagte positive området, går du til kategoriene for bilde, justering og fargeterskel i rekkefølge. Et forhåndsprodusert filter under terskelmetoden gir ønskede resultater som fremhever de sterkeste signalene i rødt.
Når du har valgt riktig terskel, kontrollerer du den mørke bakgrunnen for å utheve amyloid beta-flekkene på en svart bakgrunn. Klikk på det valgte, deretter original, og velg igjen, og gi de mørke signalene til amyloid betaavsetninger på hvit bakgrunn. Når popup-vinduet genererer, klikker du på fanen analyser og analyser partikler og treffer OK. Kopier sammendragsutdataene som genereres av programvaren ved å klikke på redigerings- og kopieringsknappene.
Lim deretter inn i den tidligere startede Excel-filen med respektive etiketter. Beregn det positive området 6E-10 prosent ved å bruke formelen Etter å ha lastet ned bildeanalyseprogramvaren, utfører du trinnene til hjernens avkastning kan identifiseres, som vist tidligere. Deretter velger du avkastningen i cortex eller hippocampus ved hjelp av rektangelverktøyet.
Klikk Rediger på verktøylinjen, velg og angi kategorien som endrer høyden og bredden til en forhåndsdefinert verdi. Juster boksen slik at den er helt dekket av vevet. Tilbakestill lysstyrken eller kontrasten til den opprinnelige lysstyrken.
Dupliser den valgte avkastningen ved å høyreklikke boksen og klikke på duplikatet. Et nytt vindu med det valgte området åpnes. Gi nytt navn til det dupliserte bildet for å vise området det ligger i.
Juster den dupliserte bildetypen ved hjelp av verktøylinjen og klikk på bildet, og skriv deretter inn 8-biters taster for å konvertere det dupliserte RGB-bildet til 8-biters, for best å analysere plakkene. Inverter bildet ved å klikke på rediger, og inverter deretter. Hvis du vil måle det positive området 6E-10, går du til bildet og justerer og justerer.
Et forhåndsdefinert filter under terskelmetoden vil gi ønskede resultater, og fremhever de sterkeste signalene i rødt. Når du har valgt riktig terskel, trykker du på apply. Hvis du vil analysere det positive området 6E-10, bruker du verktøylinjen og klikker kategoriene analyser og analyser partikler, slik at sammendragsresultatene kontrolleres.
Kopier sammendragsutdataene med prosentområdet ved å klikke kategoriene rediger og kopier . Lim deretter inn sammendragsutdataene i den tidligere startede Excel-filen med respektive etiketter. Gjenta prosedyren for de forskjellige områdene i vevet, og sørg for at plasseringen av hver boks for å skissere avkastningen er konsekvent mellom hvert bilde.
I denne representative vurderingen sammenlignes full- og sub-ROI-analysemetoder for å kvantifisere det 6E-10 positive området i cortex og hippocampus hjernevev. Den fullstendige avkastningen analysen innebærer å skissere hele avkastningen. Sub ROI-analyse innebærer derimot å velge et forhåndsdefinert område i avkastningen.
Den trinnvise prosedyren for fullstendig og sub ROI 6E-10 positiv område kvantifisering, med AVKASTNING rotasjon for sub ROI kvantifisering, er vist her. Sammenhengen mellom full- og sub-ROI-analysene er demonstrert her. En signifikant positiv korrelasjon ble observert mellom 6E-10 positivt område rapportert av de to leserne som utførte sub ROI-analysen for cortex og hippocampus.
Videre delte det gjennomsnittlige sub ROI 6E-10 positive området en sterk, betydelig positiv sammenheng med området oppnådd ved hjelp av full avkastning. For det gjennomsnittlige 6E-10 positive området med det fulle i sub ROI-analysene, ble det ikke observert noen signifikant forskjell i cortex og hippocampus. En signifikant korrelasjon ble observert mellom hele hjernen homogenat og løselig amyloid beta 1-42 målinger, av Eliza, og full avkastning analyse fra studien Terskelvalg er nøkkelen til å få nøyaktig data kvantifisering.
Brukermedvirkning er nødvendig for å sikre at de positive flekkene velges nøyaktig for med det valgte filteret. Bortsett fra amyloid beta kvantifisering, kan denne metoden brukes til andre fluorescerende immun-flekker. For eksempel Iba-1, fra mikroglial positiv område kvantifisering.
